Method Article

Manyetik Levitasyon Kullanılarak Hücresel Yoğunlukların ve Antijenik Özelliklerin Nicelleştirilmesi

DOI:

10.3791/62550

⸱

May 17th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Nano Flow Core Facility, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Division of Allergy and Inflammation, Beth Israel Deaconess Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, sabit yoğunluklu yakalama boncuklarının kaldırma yüksekliğindeki değişiklikleri ölçerek çözünür veya zara bağlı antijenlerin varlığını özellikle tespit edebilen manyetik kaldırma tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan yöntem, hücreleri ve parçacıkları yoğunluklarına ve manyetik özelliklerine göre ayıran manyetik yükselme ilkelerine dayanarak geliştirilmiştir. Yoğunluk, metabolik hızı, farklılaşması ve aktivasyon durumuyla doğrudan ilişkili bir hücre türü tanımlama özelliğidir. Manyetik yükselme, dolaşımdaki kan hücrelerini başarıyla ayırmak, görüntünü ve karakterize etmek ve anemiyi, orak hücre hastalığını ve dolaşımdaki tümör hücrelerini yoğunluk ve manyetik özelliklere göre tespit etmek için tek adımlı bir yaklaşım sağlar. Bu yaklaşım, sırasıyla yakalama ve algılama antikorları ile kaplanmış düşük ve yüksek yoğunluklu boncuk setleri kullanarak bir çözeltide bulunan çözünür antijenleri tespit etmeye de elverişlidir. Antijen çözeltide mevcutsa, iki boncuk kümesini köprüleyecek ve antikor kaplı boncuk sıraları arasında kabaracak yeni bir boncuk boncuk kompleksi üretecektir. Çözeltideki hedef antijenin artan konsantrasyonu, daha düşük antijen konsantrasyonlarına kıyasla daha fazla sayıda boncuk-boncuk kompleksi üretecek ve böylece hedef antijenin nicel ölçümlerine izin verecektir. Manyetik yükselme, azalan numune hazırlama süresi ve klasik okuma yöntemlerine olan bağlı olmaması nedeniyle diğer yöntemlere göre avantajlıdır. Oluşturulan görüntü, akıllı telefon veya tablet gibi standart bir mikroskop veya mobil cihaz kullanılarak kolayca yakalanır ve analiz edilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manyetik yükselme, hücre tipleri 1 ,2, 3,proteinler4,5ve opioid6'yı sadece spesifik yoğunluklarına ve paramanyetik özelliklerine göreayırmak, analiz etmek ve tanımlamak için geliştirilmiş bir tekniktir. Hücre yoğunluğu, metabolik hızı ve farklılaşma durumu 7 , 8 ,9, 10 , 11,12,13,14ile doğrudan ilişkili her hücre tipininbenzersiz,içsel bir özelliğidir. Sabit durum koşullarında ve çeşitli hücre süreçlerinde hücre yoğunluğundaki ince ve geçici değişiklikleri ölçmek, hücre fizyolojisi ve patofizyolojisi hakkında eşsiz bir içgörü sağlayabilir. Hücre yoğunluğundaki değişiklikler hücre farklılaşması15,16, hücre döngüsü ilerlemesi 9 ,17,18,19,apoptoz 20 ,21,22,23ve kötü huylu dönüşüm24 , 25,26 ileilişkilidir. . Bu nedenle, hücre yoğunluğundaki belirli değişikliklerin nicelemesi, farklı türdeki hücreler arasında ayrım yapmak ve çeşitli aktivasyon işlemlerinden geçen aynı hücre türleri arasında ayrım yapmak için kullanılabilir. Bu, yoğunluktaki dinamik değişikliklerin değiştirilmiş hücre metabolizmasının bir göstergesi olarak hizmet ettiği belirli bir hücre alt popülasyonu hedefleyen deneylere olanak tanır27. Bir hücrenin değişen bir ortama yanıt olarak yoğunluğunu değiştirebileceği tespit edildiği için7, hücrenin kinetiğini tam olarak anlamak için yoğunluğuna göre ölçmek zorunludur, hangi mevcut yöntemler12sağlamayabilir. Öte yandan manyetik yükselme, hücrelerin ve özelliklerinin dinamik bir şekilde değerlendirilmesini sağlar28.

