Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Bu protokolün amacı, kardiyak doku mühendisliği, ilaç taraması ve hastalık modelleme uygulamaları için biyomimetik, kollajen bazlı bir hidrojel içinde kardiyak fibroblastlar (KF’ ler) ile birlikte kültürlenmiş kök hücre türevi kardiyomiyositlerden oluşan, yüksek hizalanmış insan kardiyak dokusunun üç boyutlu (3D) mikroakışkan modelinin gelişimini açıklamak ve göstermektir.

Abstract

Dünya çapında önde gelen ölüm nedeni kardiyovasküler hastalık (CVD) olarak devam etmektedir. Bununla birlikte, kalp kasının fizyolojik ve biyolojik karmaşıklığını modellemek, miyokard, in vitro yapmak oldukça zordur. Esas olarak, engeller, yetişkin olan veya yetişkin benzeri fenotipler sergileyen ve miyokard’ın hücresel karmaşıklığını ve karmaşık 3D mimarisini başarıyla çoğaltabilen insan kardiyomiyositlerine (CD) ihtiyaç duymaktadır. Ne yazık ki, etik kaygılar ve mevcut birincil hasta kaynaklı insan kardiyak dokusunun eksikliği nedeniyle, CD’lerin minimum çoğalması ile birlikte, uygulanabilir insan CD’lerinin tedariki kardiyak doku mühendisliği için sınırlayıcı bir adım olmuştur. Bu amaçla, çoğu araştırma insan INDÜKLENEN pluripotent kök hücrelerin (hiPSC’ ler) kardiyak farklılaşmasına doğru insan CD’lerinin birincil kaynağı olarak geçiş yapmış ve bu da hiPSC-CM’lerin kardiyak doku modellemesi için in vitro tahliller içinde geniş bir şekilde birleştirilmesiyle sonuçlanmıştır.

Burada, bu çalışmada, mikroakışkan bir cihaz içinde 3D olgun kök hücre türevi insan kardiyak dokusu geliştirmek için bir protokol gösteriyoruz. HiPSC türevli CD’lerden çip üzerinde 3D in vitro anizotropik kardiyak doku modelinin üretimini özellikle açıklıyor ve görsel olarak gösteriyoruz. Öncelikle CD’ler için seçilecek bir arınma protokolü, CD’lerin insan CF’leri (hCF’ ler) ile karıştırılması yoluyla tanımlanmış bir orana sahip hücrelerin ortak kültürü ve kollajen bazlı hidrojel içinde bu ortak kültürün askıya alınması. Hücre yüklü hidrojelin, çevredeki hücrelerin ve hidrojel matrisinin yüksek derecede hizalanmasına neden olmak için yüzey topografyası görevi gören kademeli eliptik mikro direklerle gömülü, iyi tanımlanmış mikroakışkan cihazımız içine enjeksiyonunu da gösteriyoruz, yerel miyokard mimarisini taklit ediyoruz. Önerilen 3D anizotropik kardiyak doku çip üzerinde modelin temel biyoloji çalışmaları, hastalık modellemesi ve tarama aracı olarak kullanılması yoluyla farmasötik testler için uygun olduğunu öngörüyoruz.

Introduction

Doku mühendisliği yaklaşımları, son yıllarda rejeneratif tıp ve hastalık modellemesinde in vivo klinik bulgulara eşlik etmek için yaygın olarak araştırılmaktadır^1,2. Özellikle in vitro kardiyak doku modellemesine, insan primer kardiyak dokusunun tedarik edilmesi ve fizyolojik olarak ilgili in vitro taşıyıcıların üretilmesindeki doğal zorluklar nedeniyle önemli öneme sahiptir, kardiyovasküler hastalıkların karmaşık mekanizmalarının temel anlayışını sınırlamıştır (CVD’ler)^1,3. Geleneksel modeller genellikle 2D monolayer kültür tahlillerini içermektedir. Bununla birlikte, miyokard hem de karmaşık hücresel etkileşimlerin hem doğal manzarasını taklit etmek için 3D bir ortamda kardiyak hücrelerin kült haline getirildiğinin önemi kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir^4,5. Ek olarak, şimdiye kadar üretilen çoğu model, kök hücrelerden farklılaştırılmış bir CD mono-kültürünü içermektedir. Bununla birlikte, kalp karmaşık bir 3D mimari⁷içinde birden fazla hücre tipi⁶ ‘dan oluşur , yerel miyokardın hücresel bileşenlerini daha iyi taklit etmek için 3D in vitro modellerde doku bileşiminin karmaşıklığını artırmak için kritik ihtiyacı garanti eder.

