Yetişkin farelerin dil epitelinden türetilen oral mukozal organoid kültürlerin oluşturulması ve karakterizasyonu için bir yöntem sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yetişkin farelerin dil epitelinden türetilen oral mukozal organoid kültürlerin oluşturulması ve karakterizasyonu için bir yöntem sunuyoruz.
Ağzımızın içini kaplayan mukoza astarı, ağız mukozası, oldukça bölümlere ayrılmış bir dokudur ve bukkal mukoza, diş eti, dudaklar, damak ve dil olarak alt bölümlere ayrılabilir. En üst tabakası olan oral epitel, yaşam boyunca yetişkin kök hücreler tarafından korunur. Yetişkin epitelyal kök hücrelerin proliferasyonu ve farklılaşması, in vivo fare modellerinin yanı sıra iki boyutlu (2D) besleyici hücre tabanlı in vitro modeller kullanılarak yoğun bir şekilde incelenmiştir. Bu yöntemlerin tamamlayıcısı, yetişkin kök hücrelerin hücre dışı matris (ECM) açısından zengin bir hidrojel içine gömüldüğü ve tanımlanmış bir büyüme faktörleri kokteyli içeren bir kültür ortamı ile sağlandığı organoid teknolojisidir. Bu koşullar altında, yetişkin kök hücreler çoğalır ve kendiliğinden organoidler olarak adlandırılan üç boyutlu (3D) hücre kümeleri oluşturur. Organoid kültürler ilk olarak murin ince bağırsak epitel kök hücrelerinden kurulmuştur. Bununla birlikte, yöntem o zamandan beri diğer epitelyal kök hücre tipleri için uyarlanmıştır. Burada, murin oral mukozal organoid kültürlerinin oluşturulması ve karakterizasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Birincil epitel hücreleri, murin dil dokusundan izole edilir, bir ECM hidrojeline gömülür ve aşağıdakileri içeren bir ortamda kültürlenir: epidermal büyüme faktörü (EGF), R-spondin ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) 10. İlk tohumlamadan sonraki 7 ila 14 gün içinde, elde edilen organoidler daha fazla genişleme ve kriyoprezervasyon için geçirilebilir. Ek olarak, 3D tam montajlı görüntüleme ve gen ekspresyon analizi yoluyla yerleşik organoid kültürlerin karakterizasyonu için stratejiler sunuyoruz. Bu protokol, oral epitelyal kök hücre davranışını ex vivo indirgemeci bir şekilde araştırmak için bir araç olarak hizmet edebilir.
Ağız mukozası, ağzımızın içini kaplayan mukoza astarıdır. Sindirim sisteminin girişi olarak işlev görür ve sindirim sürecinin başlatılmasında rol oynar 1,2. Ek olarak, ağız mukozası vücudumuzun dış çevreye karşı bariyeri olarak işlev görür ve fiziksel, kimyasal ve biyolojik hakaretlerden koruma sağlar1. İşlev ve histolojiye bağlı olarak, memelilerde oral mukoza üç tipe ayrılabilir: çiğneme mukozası (sert damak ve diş eti dahil), astar mukozası (yumuşak damağın yüzeyi, dilin ventral yüzeyi ve bukkal yüzey olarak işlev görür) ve özel mukoza (dilin dorsal ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Burada açıklanan tüm yöntemler, hayvan deneyleri ile ilgili Avrupa Birliği ve Alman mevzuatına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: Steril cerrahi aletler (ince forseps, ince makas ve neşterler) ve soğuk PBSO ile doldurulmuş Petri kapları dahil olmak üzere çalışma yerini hazırlayın. BME'yi gece boyunca çözdürün ve kullanıma kadar 4 °C'de veya buz üzerinde tutun. Hücre izolasyonuna başlamadan önce hücre kültürü plakalarını gece boyunca bir inkübatörde önceden ısıtın. Tüm malzemeler Malzeme Tablosunda verilmiştir.
1 Murin oral mukozal organoid kültürünün kurulması....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu protokol, dil epitelinin enzimatik bir kokteyl kullanılarak alttaki lamina propria ve kastan ayrılmasını tanımlar (Şekil 1). Ayrılan epitel ayrıca organoid üretimi için kullanılabilir ve farklı gen ve protein analizleri için hasat edilebilir. Benzer şekilde, sindirilmiş lamina propria ve kas tabakası tercih edilen prosedürler için kullanılabilir.