Hücreler diamanyetiktir, yani kalıcı bir manyetik dipol momenti olmazlar. Bununla birlikte, harici bir manyetik alana maruz kaldığında, hücrelerde uygulanan alanın tersi yönde zayıf bir manyetik dipol momenti oluşur. Böylece, hücreler paramanyetik bir çözeltide askıya alınır ve güçlü bir dikey manyetik alana maruz kalırsa, manyetik kaynaktan uzaklaşır ve öncelikle bireysel yoğunluklarına bağlı olarak bir yüksekliğe dururlar. Aşağıdaki iki kriter yerine getirildiğinde, en az sayıdaki bir inhomogeneous manyetik alanla sınırlı bir nesnenin diamanyetik olarak yükselmesi mümkündür: 1) parçacığın manyetik duyarlılığı çevredeki ortamınkinden daha küçük olmalı ve 2) manyetik kuvvet, parçacığın yüzdürme kuvvetini dengelemek için yeterince güçlü olmalıdır. Her iki kriter de RBI'ların manyetik bir tamponda askıya alınması ve küçük, ucuz, piyasada bulunan kalıcı mıknatıslarla güçlü manyetik alan gradyanları oluşturularak yerine getirilebilir1. Manyetik olarak sıkışmış bir parçacığın yerçekimi yönü boyunca bir eksen üzerindeki dengesi, yoğunluğu (tamponun yoğunluğuna göre), manyetik duyarlılığı (tamponun manyetik duyarlılığına göre) ve uygulanan manyetik alanın imzası ile belirlenir. Çözeltinin yoğunluğu ve manyetik özellikleri sistem genelinde sabit olduğundan, hücrelerin iç yoğunluk özellikleri, hücrelerin yükselme yüksekliğini belirleyen ana faktör olacaktır, daha yoğun hücreler daha az yoğun hücrelere kıyasla daha düşük yükselir. Bu yaklaşım, yoğunluk ölçümleri için hassas, oranmetrik analiz kullanmamızı sağlayan iki yoğunluk referans boncuk seti (1,05 ve 1,2 g/mL) kullanır. Manyetik çözeltinin konsantrasyonunun değiştirilmesi, dolaşımdaki hücrelerin yoğunluğu hücreye özgü olduğundan, RBI'lar gibi farklı hücresel popülasyonları WBC'lerden izole etmeyi sağlar, bu da izolasyon protokollerine veya diğer hücre manipülasyonuna olan ihtiyacı ortadan kaldırır.

Biyoloji araştırmalarında kullanılan algılama yöntemlerinin çoğu, doğrusal sinyallerin ölçülmesi kolay hale gelen belirli bağlama olaylarının tahmin edilmesine dayanır. Bu okuma yöntemleri genellikle karmaşıktır ve özel ekipman ve özel bilimsel personel içerir. Hücrelerin plazma zarında veya hücre dışı vezikliklerde bulunan veya plazmada çözünebilen antijenlerin bir veya iki antikor kaplı boncuk kullanılarak tespitini amaçlayan bir yaklaşım burada açıklanmıştır. Boncuklar birbirinden ve sorgulanan hedeflerinkinden farklı yoğunluklarda olmalıdır. Herhangi bir biyofluidde hedef antijenin varlığı, bir algılama parçasına bağlı bir antijen pozitif hücrenin yükselme yüksekliğinde belirli, ölçülebilir bir değişikliğe çevrilir. Çözünür antijenler veya hücre dışı veziklinler durumunda, boncuk hücre kompleksi yerine boncuk-boncuk kompleksi oluşturan boncukları hem yakalama hem de algılamaya bağlıdırlar. Yükselme yüksekliğindeki değişiklik boncuk hücre veya boncuk-boncuk komplekslerinin yeni yoğunluğuna bağlıdır. Komplekslerin yükselme yüksekliğindeki değişikliğe ek olarak, biyofluidde antijen varlığını gösteren, komplekslerin sayısı da hedef miktarına bağlıdır, bu da manyetik yükselmeyi antijen tespiti için nicel bir yaklaşım24.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada kullanılan deneysel protokol Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır.

