Kullanımı kolay bir RNA pull-down protokolü, uzun kodlamayan bir RNA ile doğrudan RNA/RNA etkileşiminde bulunan RNA'ların tanımlanması için tasarlanmıştır. Protokol, yalnızca RNA/RNA etkileşimlerini çapraz bağlamak için bir fiksatif olarak psoralen'i kullanır ve RNA dizilimi ile birleştiğinde uzun kodlamayan bir RNA'nın tüm doğrudan RNA etkileşimini sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kodlamayan Uzun RNA ile Doğrudan RNA-RNA Etkileşiminde Bulunan RNA'ların Tanımlanması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Günümüzde fizyoloji ve patofizyolojide uzun kodlamayan RNA'lara (lncRNA) atfedilen artan rol, moleküler ortaklarını, DNA'larını, proteinlerini ve/veya RNA'larını tanımlayarak etkileşimlerini karakterize etmeyi çok önemli hale getirmektedir. İkincisi, proteinleri içeren ağlar aracılığıyla lncRNA ile etkileşime girebilir, ancak aynı zamanda doğrudan RNA/RNA etkileşimlerinde de bulunabilirler. Bu nedenle, yalnızca RNA/RNA etkileşimlerini çapraz bağlayan bir molekül olan psoralen kullanarak bir lncRNA ile doğrudan RNA/RNA etkileşimine giren RNA'ların tanımlanmasına izin veren, kullanımı kolay bir RNA aşağı çekme prosedürü geliştirdik. lncRNA ikincil yapısının biyoinformatik modellemesi, düşük bir iç baz eşleşmesi olasılığı gösteren bölgeler için güçlü bir afiniteye sahip birkaç spesifik antisens DNA oligonükleotid probunun seçilmesine izin verdi. Tasarlanan spesifik problar, lncRNA'nın uzunluğu boyunca erişilebilir bölgeleri hedeflediğinden, RNA-etkileşim bölgeleri lncRNA dizisinde tanımlanabilir. Yüksek verimli bir RNA dizilimi ile birleştiğinde, bu protokol, ilgilenilen bir lncRNA'nın tüm doğrudan RNA interaktom çalışmaları için kullanılabilir.
Giriş
Uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar), uzunluğu 200 nükleotidden daha uzun, protein kodlamayan transkriptlerdir. Sayıları giderek artıyor, insanlarda 58.000'den fazla. Ayrıca, fizyoloji ve patofizyolojideki önemli rolleri, düzenleyici işlevlerini yerine getirmelerine izin veren moleküler ortaklarını karakterize etmeyi gerekli kılar. Aslında, lncRNA'ların işlevlerini anlamak için bir yaklaşım, her bir lncRNA'nın etkileşimli moleküler ortaklarının saptanmasıdır.
lncRNA'ların moleküler hedefleri DNA, proteinler veya RNA'lar olabilir ve bunları tanımlamak için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bu bağlamda, lncRNA'larla etkileşime giren proteinlerin tanımlanması, lncRNA'ları spesifik olarak aşağı çekmek için ilgilenilen proteine karşı bir antikorun kullanıldığı farklı RNA-immünopresipitasyon (RIP) prosedürleri de dahil olmak üzere çeşitli protokollerin amacıdır (bir incelemeiçin 1). RNA Hedefleri2'nin Yakalama Hibridizasyon Analizi (CHART) veya RNA Saflaştırma3 ile Kromatin İzolasyonu (ChIRP) gibi diğer teknikler, lncRNA'ların ilişkili protein kompleksleri ile birlikte aşağı çekilmesine izin verir. Bu son tekniklerde, lncRNA yem olarak kullanılır. CHART ve ChIRP ayrıca lncRNA doluluğunu 2,3 gösteren genomik haritaları tanımlamak için güçlü tekniklerdir. Ek olarak, bu RNA aşağı çekme yöntemleri, bir lncRNA'nın RNA ortaklarını tanımlamayı mümkün kılar. Bir lncRNA tarafından hedeflenen RNA'ların yakalanmasına izin veren bir prosedür tanımlanmıştır. Antisens DNA biyotinile oligonükleotid probları, lncRNA ikincil yapısının4 biyoinformatik modellemesi ile belirlendiği gibi iç baz eşleşmesi olasılığının düşük olduğu bölgelere karşı tasarlanmıştır. Bununla birlikte, bu prosedür, RNA ortaklarının bir protein ağı aracılığıyla dolaylı olarak mı yoksa lncRNA ile doğrudan RNA/RNA etkileşimleri yoluyla mı etkileşime girdiğini ayırt etmez. Psoralen türevleri ile çapraz bağlamanın, baz eşleşmesininaracılık ettiği doğrudan RNA/RNA etkileşimlerini seçmek için tercih edilen yöntem olduğu gösterilmiştir 5. Psoralen türevleri gerçekten de çift sarmallı DNA veya RNA'ya ara katalama yapabilir ve UV ışığı (365 nm) ile ışınlamadan sonra pirimidinleri kovalent olarak bağlayabilir6. Biyotinile oligonükleotid probları kullanılarak RNA pull-down'ın psoralen ile çapraz bağlama ile birleştirilmesi, bir lncRNA ile doğrudan RNA/RNA etkileşimlerine giren RNA'ların tanımlanması için burada önerilen kullanımı kolay bir prosedürdür. Ayrıca, bu prosedür, lncRNA'nın uzunluğu boyunca tasarlanmış farklı oligonükleotid probları kullanılıyorsa, lncRNA dizisindeki RNA etkileşim bölgelerinin tanımlanmasına izin verebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Prob tasarımı
- Özel bir ücretsiz web sunucusu yazılımı kullanarak lncRNA'nın ikincil yapısını oluşturun: RNAstructure yazılımı7 veya Viyana RNA web paketi8. Düşük bir iç baz eşleşmesi olasılığı gösteren bölgeleri seçin ve bu lncRNA'nın farklı bölgeleri için 25 baz uzunluğunda antisens oligonükleotid probu tasarlayın.