Bugüne kadar, miyokard^8’inbiyomimetik 3D modellerini üretmek için birçok farklı yaklaşım araştırıldı. Bu yaklaşımlar, üretilen kuvvetin gerçek zamanlı olarak hesaplanmasına izin veren deneysel kurulumlardan, ince filmlerde tohumlanan mono-kültür^{CD’lerinden}(kas ince filmler (MTF’ler) 9 ,serbest duran kantileterler arasında askıya alınan 3D hidrojel matrislerdeki ortak kültür kardiyak hücrelere (mühendislik kalp dokuları (EHT’ler)¹⁰. Diğer yaklaşımlar, bir doku yamasında çıkıntılı mikro direkler arasında asılı olan 3D hidrojeldeki mono-kültür CD’lerinden girintili mikrogroovlar arasında tohumlanan mono-kültür^CD’lerinekadar miyokardsal anizotropiyi taklit etmek için mikromolding tekniklerinin uygulanmasına odaklanmıştır^12,13. Bu yöntemlerin her birinin doğal avantajları ve dezavantajları vardır, bu nedenle, amaçlanan uygulama ve ilgili biyolojik soru ile uyumlu tekniği kullanmak önemlidir.

Kök hücre türevi CD’lerin olgunlaşmasını artırma yeteneği, yetişkin benzeri miyokard dokusunun başarılı in vitro mühendisliği ve sonraki bulguların klinik yorumlara çevrilebilmesi için gereklidir. Bu amaçla, CD’leri olgunlaştıran yöntemler hem 2D hem de 3D^{14 , 15,16}. Örneğin, EHT’lere dahil edilen elektriksel stimülasyon, CD’lerin yüzey topografyası ile zorla hizalanması, sinyal ipuçları, ortak kültürden büyüme faktörleri ve/veya 3D hidrojel koşulları vb.

Bu modellerden, mikroakışkan platformları kullanan yaklaşımlar, gradyanların kontrolü, sınırlı hücre girişi ve minimum gerekli reaktifler gibi doğada belirli avantajları korur. Ayrıca, birçok biyolojik çoğaltma mikroakışkan platformlar kullanılarak aynı anda üretilebilir, bu da biyolojik ilgi mekanizmasını daha iyi parçalamaya ve deneysel örnek boyutunu istatistiksel güç lehine artırmaya hizmet eder^17,18,19. Ek olarak, mikroakışkan cihaz imalat sürecinde fotolitikografinin kullanılması, doku yenilenmesi ve hastalık modellemesinde farklı uygulamalar için 18 ,^{20 , 21,22} hücresel yapısını ve makro düzeyde doku mimarisini geliştirmek için mezoskopik ipuçları görevi gören mikro ve nano düzeyde hassas özelliklerin (örneğin topografyalar) oluşturulmasını sağlar.

Daha önce, hidrojel kapsüllenmiş birlikte kültürlü kardiyak hücreleri birbirine bağlı, anizotropik bir dokuya hizalamak için doğuştan eliptik mikropostlar şeklinde yüzey topografyasını içeren yeni bir 3D kardiyak doku çip üzerinde modelin gelişimini gösterdik²⁰. 14 günlük kültürden sonra, mikroakışkan cihaz içinde oluşan dokular, monolayer ve 3D izotropik kontrollere kıyasla fenotiplerinde, gen ekspresyon profillerinde, kalsiyum işleme özelliklerinde ve farmasötik yanıtlarında daha olgundur²³. Burada açıklanan protokol, hiPSC türevli CD’ler kullanarak mikroakışkan cihaz içinde bu 3D birlikte kültürlü, hizalanmış (yani anizotropik) insan kalp dokusunu oluşturma yöntemini özetlemektedir. Özellikle, hiPSC’leri CD’lere göre ayırt etme ve arındırma yöntemlerini, yerleşik bir ortak kültür popülasyonu üretmek için HBC’lerin CD’lerle takviyesini, kollajen hidrojel içinde kapsüllenmiş hücre popülasyonunun mikroakışkan cihazlara yerleştirilmesini ve daha sonra 3D inşa edilen dokuların kontrtil ve immünofluoresan tahliller yoluyla analizini açıklıyoruz. Elde edilen 3D mühendislik mikro dokuları, temel biyoloji çalışmaları, CVD modellemesi ve farmasötik testler de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için uygundur.