1. Enstrüman kurulumu

NOT: Görüntüleme yükseltici hücreler, manyetik bir alan oluşturmak için aynı kutup birbirine bakacak şekilde z ekseninde mıknatıslanmış iki nadir toprak neodimyum mıknatısı gerektirir. Mıknatıslar arasındaki mesafe, manyetik alanın yoğunluğuna ve hedeflerin yoğunluğuna bağlı olarak özelleştirilebilir. Bu durumda mıknatıslar, 50 mm uzunluğunda 1x1 mm kare cam kılcal borunun yerleştirilmesi için yeterli 1 mm'lik bir alanla ayrılır. Cihaz, istek üzerine kullanılabilen bir AutoCAD tasarımı kullanılarak 3 boyutlu olarak basıldı.

  1. Mikroskobu yan tarafına, tamamen yatay olarak döşeyin.
    NOT: Standart dik konuma yerleştirilen bir mikroskop, mıknatısların kondenser ve objektif açısından konumları nedeniyle yükseltici nesneleri görüntülemek için doğrudan uygun değildir. Bu sınırlama, mikroskobu yan yatırarak, kondenserin ışığı kılcal damara odaklamasını sağlayan mükemmel yatay ve nesnel lensin Köhler aydınlatma gereksinimlerini korurken mıknatıslar arasında yükselen hücreyi görüntülemesini sağlayarak atlanabilir.
  2. 2 veya 3 laboratuvar jakı kullanarak ekmek tahtası masasındaki standı destekleyin ve seviyelendirmeyi yapın.
  3. Titreşimleri sınırlamak için ekmek tahtası masasını kauçuk sönümleme ayakları ile destekleyin.
  4. Sahneyi çıkarın ve kaldırma cihazının yüksekliğini(y ekseni)ve iki tek eksenli çeviri aşamasını ayarlamak için kompakt bir laboratuvar jakı ile değiştirin; biri odağı ayarlamak için (z ekseni) ve ikincisi kılcal boruyu taramak için.
  5. Manyetik kaldırma cihazını iki mini serisi optik direk kullanarak laboratuvar jakına takın.

2. Antikorun Karboksi-Mikropartiküllere/Boncuklara Bağlanması (PolyAn tarafından bir protokolden değiştirilmiştir)

NOT: Rh(+) algılaması için sadece düşük yoğunluklu boncukların (1,05 g/mL) kaplanması gerekir, ancak hücre dışı veziküllerin tespiti için hem yüksek hem de düşük yoğunluklu boncuklar kaplanır.