- Bu problar hakkında farklı bilgiler elde etmek ve en iyi parametrelere sahip olanları seçmek için ücretsiz akademik yazılım olan AmplifX (https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr) ile tasarlanan tüm oligonükleotidleri kontrol edin.
NOT: Yazılımda en uygun parametreleri aşağıdaki gibi kontrol edin. GC yüzdesi: %40 ile %60 arasında, 3' kararlılık, karmaşıklık, kendi kendine uç dimer: "iyi". Erime sıcaklığı (TM) önemli değildir, çünkü afinite oda sıcaklığında gerçekleştirilir. - Bir hizalama arama aracı (yani, Blast, vb.) kullanarak, seçilen antisens oligonükleotid problarının, seçilen hücrelerde ifade edilen diğer herhangi bir RNA'daki nükleotid dizilerini tanımadığından emin olun.
- 25 baz uzunluğunda spesifik olmayan bir DNA oligonükleotid probu tasarlayın. Bu probun ne ilgilenilen lncRNA'ya ne de ilgilenilen genomdaki diğer RNA dizilerine bir afinite göstermediğinden emin olun.
- Tüm probları, bir trietilengliserol ara parçası (TEG) ile birlikte 3' uçlarına bir biyotin modifikasyonu eklenmiş olarak sipariş edin. Bu ara parça, sterik engeli önlemek için oligo-biyotin mesafesini arttırır.
NOT: En iyi sonucu elde etmek ve aşağı çekme sonuçlarının özgüllüğünü değerlendirmek için, aynı bölgede en az iki farklı antisens oligonükleotid probu tasarlayın ve ardından verimliliklerini deneysel olarak karşılaştırın.
2. Çapraz bağlama
- Hücreleri (örneğin, bu deneyde kullanılan GH4C1 hücreleri) 78,5cm2 hücre kültürü kaplarında birleşene kadar büyütün. Hücre kültürü ortamını çıkardıktan sonra, hücre tabakasını Ca2+ ve Mg2 + (PBS +) ile zenginleştirilmiş 5 mL soğuk fosfat tamponlu salin ile durulayın ve 0.1 mg / mL konsantrasyonda PBS + içinde hazırlanan 3 mL psoralen türevi molekül (4' Aminometiltriokssalen hidroklorür) çözeltisi ekleyin.
- Kültür plakasını 30 dakika boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 ile bir memeli hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. 30 dakika sonra kapağı çıkarın, kültür kaplarını 365 nm UV tüplerinden 2,5 cm uzakta bir UV çapraz bağlayıcıda 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Bulaşıkları hassas bir şekilde çalkalayın ve UV maruziyetini 10 dakika daha eski haline getirin.
- Ortamı aspirasyon ile atın, hücreleri bir hücre kazıyıcı ile toplamak için 1 mL PBS + ekleyin ve bir mikro tüpe aktarın. 4 ° C'de, 400 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Mümkün olduğu kadar çok süpernatanı çıkarın ve peletleri -80 °C'de stoklayın.
3. Hücre lizisi
- 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.0, 1 mM EDTA,% 0.5 SDS ve 5 μL / mL RNaz inhibitörü ekleyerek Proteinaz K tamponunu hazırlayın.
