Method Article

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

DOI:

10.3791/62544

⸱

August 7th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada bakterilerde RIBO-seq için numune toplama ve hazırlama aşamalarını açıklıyoruz. Bu yönergelere göre hazırlanan kütüphanelerin sıraya dizilimi, kapsamlı biyoinformatik analiz için yeterli veri ile sonuçlanır. Sunduğumuz protokol basittir, standart laboratuvar ekipmanlarını kullanır ve lizizden kütüphanelerin eldeine kadar yedi gün sürer.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ribozom profilleme tekniği (RIBO-seq) şu anda protein sentezi sürecini incelemek için en etkili araçtır in vivo. Bu yöntemin avantajı, diğer yaklaşımlara kıyasla, bir mRNA transkriptinde ribozomların konumunu ve sayısını tam olarak haritalayarak çeviriyi izleme yeteneğidir.

Bu yazıda, bakterilerde RIBO-seq yöntemi için numune toplama ve hazırlamanın ardışık aşamalarını açıklar, deneyin planlanması ve yürütülmesi ile ilgili ayrıntıları vurgularız.

RIBO-seq bozulmamış ribozomlara ve ilgili mRNA'lara dayandığından, anahtar adım çevirinin hızlı inhibisyonu ve hücrelerin yeterli parçalanmasıdır. Bu nedenle, bakterilerde çeviriyi tutuklamak için kloramfenikol ile isteğe bağlı bir ön işlemle hücre hasadı için sıvı nitrojende filtrasyon ve flaş dondurma öneriyoruz. Parçalanma için, hücre duvarını mekanik olarak bozmak için alüminyum oksit varlığında donmuş hücrelerin harç ve pestle ile öğütülmeyi öneriyoruz. Bu protokolde, monozomlu saflaştırma için sakkaroz yastığı veya sakkaroz gradyan ultrasantrifüj gereklidir. Bunun yerine poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) kullanılarak mRNA ayrımı ve ardından ribozomal ayak izi eksizyonu (28-30 nt bandı) uygulanır ve tatmin edici sonuçlar sağlar. Bu, yöntemi büyük ölçüde basitleştirir ve prosedür için zaman ve ekipman gereksinimlerini azaltır. Kütüphane hazırlığı için, New England Biolabs'tan Illumina dizilimi için piyasada bulunan küçük RNA kitini kullanmanızı öneririz, üreticinin yönergelerini bir dereceye kadar optimizasyonla takip edin.

Elde edilen cDNA kitaplıkları, yeni nesil sıralama (NGS) için gereken uygun miktar ve kaliteyi sunar. Açıklanan protokole göre hazırlanan kütüphanelerin sıraya dizilimi, kapsamlı biyoinformatik analiz için yeterli veri sağlayan örnek başına 2 ila 10 mln benzersiz haritalı okuma ile sonuçlanır. Sunduğumuz protokol hızlı ve nispeten kolaydır ve standart laboratuvar ekipmanları ile gerçekleştirilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ribozom profilleme tekniği (RIBO-seq), Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco1'dekiJonathan Weissman'ın laboratuvarında geliştirilmiştir. Ribo-seq, gen ekspresyonunu çeviri düzeyinde incelemek için kullanılan diğer yöntemlere kıyasla, mRNA'ya her ribozom bağlamasına odaklanır ve konumu ve transkriptteki ribozomların göreceli sayısı hakkında bilgi sağlar. Protein sentezi sürecinin in vivo olarak izlenmesini sağlar ve hem bireysel mRNA'da hem de hücredeki tüm transkriptom boyunca ribozom yoğunluğunun ölçülmesine izin veren tek kodon çözünürlüğü ve doğruluğu sağlayabilir. RIBO-seq tekniğinin temelinde, çeviri sırasında ribozomların mRNA ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Örnek toplama