  1. Boncuk süspansiyonunun 1 mg eşdeğerini çıkar ve 0.5 mL Aktivasyon Tamponuna (50 mM MES (MW195.2, 1 mL'de 9.72 mg)) pH 5.0 ve% 0.001 Polisorbat-20 ekleyin.
  2. Buz gibi suya 12 μL taze yapılmış 1,5 M EDC (MW 191,7, 1 mL'de 0,28755 g) ve 0,3 M Sulfo-NHS 'nin (MW 217,14, 1 mL'de 0,0651 g) 12 μL ekleyin.
  3. Tüpleri bir yörünge çalkalayıcıya yerleştirin ve boncuklar üzerindeki karboksil gruplarını etkinleştirmek için oda sıcaklığında 1 saat kuvvetlice çalkalayın.
  4. 0,5 mL Kavrama Tamponu (10x PBS veya 0,1 M fosfat pH 7-9) ekleyerek etkinleştirmeyi 1 saat sonra durdurun.
  5. Boncukları 10 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyerek peletleyin veya boncuklar peletlenemiyorsa, 0,45 μm santrifüj tüpü filtresi kullanın. Süpernatantı veya akışı aspire edin.
  6. Boncukları 1 mL 10x PBS ile 2.5 adımdan 3 kat daha fazla yıkayın.
  7. Mg boncuk başına 25 μg antikor hesaplayın ve istenen antikoru aktif boncuklarla 10X PBS'de 0.7-1.0 mg/mL nihai antikor konsantrasyonuna karıştırın.
  8. Tüpleri düşük hızda ayarlanmış bir tüp rocker üzerine yerleştirin. Boruları bağlantı için gece boyunca oda sıcaklığında hafifçe yuvarlayın.
  9. 2.5. adımı tekrarlayın ve boncukları 1 mL 10x PBS ile iki kez yıkayın.
  10. Hafifçe sallanırken oda sıcaklığında 1 saat boyunca %0,02 Polisorbat-20 ile tampon pH 8,0'de 0,5 mL 1 M etanolamin (%98 stok = 16,2 M) ile yıkayın.
  11. 2.5. adımı tekrarlayın ve boncukları 1 mL DPBS'de bir kez yıkayın. Boncuklar, ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de 200 μL DPBS'de saklanabilir.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

3. Rh(+) Tespiti için Kan Toplanması ve Hazırlanması

  1. Tek tıklamayla bir gencing cihazı kullanarak, bir Rh(+) donörün parmağını batırın ve 10 μL kanı 1 mL DPBS'ye toplayın.
  2. Rh+ hücrelerini floresan plazma membran lekesi ile lekele. İsteğe bağlı olarak, Rh+ hücrelerinin 1 mL süspansiyonuna (1:1000 seyreltme) 1 μL floresan boya ekleyin.
  3. Hücreleri 37 °C'de floresan boya ile 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. Hücreleri 15 s için 5.600 x g'da döndürerek pelet ve 1 mL DPBS kullanarak 3 kez yıkayın. Kalsiyum ve magnezyum (HBSS++) ile 1 mL HBSS'de yeniden biriktirin.
  5. Tek tıklamayla sarkan cihazı kullanarak, bir Rh(-) donörün parmağını batırın ve 2 μL kan toplayın.
    NOT: 2'den fazla durum hazırlıyorsanız, her tüpe 1 μL Rh(-) kan eklemek için yeterli kan toplayın.
  6. Gerekli deneysel tüpleri hazırlayın: Boncuklar tek başına, IgG kontrolü, örnek.
    1. Sadece boncuklar: 174 μL HBSS++, 1 μL IgG kontrol boncukları, 1 μL yüksek yoğunluklu boncuklar (1,2 g/mL) ve 500 mM Gd3+ (60 mM) 24 μL ekleyin.
    2. IgG kontrolü: 172 μL HBSS ++, 1 μL IgG kontrol boncukları, 1 μL yüksek yoğunluklu boncuk, 1 μL Rh- kan, 1 μL lekeli Rh + kan süspansiyonu ve 24 μL 500 mM Gd3+ekleyin.
    3. Örnek tüp 172 μL HBSS ++, 1 μL anti-RhD kaplı boncuk, 1 μL yüksek yoğunluklu boncuk, 1 μL Rh- kan, 1 μL lekeli Rh (+) kan süspansiyonu ve 24 μL 500 mM Gd3+ekleyin.
      NOT: Referans için Rh örneklerine yüksek yoğunluklu boncuklar eklenir.