Protocol

Biyogüvenlik Kabini içinde tüm hücre işleme ve reaktif hazırlamayı gerçekleştirin. Hücrelerle temas eden tüm yüzeylerin, malzemelerin ve ekipmanların steril olduğundan emin olun (yani% 70 etanol ile püskürtün). Hücreler nemlendirilmiş 37 °C, %5 CO2 inkübatörde kültürlenmelidir. Tüm hiPSC kültürü ve farklılaşması 6 kuyulu plakalarda gerçekleştirilir. 1. Mikroakışkan cihaz oluşturma (yaklaşık süre: 1 hafta) FotolithografiNOT: CAD dosyası kullanılarak tasarlanan maske (Ek Dosya 1olarak sağlanır), mikroakışkan kanalın tasarımını içerir. Tasarımı şeffaf bir maskeye yazdırın. Ardından, negatif fotoresist SU8 2075 ile standart fotolithografiyi temiz bir oda içinde 4 inç silikon gofret üzerinde gerçekleştirin. Silikon gofretleri izopropil alkol (IPA) ile temizleyin ve azotla kurutun. Dehidrasyon için 200 °C’de 5 dakika pişirin.NOT: Gofret cımbızla gofret alın. Gofreti spin-coater’a yerleştirin. Gofretin ortasına 3-4 mL SU8 yatırın, ardından 200 μm’lik bir katman oluşturmak için döndürün (yani, 15 s’den 500 rpm’ye kadar rampa, 10 s için spin, 5 s’den 1.200 rpm’ye kadar rampa ve 30 s için döndürün, sonra durana kadar 15 sn için aşağı doğru). Gofret ve yumuşak pişirmeyi 65 °C’de 7 dakika, ardından 95 °C’de 45 dakika çıkarın. Gofret’i bir maske hizalayıcısına taşıyın ve şeffaf maskeyi UV filtreli maske tutucusuna yerleştirin. Gofret 2 döngüye maruz 230 mJ/cm2, 30 s gecikme ile, toplam 460 mJ/cm2maruz kalma için. Maruz kalan gofret üzerinde bir gece boyunca 50 °C fırında maruz kalma sonrası fırınlayın. Ertesi sabah fırını kapatın ve gofret oda sıcaklığına soğuduktan sonra SU8 geliştiricisine batırın. Gofret’i her 5 dakikada bir geliştiriciden çıkarın ve IPA ile yıkayın, ardından geliştiriciye geri yerleştirin. Yaklaşık 20 dakika sonra veya IPA temizlendiğinde, gofret hava nitrojeni ile kurulayın ve 150 ° C’ye ayarlanmış bir fırında sert pişirin; fırın 150 °C’ye ulaşır ulaşmaz kapatın, ancak açmayın. Gofreti oda sıcaklığına ulaşana kadar fırında bırakın, sonra gofreti çıkarın. Profilometre ile SU8’in yüksekliğini ve hafif mikroskopla optik özellikleri onaylayın. Onaylandıktan sonra, gofret 150 mm plastik Petri kabının içine bantlayın. Yumuşak litografiNOT: PDMS’nin SU8 özelliklerine yapışmasını önlemek için Petri kabına bantlanmış gofretin silanize edilmesi gerekir. Gofret (plastik bir Petri kabına dokunmuş) 0,4 mL metiltrikhlorosilane (MTCS) içeren aynı boyuttaki bir cam Petri kabının üzerine ters çevirin ve gofretleri 4 dakika boyunca buharlara maruz bırakın. Gofreti dik çevirin ve kapağı Petri kabına yerleştirin. Kürleme maddesine 30 g silikon elastomer tabanını 10:1 oranında karıştırın. Petri kabının kapağını alın ve polidimetilsiloksanı (PDMS) gofretin üzerine dökün, ardından bir kurutucu içinde gaz giderin. Tüm kabarcıklar gittikten sonra, PDMS’yi iyileştirmek için gofretleri 1,5 saat boyunca 80 °C’ye yerleştirin. PDMS’yi dikkatlice soyun ve doku bağlantı noktaları ve ortam kanalları için giriş ve çıkışları sırasıyla 1 mm ve 1,5 mm biyopsi zımba ile delme. Tozu temizlemek için PDMS kanallarını bantla temizleyin. Ardından, kapakları (18 x 18 mm, No.1) en az 15 dakika boyunca% 70 etanolde bekletin. Sonra bunları mendille kurulayın. Hem kapak kapaklarını hem de PDMS kanallarını (özellik tarafı açıkta) plazmaya (yüksek ayar) 1 dakika boyunca maruz bırakın, ardından hızlı bir şekilde birbirine bağlanın ve bağı sabitlemek için gece boyunca 80 °C’lik bir fırına yerleştirin.NOT: Yapıştırma sırasında, kanalın çökmesini önlemek için kanalın kendisinden kaçınırken PDMS ile cam arasında iyi bir sızdırmazlık sağlamak için PDMS kanallarının kenarlarına hafif basınç uygulamak önemlidir. Cihaz hazırlama Bağlı PDMS cihazlarını deiyonize suya (DI H2O) batırın ve sıvı döngüsü ile otoklavlayın. Daha sonra, sıvıyı cihazlardan epire edin ve yerçekimi döngüsü ile tekrar otoklavlayın. Daha sonra sterilize edilmiş cihazları 80 °C’de bir gecede susuz bırakın. 