Yöntem makalesi

Mikroakışkan Bir Platformda 3D Organize İnsan Kardiyak Dokusu Geliştirme

DOI:

10.3791/62539

⸱

15 Haziran 2021

 , 
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University, 2Biodesign Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, kardiyak doku mühendisliği, ilaç taraması ve hastalık modelleme uygulamaları için biyomimetik, kollajen bazlı bir hidrojel içinde kardiyak fibroblastlar (KF' ler) ile birlikte kültürlenmiş kök hücre türevi kardiyomiyositlerden oluşan, yüksek hizalanmış insan kardiyak dokusunun üç boyutlu (3D) mikroakışkan modelinin gelişimini açıklamak ve göstermektir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dünya çapında önde gelen ölüm nedeni kardiyovasküler hastalık (CVD) olarak devam etmektedir. Bununla birlikte, kalp kasının fizyolojik ve biyolojik karmaşıklığını modellemek, miyokard, in vitro yapmak oldukça zordur. Esas olarak, engeller, yetişkin olan veya yetişkin benzeri fenotipler sergileyen ve miyokard'ın hücresel karmaşıklığını ve karmaşık 3D mimarisini başarıyla çoğaltabilen insan kardiyomiyositlerine (CD) ihtiyaç duymaktadır. Ne yazık ki, etik kaygılar ve mevcut birincil hasta kaynaklı insan kardiyak dokusunun eksikliği nedeniyle, CD'lerin minimum çoğalması ile birlikte, uygulanabilir insan CD'lerinin tedariki kardiyak doku mühendisliği için sınırlayıcı bir adım olmuştur. Bu amaçla, çoğu araştırma insan INDÜKLENEN pluripotent kök hücrelerin (hiPSC' ler) kardiyak farklılaşmasına doğru insan CD'lerinin birincil kaynağı olarak geçiş yapmış ve bu da hiPSC-CM'lerin kardiyak doku modellemesi için in vitro tahliller içinde geniş bir şekilde birleştirilmesiyle sonuçlanmıştır.

Burada, bu çalışmada, mikroakışkan bir cihaz içinde 3D olgun kök hücre türevi insan kardiyak dokusu geliştirmek için bir protokol gösteriyoruz. HiPSC türevli CD'lerden çip üzerinde 3D in vitro anizotropik kardiyak doku modelinin üretimini özellikle açıklıyor ve görsel olarak gösteriyoruz. Öncelikle CD'ler için seçilecek bir arınma protokolü, CD'lerin insan CF'leri (hCF' ler) ile karıştırılması yoluyla tanımlanmış bir orana sahip hücrelerin ortak kültürü ve kollajen bazlı hidrojel içinde bu ortak kültürün askıya alınması. Hücre yüklü hidrojelin, çevredeki hücrelerin ve hidrojel matrisinin yüksek derecede hizalanmasına neden olmak için yüzey topografyası görevi gören kademeli eliptik mikro direklerle gömülü, iyi tanımlanmış mikroakışkan cihazımız içine enjeksiyonunu da gösteriyoruz, yerel miyokard mimarisini taklit ediyoruz. Önerilen 3D anizotropik kardiyak doku çip üzerinde modelin temel biyoloji çalışmaları, hastalık modellemesi ve tarama aracı olarak kullanılması yoluyla farmasötik testler için uygun olduğunu öngörüyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku mühendisliği yaklaşımları, son yıllarda rejeneratif tıp ve hastalık modellemesinde in vivo klinik bulgulara eşlik etmek için yaygın olarak araştırılmaktadır1,2. Özellikle in vitro kardiyak doku modellemesine, insan primer kardiyak dokusunun tedarik edilmesi ve fizyolojik olarak ilgili in vitro taşıyıcıların üretilmesindeki doğal zorluklar nedeniyle önemli öneme sahiptir, kardiyovasküler hastalıkların karmaşık mekanizmalarının temel anlayışını sınırlamıştır (CVD'ler)1,3. Geleneksel modeller genellikle 2D monolayer kültür ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyogüvenlik Kabini içinde tüm hücre işleme ve reaktif hazırlamayı gerçekleştirin. Hücrelerle temas eden tüm yüzeylerin, malzemelerin ve ekipmanların steril olduğundan emin olun (yani% 70 etanol ile püskürtün). Hücreler nemlendirilmiş 37 °C, %5 CO2 inkübatörde kültürlenmelidir. Tüm hiPSC kültürü ve farklılaşması 6 kuyulu plakalarda gerçekleştirilir.