4. Hücre Ayırma Gösterimi için PMN'lerin İzolasyonu

  1. Nötrofillerin İzolasyonu
    1. 6 mL sodyum sitrat/sitrik asit (0,15 M, pH 5,5) ve %6 Dextran-70'in 14 mL'sini içeren 60 mL şırınna 40 mL venöz kan çekin.
    2. Kanın çökeltilmesi için 50 dakika bekleyin.
    3. Buffy coat hücrelerini 20 mL Ficoll-Paque'nin üzerine yavaşça katlayın ve üst 18 mL'yi kan toplama tüpünden 50 mL'lik bir tüpe iterek çökelmiş RBC'lerle kirlenmeyi önleyin. Orijinal kan alma tüpünde kalan artık RBC'lerle kontaminasyonu en aza indirmek için taze bir kan alma seti kullanılması önerilir.
    4. 3.000 x g'da 20 dakika santrifüjleme ile buffy coat hücrelerini pelet. Nötrofiller ve kontamine RBC'ler tüpün dibinde çınlayacak. PBMC, Ficoll-Paque'nin üstünde beyaz bir katman oluşturacaktır.
    5. Nötrofilleri yeni bir 50 mL tüpe aktarın.
    6. Nötrofilleri 25 saniye boyunca 20 mL%0,2 soğuk NaCl çözeltisi ile inkübe ederek kalan RBC'leri ve ardından %1,6 NaCl'lik ek 20 mL'yi lyse. NaCl'in son konseri% 0.9 (izotonik) olmalıdır.
    7. Süspansiyonu 3.000 x g'da 10 dakika santrifüj edin.
    8. Süpernatant çıkarın ve nötrofilleri istenen konsantrasyona yeniden sürtün.
  2. Lenfositlerin İzolasyonu
    1. PBMC'leri RPMI'de 6 kuyulu kültür plakalarında % 5 ısı inaktive serum ile plakalayın.
    2. Plakaları 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın. Monositler plakaya yapışacak, lenfositler serbestçe yüzecektir.
    3. Lenfositleri içeren tamponu çıkarın ve RPMI ile iki kez yıkayın.
    4. Lenfositleri istenen konsantrasyonda yeniden sön.
  3. RBC'leri, PMN'leri ve Lenfositleri etiketle.
    1. Her hücre türünü farklı bir floresan boya ile etiketle. Her boyanın farklı bir kanalda floresan olduğundan emin olun. Seçilen boyaların her biri için üreticinin talimatlarını izleyin.

5. Kompleman Aktivasyonu ile RBC Hücre Dışı Veziklinlerin Üretimi

  1. EDTA tüplerini kullanarak venypunktur yoluyla tam kan elde edin.
  2. Kanı beyaz bir kan hücresi filtresinden geçirin ve kırmızı kan hücrelerini izole etmek için her biri 10 dakika boyunca 500 x g'da 3 kez santrifüjleyin. Yıkama tamponu olarak HBSS++ kullanın.
  3. 1,5 mL tüplerde 100 μL paketlenmiş RBC'lerden oluşan aliquots yapın ve HBSS ++ ekleyerek hacmi 1 mL'ye kadar yükseltin.
  4. HBSS++'da 0,18 μg/mL son konsantrasyona C5b,6 ve ardından girdap ekleyin.
  5. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaş bir çalkalayıcı takin.
  6. 0,2 μg/mL'lik son konsantrasyona C7 proteini ekleyin. Tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirerek karıştırın. Bu noktadan sonra girdap yapmayın.
  7. Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca düşük hızda ayarlanmış bir tüp çalkalayıcıya yerleştirin.
  8. Son konsantrasyona 0,2 μg/mL'ye C8 proteini ve 0,45 μg/mL'ye C9 proteini ekleyin. Tüpleri birkaç kez hafifçe ters çevirerek karıştırın.
  9. 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatır.
  10. Tüpü 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüj edin.
  11. EV içeren süpernatant'ı yeni bir tüpte toplayın. Süpernatant hücre peletine çok yakın tremove etmeyin.