  1. Bakteri kültürü hazırlayın. Örnek başına 100 mL'lik bir kültür hacmi öneriyoruz.
  2. Numune toplama için ekipman ve reaktifler hazırlayın: numune başına iki kepçe, steril 0,45 μm karışık selüloz esterleri membran (MCE) filtreleri, 50 mL steril tüpler, sıvı azot, %70 (vol/vol) etanolde 50 mg/mL kloramfenikol (isteğe bağlı). Sıvı azot buharlaşmasına izin vermek ve kapalı tüplerin patlamasını önlemek için 50 mL tüplerin kapağını delin. Scoopulas'ı laboratuvar deterjanı ve% 70 etanol ile arındır.
  3. Filtreleme ekipmanı ve kepçelerden birini bakteri kültürünün büyüme sıcaklığına önceden ısıtır.
    NOT: Huni, fritrasyon tabanı, zemin ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan örnek sonuçlar, WT Bacillus subtilis hücrelerinin sporulating çeviri düzenlemesini inceleyen bir çalışmada elde edilmiştir. Gecekültürleri, 100 mL zengin ortamda 0,1'e eşit OD 600'e seyreltildi ve OD600 0,5-0,6'ya ulaşana kadar kuvvetli sarsıntı ile 37 °C'de kuluçkaya yatırıldı. Zengin ortam daha sonra sporülasyon sürecini teşvik etmek için minimum ortamla değiştirildi ve kuluçka dört saate kadar devam etti. Hücreler her saat T0 ile başlayarak hasat edildi - sporülasyon indük.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ribozom profillemenin temel teknik zorluğu, belirli bir fizyolojik ilgi durumunda mRNA'larda ribozomların bir anlık görüntüsünü yakalamak için çeviriyi hızla engelleme ihtiyacıdır. Bunu başarmak için, çeviri inhibitörleri, sıvı nitrojende hızlı hasat ve flaş dondurma yaygın olarak kullanılır. Antibiyotik uygulamak isteğe bağlıdır, çünkü eserlere neden olabilirler. Kloramfenikol, bakteriyel RIBO-seq'te uzun ribozomları tutuklamak için yaygın olarak kullanılan bir ilaçtır. Bununla birlikte, başlatmayı engellemez, çeviri ba.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ALS, EMBO Kurulum Hibeleri IG 3914 ve POIR'in finansal desteğini kabul etmek istiyor. 04.04.00-00-3E9C/17-00 Avrupa Birliği tarafından Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu kapsamında ortaklaşa finanse edilen Polonya Bilim Vakfı'nın Birinci TAKIM programı dahilinde gerçekleştirildi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10X TBE (toz)InvitrogenAM9864
2-Merkaptoetanol, %99, safAcros Organics125472500
Adenozin 5'-Trifosfat (ATP)New England BiolabsP0756S
Alüminyum oksit kalsine saf paChempur114560600
Kalsiyum klorür dihidratSigma-AldrichC3881-500G
KloramfenikolMP Biyomedikaller190321
DNA Temiz ve Yoğunlaştırıcı -5Zymo ResearchD4004
Dnase I rekombinant, Rnaz içermeyenRoche4716728001
EDTA disodyum tuzuFisher ScientificE/P140/48
Etil Alkol Absolut %99,8  Pure-PA-BasicPOCH Avantor Performans Malzemeleri Poland S.ABA6480111
Filtrasyon cihazıVWR Collection511-0265tamamen cam filtrasyon aparatı, huni, fritli taban, kapak, 47 mm ve Oslash; yaylı kelepçe ve zemin eklemi şişesi
Jel 40 (19:1)Rotiphorese3030.1
Jel Yükleme Boyası, Mavi, 6XNew England BiolabsE6138G
Guanozin 5&asal;-[β,γ-imido]trifosfat trisodyum tuzu hidratSigma-AldrichG0635-25MG
labZAPA& A Biyoteknoloji040-500
Magnezyum asetat tetrahidratSigma-AldrichM5661-250G
MCE membran fiterAlfatec TeknolojisiM47MCE45GWSgözenek boyutu: 0.45um
MICROBExpress Bakteriyel mRNA SaflaştırmaInvitrogenAM1905
New England BiolabsE7300Siçin Multipleks Küçük RNA Kütüphanesi Hazırlık Seti
Nükleaz İçermeyen SuAmbionAM9937
Potasyum Asetat Susuz Saf PAPOCH Avantor Performans Malzemeleri Polonya SA744330113
Hızlı Yükleme pBR322 DNA-MspI DigestNew England BiolabsE7323A
RNA Temiz ve Yoğunlaştırıcı -25Zymo ResearchR1018
Sodyum asetatSigma-AldrichS2889-250G
Sodyum karbonatSigma-Aldrich223530-500G
Sodyum hidrojen karbonat saf paPOCH Avantor Performans Malzemeleri Polonya SA810530115
SYBR Altın nükleik asit jel lekesiYaşam TeknolojileriS11494
T4 Polinükleotid KinazNew England BiolabsM0201L
T4 Polinükleotid Kinaz Reaksiyon TamponuNew England BiolabsB0201S
TBE-Üre Numune Tamponu (2x)InvitrogenLC6876
Tris(hidroksimetil)amino-metan, ultra saf, %99,9AlfaAesarJ65594
Triton X-100, %98Acros Organics327371000
Üre GRlach:ner40096-AP0
Illumina

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on t....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ribosome ProfilingRIBO seq ProtocolBacterial TranslationLibrary PreparationNext Generation SequencingRibosomal FootprintsPolyacrylamide Gel ElectrophoresisTranslation InhibitionRNA SequencingBioinformatic Analysis

Related Articles