2. Kök hücre kültürü (yaklaşık süre: 1-2 ay) hiPSC kültür ve bakımıNOT: HiPSC’lerin kriyoprezervasyon veya farklılaşmadan önce in vitro çözdükten sonra ardışık üç pasaj için kültürlenmesi gerekir. hiPSC’ler, hücre hattına bağlı olarak, bodrum membran matrisi kaplı plakalar24üzerinde E8 veya mTeSR1 ortamında kültürlenir. Plakaları hESC kalitesinde bodrum membran matrisi ile kaplamak için, matris ortamının bir aliquotunu (lota bağlı hacim, genellikle 200-300 μL; -80 °C’de saklanır) buz üzerinde 25 mL DMEM/F-12K’ya ekleyerek çözün. Bu süspansiyonun 1 mL’lik kısmını 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna dağıtın. Plakayı en az 1 saat boyunca 37 °C’de inkübatörde bırakın. Çözdükten sonra, 5 μM Y-27632 25 (E8+RI) ekleyerek hiPSC kültürü için E8 medyasını değiştirin. Daha sonra bu ortamı 24 saat kullanın, sonra medyayı yeni E8 olarak değiştirin.NOT: Rutin medya değişiklikleri için hiPSC kültürü için değiştirilmemiş E8 ortamı kullanılır. Düzenli bakım için, E8 ortam her gün, önceki medya değişikliğinden yaklaşık 24 saat sonra değiştirilmelidir. 3. gün veya 4. günde pasaj hücreleri, medyayı aspire edin, ardından her birini 1x Dulbecco’nun fosfat tamponlu çözeltisinin (DPBS) 1 mL’si ile yıkayın.NOT: Hücrelerin civarında birleştiğine emin olun. % 70’in üzerinde bir izdiahçılıkla büyümelerine izin vermeyin. DPBS’yi aspire edin, ardından her kuyuya 0,5 mM EDTA’nın 1 mL’lik kısmını ekleyin ve oda sıcaklığında 6-7 dakika kuluçkaya yatırın. EDTA’yı dikkatlice epire edin, her kuyuya 1 mL E8 + RI ekleyin ve 1 mL pipetle yüzeye doğru patlatın (tüm hücreleri toplamak için ~ 5-10 kez). Hücre süspansiyonu 15 mL mikrosantrifüj tüpünde toplayın. E8+RI’da hücre süspansiyonu ve geçişini istediğiniz hücre yoğunluğunda (yani kuyu başına ~200 K) sayın. Ortamı 24 saat sonra E8 (RI olmadan) olarak değiştirin. Hücreleri RI ile 24 saatten fazla bırakmayın.NOT: E8 37 °C’ye ısıtılmamalıdır. Hücre kültüründen önce ısınmak için her zaman oda sıcaklığında bırakın. Kardiyomiyosit (CM) yönlendirilmiş farklılaşmaNOT: HiPSC26,27’ninfarklı çizgileri arasında heterojenliğin varlığına dikkat etmekönemlidir,bu nedenle aşağıdaki adımların her hücre hattı için optimize edilmesi gerekebilir. CM farklılaşması için aşağıdaki adımları izleyin. RPMI + B27 – insülini 500 mL RPMI 1640’a 10 mL B27 eksi insülin ve 5 mL penisilin/streptomisilin (kalem/strep) ekleyerek hazırlayın. 500 mL RPMI 1640’a 10 mL B27 ve 5 mL kalem/strep ekleyerek RPMI + B27 + insülin hazırlayın. Glikozsuz 500 mL RPMI 1640’a 10 mL B27, 5 mL kalem/strep ve 4 mM sodyum laktat ekleyerek RPMI eksi glikoz + B27 + insülin hazırlayın. HiPSC’ler% 85 izdiah süresine ulaştığında, eski ortamı RPMI + B27’nin 4 mL’si ile değiştirerek farklılaşmaya başlayın (Gün 0) – 10 μM CHIR99021 içeren insülin ortamı 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna (yani, 25 mL RPMI + B27 içine 10 mM CHIR99021 25 μL ekleyin – insülin ve hemen kuyu başına 4 mL ekleyin).NOT: CHIR99021 bir GSK inhibitörüdür ve Wnt aktivasyonuna yol açar. CHIR99021 ve ilk izdiah konsantrasyonu her hücre satırı28için değişir. Farklılaşmayı başlatmak için en uygun koşulları belirlemek için gerçek deneyden önce her zaman 6-12 μM CHIR99021 konsantrasyon gradyanını ve bir dizi tohumlama yoğunluğunu kontrol edin. Tam olarak 24 saat sonra (Gün 1), ortamı aspire edin ve 5 mL önceden ısıtılan RPMI + B27 ile değiştirin – her kuyuya insülin. CHIR99021 ilavesinden tam 72 saat sonra (Gün 3), harcanan ortamın 6 kuyulu plakanın her kuyusundan 2,5 mL toplayın ve bir tüpte harcanan ortamın toplam 15 mL’si toplayın. Buna, 15 mL taze RPMI + B27 – insülin ortamı ekleyin. IWP2’yi birleşik orta boruya 5 μM konsantrasyona ekleyin (yani, 1 mL’de 1 μL IWP2, 1 mL kombine orta veya 30 μL IWP2 toplam mL ortama). Plakanın kuyusu başına kalan ortamın ~1,5 mL’lik kısmını çıkarın, böylece ortamın 1 mL’si kalır. Hücre kalıntılarının yeterli şekilde giderilmesini sağlamak için plakayı kuvvetlice döndürün. Ardından, eski ortamın geri kalanını epire edin ve plakanın kuyusu başına IWP2 içeren birleşik ortamın 5 mL’sini ekleyin.NOT: Hücrelere IWP2 eklenmesi Wnt inhibisyona yol açar. 5. Günde, ortamı her kuyudan epire edin ve 5 mL önceden ısıtılan RPMI + B27 – insülin ile değiştirin. CM Olgunlaşma: 7. Gün, 9. gün ve 11. Bu günlerde spontan dayak gözlenmelidir. CM Saflaştırma: 13. gün ve 16. gün, her kuyudan ortamı aspire ederek, her birini 1 mL 1x DPBS ile yıkayarak ve daha sonra 4 mM sodyum laktat ile desteklenmiş 5 mL önceden uyarılmış RPMI eksi glikoz + B27 + insülin ekleyerek glikoz açlığı başlatın. 