6. Manyetik Kaldırma Cihazındaki Hücrelerin Analiz Edilmesi

  1. Üretici talimatlarına göre enstrüman başlatma gerçekleştirin.
  2. Tüp dolana kadar 50 μL numuneyi kılcal bir tüpe yükleyin. Kılcal borunun uçlarını kılcal dolgu macunu ile kapatın, böylece hava kabarcıkları olmadığından emin olun.
  3. Kılcal boruyu üst ve alt mıknatıslar arasındaki tutucuya yükleyin. En iyi görüntüleme için sahneyi ve odağı ayarlayın.
    NOT: Hücreler / boncuklar, yoğunluklarına ve Gd 3 + konsantrasyonuna bağlı olarak manyetik denge konumlarına ulaşmak için5-20dakikadan herhangi bir yere gidebilir. Gd3+konsantrasyonu ne kadar yüksekse, süre o kadar kısa olur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manyetik yükselme, nesnenin yoğunluğuna, manyetik imzasına, paramanyetik çözeltinin konsantrasyonuna ve iki güçlü, nadir toprak mıknatısının yarattığı manyetik alanın gücüne bağlı olarak farklı yoğunluklardaki nesneleri farklı yükselme yüksekliklerinde odaklar. İki mıknatıs üst üste yerleştirildikçe, yükselen numuneler sadece Köhler aydınlatmasını korurken, yan tarafında bir mikroskop kullanılarak görüntülenebilir (Şekil 1). Her hücre tipinin ulaştığı son yükselme yüksekliği, paramanyetik çö...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Degrade santrifüjleme şu anda hücre altı bileşenleri benzersiz yoğunluklarına göre izole etmek için standart tekniktir. Ancak bu yaklaşım, özel degrade ortamın yanı sıra santrifüj ekipmanının kullanılmasını gerektirir. Burada sunulan manyetik yükselme yaklaşımı, dolaşımdaki hücrelerin morfolojik ve fonksiyonel özelliklerinin ayrıntılı bir şekilde araştırılmasına izin verir, minimum, hücrelerin herhangi bir manipülasyonu durumunda, dolaşımdaki hücrelere yakın bir in vivo erişim sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir ihtilafı yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, dr. Getulio Pereira'ya hücre dışı vezne çalışmalarındaki yardımları için teşekkür eder.