- Bu tampondaki hücre peletlerini yeniden süspanse edin (1 x 107 hücre başına yaklaşık 200 μL). Proteinaz K'yi 0.1 μg/μL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin ve 50 ° C'de 45 dakika inkübe edin. Daha sonra proteinaz K'yi inaktive etmek için 95 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
4. Sonikasyon
- Bu lizatın 100 μL'sini (5.106 hücreye karşılık gelir) iki mikro tüpe dağıtın ve 200 μL hibridizasyon tamponu (700 mM NaCl, 70 mM Tris-HCl, pH 7.0, 1 mM EDTA, %1.25 SDS, 5 μL/mL RNaz inhibitör çözeltisi ve %15 formamid) ekleyin.
- Tüpleri bir sonikatörün 4 °C su banyosuna yerleştirin ve sonikasyonu 30 s ile ayrılmış 2 seri 30 s darbe (yüksek yoğunluklu) ile başlatın.
- Giriş kontrol numuneleri olarak hizmet etmek için 20 μL numune toplayın ve -80 °C'de saklayın.
NOT: Bu sonikasyon prosedürü daha önce 2.000 nükleotid9 arasında değişen RNA fragmanları elde etmek için GH4C1 hücre hattı için optimize edilmiştir. Diğer hücre hatları için, sonikasyon prosedürü optimize edilmelidir. Bu teknik, çok uzun kodlamayan bir RNA'nın RNA ortaklarını incelemek için gerçekleştirildiğinde, sonikasyon adımının lncRNA'nın yeterli bir şekilde geri kazanılmasını sağlamak için vazgeçilmez olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, bu nedenle, lncRNA uzunluğu boyunca maksimum her 4.000 nükleotidde bir bulunan bir bağlanma bölgesine sahip birkaç prob tasarlamak gerekir. lncRNA'nın tam uzunluğunu kurtarmak için, birkaç spesifik probdan oluşan bir havuz kullanın. Bununla birlikte, amaç RNA-RNA bağlanmasında yer alan lncRNA bölgelerini tanımlamaksa, spesifik problar ayrı ayrı kullanılmalıdır. Ayrıca, daha küçük bir lncRNA'nın RNA ortaklarını inceliyorsanız, sonikasyon adımının gerekli olup olmadığını belirlemek için deneyler yapılmalıdır.
5. RNA aşağı çekme
- 1. Gün - Hibridizasyon adımı
- Her numune tüpüne 150 pmol (1.5 μL 100 μM stok çözeltisi) biyotinile edilmiş spesifik veya spesifik olmayan bir prob ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) (yaklaşık 30 rpm) bir tüp döndürücü üzerinde çalkalama altında 4 saat inkübe edin.
- Gerekli miktarda manyetik boncuk alın (yani, 150 pmol prob hibridizasyon reaksiyonu başına 40 μL boncuk). Boncukları ticari ortamlardan ayırmak için mıknatıs desteği kullanın. Süpernatanı atın ve boncukları 900 μL Hibridizasyon tamponu ile yıkayın. Tamamlandığında, manyetik boncukları Hibridizasyon tamponunun aynı hacminde yeniden askıya alın.
- Her numune tüpüne manyetik boncuklar ekleyin (150 pmol prob hibridizasyon reaksiyonu başına 40 μL boncuk). RT'de (yaklaşık 30 rpm) bir tüp döndürücü üzerinde çalkalama altında gece boyunca inkübe edin.
- 2. Gün - RNA izolasyon adımı
- Mıknatıs desteği kullanarak boncukları hücre lizatından ayırın (2-3 dk). Süpernatanı atın ve boncukları 900 μL Yıkama tamponu (% 0.5 SDS, 2x SSC) ile RT'de döndürücü üzerinde çalkalama altında 5 dakika inkübasyon ile yıkayın. Bu yıkamayı 5 kez tekrarlayın.
- Son yıkamayı çıkardıktan sonra boncukların üzerine 95 μL Proteinaz K tamponu ekleyin. Giriş numunelerinin buzunu çözün ve 75 μL Proteinaz K tamponu ekleyin. Tüm tüplerde (numuneler ve giriş numuneleri) 1 μg/μL'lik nihai konsantrasyona 5 μL proteinaz K ekleyin. 45 °C'de 45 dakika ve ardından 95 °C'de 10 dakika inkübe edin.
- Numuneyi buz üzerinde tutun. Süpernatantta bulunan RNA'lardan boncukları ayırmak için manyetik destek kullanın. RNA'ları, bir DNaz sindirim adımı içeren bir RNA saflaştırma kiti ile saflaştırın. Saflaştırılmış RNA'ları -80 °C'de saklayın.