19. Günde, harcanan ortamı aspire edin ve saflaştırmadan sonra hücre iyileşmesine izin vermek için her kuyuya 5 mL önceden ısıtilmiş RPMI + B27 + insülin ile değiştirin. 21. Günde, aşağıda açıklanan CM ayrışma protokolünü (adım 3.3) izleyerek hücreleri yeniden plakalayın. 6 kuyulu bir plakada kuyu başına1,5-2 x 10 6 hücreyi kaplamayı hedefleyin. Örneğin, oldukça verimli bir farklılaşma ise, genellikle 6 kuyuyu 9 kuyuya genişletmek iyidir. 21. günden itibaren, ortamı her kuyudan epire edin ve her 2-3 günde bir 4 mL RPMI + B27 + insülin ile değiştirin.NOT: HiPSC-CM’ler 23. 3. Mikroakışkan cihaz içinde 3D kalp dokusunun oluşturulması: (Yaklaşık süre: 2-3 saat) hCF kültürü Fibroblast Growth Media-3’te (FGM3) T75 şişelerinde (şişe başına 250K hücrede) kültür insan ventrikül kardiyak fibroblastları (hCF’ler; ticari olarak Lonza’dan elde edilir). Medyayı iki günde bir değiştirin ve ‘inde birleştiğinde geçiş yap. 10. geçitten önce hCF’leri kullanın, çünkü yüksek pasajlarda miyofibroblastlara farklılaşmaya başlayabilirler29. hCF ayrışması HCF’leri ayrıştırmak için önce şişeyi inkübatörden çıkar. Şişeyi biyogüvenlik kabininin içine koyun ve harcanan ortamı şişeden aspire etmeye başlayın. Ardından, T75 şişesini 3 mL 1x DPBS ile yıkayın. Kapağı kapatın ve şişeyi döndürün. DPBS’ye talip olarak. 3 mL önceden ısıtılan 1x Trypsin-EDTA alın (%0,05) ve mataraya ekleyin. Matarayı eğin ve altını kaplamak için döndürün. Yuvarlak hücre şekli ve yüzen hücrelerde kanıt olduğu gibi, hücrelerin ayrılmasını sağlamak için şişeyi mikroskop altında kontrol ederek 4-6 dakika boyunca 37 °C inkübatörde bırakın. Değilse, şişeyi bir dakika daha inkübatöre geri koyun. Şişeye 3 mL önceden ısıtilmiş FGM3 ekleyerek tripsin eylemini nötralize edin. Ardından, CF’leri yerinden çıkarmak için çözeltiyi şişenin altına doğru yukarı ve aşağı borun. Hücre süspansiyonu 15 mL mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Hücre süspansiyonunun 10 μL’sini alın ve hücreleri mikroskopla saymak için bir hemositometrede dağıtın. Hücre süspansiyonu 4 dakika boyunca 200 x g’da santrifüj. Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ürkerek üstadın aspire. İstediğiniz 75 x 106 hücre/mL yapmak için peletin taze FGM3’te yeniden süzülür. Bir kısmı (T75 şişesi başına 250K hücre) geçirin veya 3D kalp dokusu oluşturmak için aşağıdaki protokolü izleyin. CM ayrışmasıNOT: Farklılaşma ve saflaştırmadan sonra, MIKRO’ları mikroakışkan cihazlara enjeksiyonda kullanılmak üzere hazırlayın. CD plakasını inkübatörden çıkar ve medyayı aspire et. Daha sonra kuyuları 6 kuyulu bir plakanın kuyusu başına 1 mL 1x DPBS ile yıkayın. Kuyu başına 6 mL DPBS ve pipet 1 mL alın. DPBS’yi plakaya bağlı hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek epire edin. Pipet 6 mL sıcak hücre müfreze çözeltisi (örneğin, TrypLE ekspres) ve kuyu başına 1 mL ekleyin. Hücreleri 37 °C inkübatörde 10 dakika kuluçkaya yatırın. Enzimi eşit hacimde RPMI + B27+ insülin (yani kuyu başına 1 mL) ile nötralize edin ve 1 mL pipet ile kültür damarına karşı yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücreleri mekanik olarak ayırın. CD’leri 15 mL santrifüj tüpünde toplayın. 3 dakika boyunca 300 x g’da santrifüj. Üst sıraları aspire edin. Hücre peletini 5 mL RPMI + B27 + insülin olarak yeniden sunun. Uygun karıştırmayı sağlamak için çözeltiyi 1 mL pipetle yukarı ve aşağı pipetlayın. Hücre süspansiyonunun 10 μL’sini alın ve toplam hücre sayısını belirlemek için bir hemositometrede dağıtın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 x g’da tekrar santrifüjlayın (TrypLE’nin tamamen çıkarılmasını sağlamak için) ve süpernatantı aspire edin. Ardından, 75 x 106 hücre / mL elde etmek için uygun bir RPMI + B27 + insülin hacmi ekleyin.NOT: Kardiyak farklılaşma/seleksiyon, cTnT gibi CM’ye özgü proteinler için immünostainleme veya akış sitometrisi yoluyla kanıtlanan yüksek CM% (yani% >80) ile sonuçlanmazsa, hücreleri