Bu çalışma ICG'ye aşağıdaki Ulusal Sağlık Enstitüsü hibeleri tarafından desteklendi: RO1CA218500, UG3HL147353 ve UG3TR002881.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2- (N-Morfolino) etansülfonik asit hidratSigma AldrichM-2933(MES); aktivasyon tamponunun bileşeni
50x2.5x1 mm mıknatıslar, Nikel (Ni-Cu-Ni) kaplama, N52 sınıfı, 5 mm (0.197 ") kalınlıkta manyetizeK& J MagneticsÖzelMıknatıslar manyetik kaldırma cihazı için kullanılır
Kılcal Boru Mastik (Critoseal)Leica Microsystems267620Kılcal boruların uçlarını kapatmak için kullanılır
Santrifüj tüpü filtreleri (Corning Costar Spin-X)Sigma AldrichCLS8163Boncukları yıkamak için kullanılır
Kompakt Lab JackThorlabsLJ750Manyetik kaldırma cihazını ayarlamak için kullanılır
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yokGibco14190-144Boncuk süspansiyonları için çözelti
EtanolaminSigma AldrichE9508-100MLBoncuklar için bir yıkama adımı sırasında kullanılır
Floresan Plazma Membran Lekesi (CellMask Green)InvitrogenC37608Rh + hücrelerini boyamak için kullanılır
Gadoteridol EnjeksiyonProHanceNDC 0270-1111-03Gadolinyum (Gd3+); hücreleri askıya almak için kullanılan manyetik çözelti
HBSS++Gibco14025-092Numune hazırlama çözeltisi
İnsan C5b,6 kompleksKompleman Teknolojisi, IncA122RBC Evs üretmek için kullanılır
İnsan C7 proteiniKompleman Teknolojisi, IncA124RBC üretmek için kullanılır Evs
İnsan C8 proteiniKompleman Teknolojisi, IncA125RBC üretmek için kullanılır Evs
İnsan C9 proteinTamamlayıcı Teknolojisi, IncA126RBC üretmek için kullanılır Evs
Mini Serisi Post CollarThorlabsMSR2Manyetik levitasyon cihazını laboratuvar krikolarına sabitlemek için kullanılır
N- (3-Dimetilaminopropil) -N ve prime;-etilkarbodiimid hidroklorürSigma AldrichE1769-10G(EDC); antikor birleştirme reaksiyonunda kullanılır
Normal Tavşan IgG KontrolüAr-Ge D SistemleriAB-105-CKontrol koşulu olarak boncukları kaplamak için kullanılır
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (10X Çözelti, pH 7.4)Boston BioproductsBM-220Yıkama aşamaları için kullanılan birleştirme tamponunun bileşeni
Polisorbat 20 (Tween 20)Sigma AldrichP7949-500MLAktivasyon tamponunun bileşeni
Polistiren Karboksil PolimerPatlama LaboratuvarlarıPC06004Antikor birleştirme için kullanılan üst yoğunluklu boncuklar (1.05 g / mL)
Tavşan RhD Poliklonal AntikorInvitrogenPA5-112694Kırmızı kan hücrelerinde Rh faktörünün tespiti için boncukları kaplamak için kullanılır
Araştırma Sınıfı MikroskopOlympusProvis AX-70Manyetik kaldırma cihazını monte etmek ve havaya kalkan hücreleri görüntülemek için kullanılan mikroskop
Kauçuk Nemlendirme AyaklarıThorlabsRDF1Breadboard tablasını desteklemek için kullanılır
Kare Boro BoruVitroTubes8100-050numune yüklemek için kullanılan kılcal tüp
Thermoscientific24510Antikor birleştirme reaksiyonunda kullanılır
Translasyon AşamasıThorlabsPT1Kılcal boruyu odaklamak ve taramak için kullanılır
Maglev Sulfo-NHS'ye

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tasoglu, S., et al. Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution. Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).
  2. Durmus, N. G., et al. Magnetic levitation of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).
  3. Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities. PLoS One. 10 (8), 0134400(2015).
  4. Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. Magnetically Levitated Plasma Proteins. Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).
  5. Yaman, S., Tekin, H. C. Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation. Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).
  6. Abrahamsson, C. K., et al. Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation. Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).
  7. Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes. PLoS One. 14 (2), 02117227(2019).
  8. Hart, A., Edwards, C. Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis. Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).
  9. Poole, R. K. Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection. The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).
  10. Cass, C. E. Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures. Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).
  11. Grover, W. H., et al. Measuring single-cell density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).
  12. Bryan, A. K., et al. Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators. Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).
  13. Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. Cell density sensing and size determination. Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).
  14. Neurohr, G. E., Amon, A. Relevance and Regulation of Cell Density. Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).
  15. Maric, D., et al. Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy. European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).
  16. Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells. Methods. 16 (3), 247-259 (1998).
  17. Wolff, D. A., Pertoft, H. Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells. Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).
  18. Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus. Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).
  19. Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).
  20. Yurinskaya, V. E., et al. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).
  21. Wyllie, A. H., Morris, R. G. Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).
  22. Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis. American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).
  23. Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. American Journal of Physiology. 270 (4), Pt 1 1190-1203 (1996).
  24. Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood. 48 (3), 361-371 (1976).
  25. Huber, C., et al. A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes. British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).
  26. Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
  27. Andersen, M. S., et al. A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis. Shock. , (2018).
  28. Felton, E. J., et al. Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone. Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).
  29. Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity. Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Magnetic LevitationCellular DensityAntigen DetectionBlood Cell SeparationDensity Based SeparationRed Blood CellsAntibody Coated BeadsFluorescent StainingCapillary Tube AssayGadolinium Ion

Related Articles