1. Mikroakışkan cihaz oluşturma (yaklaşık süre: 1 hafta)

  1. Fotolithografi
    NOT: CAD dosyası kullanılarak tasarlanan maske (Ek Dosya 1olarak sağlanır), mikroakışkan kanalın tasarımını içerir. Tasarımı şeffaf bir maskeye yazdırın. Ardından, n....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HiPSC'lerden son derece saflaştırılmış bir CD popülasyonu elde etmek için, Lian farklılaşma protokolü33 ve Tohyama arıtma adımları34'ün bir kombinasyonunu içeren değiştirilmiş bir sürüm kullanılır (deneysel zaman çizelgesi için Şekil 1A'ya bakın). HiPSC'lerin koloni benzeri, ~% 85 birleştiği ve cm farklılaşmasının başlangıcında, geçişten 3-4 gün sonra kültür kuyusuna eşit olarak yayılması gerekir (Şekil 1B). Özelli.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelişmiş hücre-hücre etkileşimleri ve biyomimetik 3D yapıya sahip bir in vitro insan kardiyak doku modelinin oluşturulması temel kardiyovasküler araştırmalar ve buna karşılık gelen klinik uygulamalar için zorunludur1. Bu özetlenmiş protokol, bir kollajen hidrojel içinde kapsüllenmiş bağ CD'leri ile kök hücre türevi CD'lerin ortak kültürünü kullanarak, yerel miyokardın karmaşık hücre bileşimini ve yapısını modellemeye hizmet eden bir mikroakışkan cihaz içinde 3D insan anizotropik kardiyak .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu proje için finansman kaynakları sağlayan NSF CAREER Award #1653193, Arizona Biyomedikal Araştırma Komisyonu (ABRC) Yeni Araştırmacı Ödülü'ne (ADHS18-198872) ve Flinn Vakfı Ödülü'ne teşekkür ederiz. SCVI20 hiPSC hattı, NIH R24 HL117756 tarafından finanse edilen Stanford Kardiyovasküler Enstitüsü'nde doktoralı Joseph C. Wu'dan alınmıştır. HiPSC hattı, IMR90-4, WiCell Araştırma Enstitüsü55,56'dan elde edildi.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,65 mL santrifüj tüpleriVWR87003-290
1 mm Biyopsi zımbasıVWR95039-090
1,5 mm Biyopsi zımbasıVWR95039-088
15 mL Falcon tüpleriVWR89039-670
18x18mm lamellerVWR16004-308Yüksek büyütmeli görüntülemeye
izin vermek için lameller No.1 olmalıdır% 4 paraformaldehitThermoFisher101176-014
6 oyuklu düz bottom doku kültürü plakalarıVWR82050-844
B27 eksi insülinLifeTechA1895602
B27 artı insülinLifeTech17504001
CHIR99021VWR10188-030
Kollajen I, sıçan kuyruğuCorning47747-218
DMEM F12ThermoFisher11330057
DPBSThermoFisher21600069
E8ThermoFisherA1517001evde de yapılabilir
EDTAVWR45001-122
Etanol
FGM3VWR10172-048
GFR-MatrigelVWR47743-718
GlisinSigmaG8898-500G
Keçi serumuVWR10152-212
hESC-MatrigelCorningBD354277
IPA
IWP2SigmaI0536-5MG
KimwipesVWR82003-820
MTCSSigma440299-1L
NaN3SigmaS2002-25G
NaOHSigmaS5881-500G
Kalem/StrepVWR15140122
Petri kabı (150x15mm)VWR25384-326
Petri kabı (60x15mm)VWR25384-092
Fenol KırmızıSigmaP3532-5G
RPMI 1640ThermoFisherMT10040CM
RPMI 1640 eksi glikozVWR45001-110
Silikon Gofret (100mm)Üniversite Gofret1196
Sodyum laktatSigmaL4263-100ML
SU8 2075MicrochemY111074 0500L1GL
SU8 GeliştiriciThermoFisherNC9901158
Sylgard ElastomerEssex BrownellDC-184-1.1
T75 şişeleriVWR82050-856
Triton X-100SigmaT8787-100ML
TrypLEThermoFisher12604021
Tripsin-EDTA (%0,5)ThermoFisher15400054
Tween20SigmaP9416-50ML
Y-27632Kök Hücre Teknolojileri72304
EVG620 HizalayıcıEVG
Plazma temizleyici PDC-32GHarrick Plazma
Zeiss AxioObserver Z1 mikroskobuNikon
Leica SP8 Konfokal mikroskopLeica

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
  2. Patino-Guerrero, A., Veldhuizen, J., Zhu, W., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimen....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

3D Kalp DokusuKalp Dokusu M hendisli ind klenmi Pluripotent K k H crelerKardiyomiyosit Diferansiyasyonuip st Kalp DokusuKollajen Hidrojel Enkaps lasyonuH cre HizalanmasKardiyak Fibroblast Ko K lt rDoku Polimerizasyonu

İlgili makaleler