doku oluşumu için uygun görmeyin. Bu, CHIR99021 konsantrasyonlarının ve ilk başlangıç yoğunluğunun ayarlanmasıyla gerçekleştiğinde farklılaşma süreci optimize edilmelidir. CM saflaştırmanın iyileştirilmesi gerekiyorsa, floresan etkin hücre sıralama (FACS) veya manyetik olarak etkinleştirilmiş hücre sıralama (MACS) 30,31,32ileCD’leriçin sıralama gibi başka yöntemler de kullanılabilir. Kollajen hazırlamaNOT: Kollajen stoğunun yüksek konsantrasyonundan (8-11 mg/ mL arasında değişen) kollajen hazırlayın. Hücreyi oluşturmak için kullanılan kolajen:hidrojel karışımı 6 mg / mL’dedir ve son konsantrasyon 2 mg / mL’dir. Enjekte edilecek cihaz sayısına bağlı olarak, yapılacak kollajen çözeltisinin hacminin geri hesaplanması gerekir. Gerekli tüm reaktifleri bir biyogüvenlik başlığının içindeki buzun üzerinde tutun.NOT: Kollajen termoresponif bir hidrojeldir. Bu nedenle, erken polimerizasyonu önlemek için sıcaklığın düşük kalması gerekir. 75 μL stok kolajen (8 mg/ mL) alın ve buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde dağıtın. Kollajen çözeltisi çok viskozdur, bu yüzden yavaşça bir pipetle aspire edin. 13,85 μL ortam (örneğin, RPMI + B27 + insülin) alın ve aynı tüpte dağıtın. Daha sonra 10 μL fenol kırmızısı alın ve karışıma ekleyin ve yeniden ıslatın. Son olarak, 1.15 μL 1N NaOH alın ve süspansiyona ekleyin. 200 μL pipet ucu kullanarak süspansiyonu yeniden dirildi.NOT: Stok kolajen, kardiyak hücreleri kapsüllemek için kullanmadan önce nötralize etmek için NaOH eklenmesini gerektiren asidik bir pH’a sahiptir. Fenol kırmızısı bir pH göstergesi olarak işlev görür; bu nedenle, bunu NaOH eklemesinden önce ekleyin. Bu noktada, kollajen çözeltisi asitliğini gösteren sarı olacaktır. NaOH’un eklenmesinden sonra, çözelti nötralizasyonunu gösteren açık pembeye turuncuya dönmelidir. Hidrojel karışımı ve hücre hazırlamaNOT: Bu adımda kollajen bazlı hidrojel içindeki hücrelerin kapsüllenmesi yapılır. Hücreler ve tüm hidrojel öncüller, sonraki adımlar sırasında buza yerleştirilmelidir. Bu noktada, CF’ler henüz denenmemişse, CM süspansiyonu 15 mL santrifüj tüpünde, kapağı 37 °C inkübatör içinde gaz akışına izin vermek için sökülmüş olarak saklayın. Buna paralel olarak, CF’leri ayrıştırın ve cihaz yüklemesi için 75 x 106 hücre/mL yoğunlukta toplayın. Askıya alınan CD’leri 4:1 oranında CD’lerle karıştırın. 8 μL CD’lik bir aliquot alın ve buz üzerinde taze bir santrifüj tüpüne ekleyin. Daha sonra 2 μL CF alın ve santrifüj tüpündeki hücre süspansiyonu ekleyin. Hücre süspansiyonu yeniden haline getir, hücre süspansiyonunun 5.6 μL’sini al ve yeni bir mikrosantrifüj tüpüne koy. Yukarıdaki adımlarda yeni hazırlanan kolajenden 4 μL alın ve 4:1 CM:CF karışımına ekleyin. 2.4 μL Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) bodrum membran matrisi ekleyin, bu da son hücre yoğunluğunu cihaz enjeksiyonu için 35 x10 6 hücre / mL olarak hale getirin. Hücre süspansiyonun homojen olduğundan emin olmak için karışımı yukarı ve aşağı pipetleyin. Aygıt eklemeNOT: Hücre:hidrojel karışımı hazırlandıktan sonra cihazlara yerleştirilmesi gerekir. Otomatik kapatılmış mikroakışkan cihazları 80 °C fırından alın ve steriliteyi korurken cihazların oda sıcaklığına soğumasını sağlamak için hücre süspansiyonu takılmadan önce en az 1 saat boyunca Biyogüvenlik Kabini’ne yerleştirin. Cihazları 60 x 15 mm Petri kabına, bulaşık başına 3-4 cihaza yerleştirin. 60 x 15 mm Petri tabaklarından 3’üni tutmak için 150 x 15 mm Petri kabını ince bir tabaka DI H2O ile doldurun. Bu adım, mikroakışkan aygıtları çevreleyen nemli bir ortam oluşturur. Yeni bir uç kullanın ve tüp buzda kalırken süspansiyonu pipetleyarak hücreyi:hidrojel karışımını iyice yeniden kullanın. Ucu cihazın enjeksiyon portuna yerleştirin ve 20 μL pipet ucu kullanarak mikroakışkan bir cihazın doku bölgesi girişine yavaşça ve istikrarlı bir şekilde hücrenin 3 μL’lik bir süspansiyonunu enjekte edin: hidrojel süspansiyon. Bağlantı noktası doldurulduktan sonra enjeksiyonu durdurun ve ucunu çıkarın. Tüm cihazlar veya hazırlanan hidrojel süspansiyonun tamamı için tekrarlayın.NOT: Hücrenin küçük hacmi:hidrojel süspansiyon çok hızlı bir