NOT: Ayrıştırılmış RNA, zenginleştirilmiş transkriptleri tespit etmek için RT-qPCR veya yüksek verimli RNA dizilimine tabi tutulabilir. RNA dizileme analizi için, okumalar daha sonra STAR10 veya HISAT211 gibi ücretsiz yazılım kullanılarak ilgilenilen genomla hizalanabilir ve niceleme FeatureCounts12 veya HTSeq count13 kullanılarak yapılabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
lncRNA etkileşiminin, yani lncRNA'lar, proteinler, RNA ve DNA ile etkileşime giren hücresel bileşenlerin aydınlatılması, lncRNA'ların işlevlerini anlamak için kilit öneme sahiptir. lncRNA etkileşimini karakterize etmek için RIP, CHART, ChIRP ve RNA pull-down dahil olmak üzere çeşitli teknikler geliştirilmiştir. İkincisinin lncRNA'ların RNA hedeflerini belirlemede güçlü olduğu gösterilmiş olsa da, bu prosedürler RNA ortaklarının bir protein ağı aracılığıyla dolaylı olarak mı yoksa doğrudan RNA/RNA etkileşimleri yoluyla mı...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Çok sayıda lncRNA, işlevlerini mRNA'lara tamamlayıcı baz eşleşmesi yoluyla yerine getirir. Bu nedenle, lncRNA'ların doğrudan RNA etkileşimini karakterize etmeye izin veren prosedürler geliştirmek önemlidir. Bu nedenle, psoralen'in çapraz bağlama reaktifi olarak kullanımını RNA aşağı çekme tekniği ile birleştiren bir prosedür geliştirilmiştir.
Açıklanan RNA aşağı çekme protokolünde, antisens DNA biyotinile oligonükleotid problarının tasarımı ve seçimi, lncRNA i...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Aix-Marseille Üniversitesi ve Centre National Recherche Scientifique tarafından desteklenmiş ve Sandoz Laboratuvarları'ndan bir hibe ile finanse edilmiştir.
Açık erişim ücreti için finansman: Aix-Marseille Üniversitesi ve Centre National Recherche Scientifique
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 4 asal;-Aminometiltriokssalen hidroklorür | Sigma | A4330 | Çapraz bağlayıcı reaktifi |
| Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonikatör |
| Biyotillenmiş problar | IDT | Oligonükleotid probları | |
| CFX96 Gerçek Zamanlı Sistem | BioRad | 4351107 | qPCR aparatı |
| DNA Olignükleotidler | IDT | qPCR için astarlar | |
| Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Manyetik streptavidin boncukları |
| Formamid | Thermo-Fisher | 15515-026 | Formamid |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR reaktifi |
| Proteinaz K | Sigma | P2308 | Proteinaz K |
| RNA'dan DNA'ya | Thermo-Fisher | 4387405 | Ters transkripsiyon kiti |
| RNA XS saflaştırma kiti | Macherey-Nagel | 740902 | RNA saflaştırma kiti |
| RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse inhibitörü |
| Tüp Döndürücü | Stuart | SB2 | Eppendorf tüp döndürücü |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | # 400072 | UV çapraz bağlayıcı |
Kaynaklar
- Chen, L. -L., Zhao, J. C. functional analysis of long non-coding RNAs in development and disease. Systems Biology of RNA Binding Proteins. 825, 129-158 (2014).
- Simon, M. D. capture hybridization analysis of rna targets (CHART). Current Protocols in Molecular Biology. 101 (1), 2125(2013).
- Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP). Journal of Visualized Experiments. (61), e3912(2012).
- Torres, M., et al. RNA pull-down procedure to identify RNA targets of a long non-coding RNA. Journal of Visualized Experiments. (134), e57379(2018).
- Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of non-coding RNAs to nascent pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
- Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11 (1), 129(2010).
- Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA websuite. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 70-74 (2008).
- Jacq, A., et al. Direct RNA-RNA interaction between Neat1 and RNA targets, as a mechanism for RNAs paraspeckle retention. RNA Biology. , 1-12 (2021).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. FeatureCounts: An efficient general-purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).
- Fox, A. H., et al. Paraspeckles: a novel nuclear domain. Current Biology. 12 (1), 13-25 (2002).
- Torres, M., et al. Circadian RNA expression elicited by 3'-UTR IRAlu-paraspeckle associated elements. eLife. 5, 14837(2016).
- Jacq, A., et al. Direct RNA-RNA interaction between Neat1 and RNA targets, as a mechanism for RNAs paraspeckle retention. BioRxiv. , 354712(2020).
- Lu, Z., et al. Psoralen Analysis of RNA Interactions and Structures with High Throughput and Resolution. Methods in Molecular Biology. 1649, 59-84 (2018).
- Aw, J. G. A., Shen, Y., Nagarajan, N., Wan, Y. Mapping RNA-RNA interactions globally using biotinylated psoralen. Journal of Visualized Experiments. (123), e55255(2017).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