Organoid kültürler için, dil epiteli, tripsin çözeltisi kullanılarak küçük hücre kümelerine (yaklaşık 2-3 hücre) dah.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Doku sindirimi
Kollajenaz sindirimi, epitelin alttaki lamina propria ve kas dokusundan ayrılmasına yardımcı olur. Bu adım, birincil dokunun daha sonra oluşturulan oral mukozal organoidlerle daha iyi karşılaştırılmasını sağlar. Enzimlerle aşırı sindirim, yetişkin epitelyal kök hücrelerin organoid oluşturma kapasitesini etkilediğinden, kollajenaz inkübasyonunun 1 saatten fazla ve tripsin sindiriminin 30 dakikadan fazla yapılmamasını tavsiye ederiz. Kollajenaz sindirimi .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
K.K., organoid teknolojisi ile ilgili bekleyen bir patentin mucidi olarak adlandırıldı.
Yazarlar yardımları için Sabine Kranz'a teşekkür eder. Bu çalışmayı desteklediği için IZKF Würzburg'un Konfokal Mikroskopi ve Akış Sitometrisi Tabanlı Hücre Sınıflandırması Çekirdek Birimine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Alman Kanser Yardımı'ndan (IZKF/MSNZ Würzburg aracılığıyla K.K.'ye) bir hibe ile finanse edilmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Medya & Medya Bileşenleri | |||
| Advanced Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM)/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634-028 | |
| B27 Takviyesi | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| GlutaMAX-I (100x) | Thermo Fisher Scientific | 35050-038 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | |
| N-asetil-L-sistein | Sigma Aldrich | A9165 | |
| Nikotinamid | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Penisilin / Streptomisin & nbsp; | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm1 | |
| RSPO3-Fc füzyon proteini şartlandırılmış ortam | U-Protein Express BV | R001 | |
| Rekombinant insan EGF | Preprotech | AF-100-15 | |
| Rekombinant insan FGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
| ROCK (Rho kinaz) inhibitörü Y-27632 dihidroklorür | Hö lzel Biotech | M1817 | |
| Antikorlar < / güçlü > | |||
| Keratin-14 Poliklonal Antikor 100 & mikro; l | Biozol | BLD-905301 | |
| E-Cadherin Antikoru | Bio-Techne | AF748 | |
| Saflaştırılmış Fare Anti-Ki-67 Klon B56 (0.1 mg) | BD Bioscience | 556003 | |
| ALEXA FLUOR 594 Eşek Anti Fare | Thermo Fisher Scientific | A21203 | |
| ALEXA FLUOR 647 Eşek Anti Tavşan | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
| ALEXA FLUOR 488 Eşek Anti Keçi | Thermo Fisher Scientific | A110555< | |
| güçlü>Reaktifler / Kimyasallar< / güçlü> | |||
| BME Tip 2, RGF Cultrex Pathclear | Bio-Techne | 3533-005-02 | |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Sigma Aldrich | 34943-1L-M | |
| Kollajenaz A | Roche | 10103578001 | |
| Donkey Serum | Sigma Aldrich | S30-100ML | |
| Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 100-100-15 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | 221465-25G | |
| Etanol, denatüre (%96) | Carl Roth | T171.3 | |
| Formalin Çözeltisi, nötr tamponlu, %10 | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| TritonX-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| Ara-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| TrypLE Express Enzim (1 kez;), fenol kırmızısı | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | |
| Ksilen | Sigma Aldrich | 534056-500ML | |
| güçlü > Ekipman ve Diğerleri< / güçlü > | |||
| Hücre kültürü 12 Kuyulu Çok Kuyulu Plakalar | Greiner BioOne | 392-0047 | |
| Hücre Süzgeci: 100 ve mikro; m | VWR | 732-2759 | |
| Kapak Fişleri | VWR | 631-1569P | |
| Cam Alt Mikroplakalar VE=10 4580 | Corning | 13539050 | |
| Objektif Slaytlar: Superfrost Plus | VWR | 631-0108P |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu makale yayımlandı
Video yakında