şekilde ısınır /soğur, bu nedenle süspansiyonun mümkün olduğunca uzun süre buzda tutulması uygun olur. Yerleştirirken, çözeltiyi buzdan pipetlayın ve hidrojel pipet ucunda polimerize olmaya başlayabileceğinden, cihazlara mümkün olduğunca çabuk yerleştirin. Hücrenin küçük hacimlerini oluşturmak önemlidir:bir seferde hidrojel süspansiyon, bu nedenle birçok cihaz enjekte edilecekse, cell:hydrogel süspansiyonu her 4 cihaz kümesi için taze hale getirilmelidir. Petri tabaklarındaki cihazları cımbızla çevirin ve su ile büyük Petri kabının içine yerleştirin. Hidrojel polimerizasyon için 9 dakika boyunca 37 °C’lik bir inkübatörde kuluçkaya yatın. Cihazları inkübatörden çıkar, cihazları dik çevir ve hidrojel polimerizasyonunu tamamlamak için 9 dakika boyunca 37 °C’de kuluçkaya yat. Yan medya kanallarına RPMI + B27 + insülin enjekte edin (cihaz başına ~ 20 μL). Cihazları 37 °C’de inkübatöre geri yerleştirin. Her gün taze RPMI + B27 + insülin ile medya kanallarındaki medyayı değiştirin. Cihazların 14-21 gün20.NOT: Çip başına az miktarda ortam nedeniyle, ortamın buharlaşmasını önlemek için, cihazların nemlendirilmiş bir oda görevi gören DI H2O ile dolu büyük bir Petri kabı içinde tutulması önemlidir. Ek olarak, rutin ortam değişiklikleri sırasında kanal girişlerinin/çıkışlarının üstüne fazla RPMI + B27 + insülin damlacıkları pipetlenebilir. 4. Doku analizi Canlı GörüntülemeNOT: Tüm canlı görüntüleme, 37 °C ve% 5 CO2’yikorumak için bir sahne inkübatörü ile yapılmalıdır. Cihazları çevre kontrollü bir sahne inkübatörüne yerleştirin. Maksimum kare hızında her cihazda birden fazla noktanın 30 s videolarını kaydedin. Dayama sinyallerini çıkardıktan sonra doku kontraktizitesini değerlendirmek için, tepeleri ayıklamak için tamamlayıcı özel yazılı MATLAB kodunu kullanın (Tamamlayıcı Dosya 2) çapraz vuruş aralığı değişkenliğini hesaplamak için. Hücre kültürü başlığındaki cihazlardaki ortamları değiştirin, sonra hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. İmmünofluoresan boyama PBS-Glisini Hazırlayın: PBS’de 100 mM glisini çözün ve uzun süreli depolama için% 0,02 NaN3 ekleyin. pH’ı 7,4’e ayarlayın. PBS-Tween-20’yi hazırlayın: PBS’ye %0,05 Ara-20 ekleyin ve uzun süreli depolama için%0,02 NaN 3 ekleyin. pH’ı 7,4’e ayarlayın. IF arabelleği hazırlayın: PBS’ye %0,2 Triton X-100, %0,1 BSA ve %0,05 Ara-20 ekleyin ve uzun süreli depolama için %0,02 NaN3 ekleyin. pH’ı 7,4’e ayarlayın. Keçi serumu hazırlayın: 0 keçi serumu yapmak için 2 mL PBS’de liyofilize keçi serumu yeniden dürt. Daha sonra% 10 keçi serumu yapmak için 2 mL’yi 18 mL PBS ile seyreltin. Doku kanallarına %4 paraformaldehit (PFA) ekleyerek ve 20 dakika boyunca 37 °C’de kuluçkaya yatırarak örnekleri düzeltin. Oda sıcaklığında 10 dk kuluçka için 2x doku kanallarına PBS-Glisin ekleyerek hücreleri yıkayın. Pbs -Tween-20’yi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ekleyerek hücreleri yıkayın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca doku kanallarına IF tamponu ekleyerek hücrelerin dengesini bozun. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca doku kanallarına keçi serumu çözeltisi ekleyerek hücreleri tıkayın. Konjuge olmayan birincil antikorları istenen konsantrasyonlarda % 10 keçi serumunda seyreltin (Ek Dosya 3’ebakın), doku kanallarına ekleyin ve numuneleri bir gecede 4 °C’de kuluçkaya bırakın. Ertesi gün, oda sıcaklığında her biri 20 dakika boyunca 3x doku kanallarına PBS-Tween-20 ekleyerek numuneleri yıkayın.NOT: 4.2.12. PBS-Tween-20’deki ikincil antikorları istenen konsantrasyonlarda seyreltin, herhangi bir çökelti toplamak için 10 dakika boyunca 10.000 x g’da santrifüjleyin, ardından doku kanallarına ekleyin. 30 dakika-1 saat sonra, numuneleri PBS-Tween-20 3x ile oda sıcaklığında her biri 10 dakika boyunca yıkayın. Doku kanallarına solmaya karşı veya istenen montaj ortamını ekleyin. Daha sonra, daha yüksek büyütme isteniyorsa, numuneler floresan mikroskopisi kullanılarak veya konfokal mikroskopla görüntülenebilir. Tüm 3D dokuyu görselleştirmek için, farklı z düzlemleri ndeki görüntüler, temsili 3D görüntüler oluşturmak için istiflenebilir ve yeniden oluşturulabilir.

Representative Results

HiPSC’lerden son derece saflaştırılmış bir CD popülasyonu elde etmek için, Lian farklılaşma protokolü33 ve Tohyama arıtma adımları34’ün bir kombinasyonunu içeren değiştirilmiş bir sürüm kullanılır (deneysel zaman çizelgesi için Şekil 1A’ya bakın). HiPSC’lerin koloni benzeri, ~% 85 birleştiği ve cm farklılaşmasının başlangıcında, geçişten 3-4 gün sonra kültür kuyusuna eşit olarak yayılması gerekir (<str…

Discussion

Gelişmiş hücre-hücre etkileşimleri ve biyomimetik 3D yapıya sahip bir in vitro insan kardiyak doku modelinin oluşturulması temel kardiyovasküler araştırmalar ve buna karşılık gelen klinik uygulamalar için zorunludur¹. Bu özetlenmiş protokol, bir kollajen hidrojel içinde kapsüllenmiş bağ CD’leri ile kök hücre türevi CD’lerin ortak kültürünü kullanarak, yerel miyokardın karmaşık hücre bileşimini ve yapısını modellemeye hizmet eden bir mikroakışkan cihaz…

Materials

0.65 mL centrifuge tubes	VWR	87003-290
1 mm Biopsy punch	VWR	95039-090
1.5 mm Biopsy punch	VWR	95039-088
15 mL Falcon tubes	VWR	89039-670
18x18mm coverslips	VWR	16004-308	The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging
4% paraformaldehyde	ThermoFisher	101176-014
6-well flat botttom tissue-culture plates	VWR	82050-844
B27 minus insulin	LifeTech	A1895602
B27 plus insulin	LifeTech	17504001
CHIR99021	VWR	10188-030
Collagen I, rat tail	Corning	47747-218
DMEM F12	ThermoFisher	11330057
DPBS	ThermoFisher	21600069
E8	ThermoFisher	A1517001	can also be made in house
EDTA	VWR	45001-122
Ethanol
FGM3	VWR	10172-048
GFR-Matrigel	VWR	47743-718
Glycine	Sigma	G8898-500G
Goat serum	VWR	10152-212
hESC-Matrigel	Corning	BD354277
IPA
IWP2	Sigma	I0536-5MG
Kimwipes	VWR	82003-820
MTCS	Sigma	440299-1L
NaN3	Sigma	S2002-25G
NaOH	Sigma	S5881-500G
Pen/Strep	VWR	15140122
Petri dish (150x15mm)	VWR	25384-326
Petri dish (60x15mm)	VWR	25384-092
Phenol Red	Sigma	P3532-5G
RPMI 1640	ThermoFisher	MT10040CM
RPMI 1640 minus glucose	VWR	45001-110
Silicon Wafers (100mm)	University Wafer	1196
Sodium lactate	Sigma	L4263-100ML
SU8 2075	Microchem	Y111074 0500L1GL
SU8 Developer	ThermoFisher	NC9901158
Sylgard Elastomer	Essex Brownell	DC-184-1.1
T75 flasks	VWR	82050-856
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
TrypLE	ThermoFisher	12604021
Trypsin-EDTA (0.5%)	ThermoFisher	15400054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Y-27632	Stem Cell Technologies	72304
EVG620 Aligner	EVG
Plasma cleaner PDC-32G	Harrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscope	Nikon
Leica SP8 Confocal microscope	Leica