Nanobodies yapısal biyolojide önemli araçlardır ve tedavilerin gelişimi için büyük bir potansiyel oluşturur. Bununla birlikte, inhibitör özelliklere sahip nanobodies seçimi zor olabilir. Burada elektrojenik membran taşıyıcılarını hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodların sınıflandırılması için katı destekli membran (SSM) tabanlı elektrofizyolojinin kullanımını gösteriyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Katı Destekli Membran (SSM) Tabanlı Elektrofizyoloji ile Taşıyıcı Hedefli inhibitör nanobodies seçimi
Bu makalede
Özet
Özet
Tek etki alanı antikorları (nanobodies) proteinlerin mekanistik ve yapısal çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır ve çoğu ışınlayıcılar gibi membran proteinlerinin inhibisyonuna bağlı olan klinik tedaviler geliştirmek için araç olarak muazzam bir potansiyel oluşturmaktadır. Bununla birlikte, taşıma etkinliğinin inhibisyonunu belirlemek için kullanılan yöntemlerin çoğunun yüksek verimli rutinlerde gerçekleştirilmesi zordur ve etiketli substratların kullanılabilirliğine bağlıdır, böylece büyük nanobody kütüphanelerinin taranmasını zorlaştırır. Katı destekli membran (SSM) elektrofizyolojisi, elektrojenik taşıyıcıları karakterize etmek ve taşıma kinetiğini ve inhibisyonunu ölçmek için kullanılan yüksek verimli bir yöntemdir. Burada, elektrojenik ikincil taşıyıcıyı hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodileri seçmek ve nanobodies inhibitör sabitlerini hesaplamak için SSM tabanlı elektrofizyolojinin uygulanmasını gösteriyoruz. Bu teknik özellikle etiketli substratların bulunmadığı taşıyıcıları hedefleyen inhibitör nanobodies seçmek için yararlı olabilir.
Giriş
Antikorlar, antijen bağlanmasından sorumlu iki özdeş ağır zincir ve iki ışık zincirinden oluşur. Kamelyalar sadece konvansiyonel antikorlara kıyasla kognat antijenleri için benzer benzeşim gösteren ağır zincirli antikorlara sahiptir1,2. Sadece ağır zincirli antikorların tek değişken etki alanı (VHH) tam antijen bağlama potansiyelini korur ve çok kararlı olduğu gösterilmiştir1,2. Bu izole VHH molekülleri veya "nanobodies" membran proteinleri biyokimya ile ilgili çalışmalarda konsültasyonları stabilize etmek için araçlar olarakuygulanmı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Membran proteini rekonsyh
- 3 mL E. coli polar lipidleri 1 mL fosfatidylcholine ile havalandırılmış bir kaputun altında yuvarlak bir alt şişede karıştırın.
- Lipid karışımını, kloroformu çıkarmak için bir döner evaporatör ve 37 °C'de bir su banyosu kullanarak vakum altında 20 dakika kurutun. Gerekirse, azot veya argon gazı altında daha fazla kurulayın.
- 2 mM β-mercaptoethanol içeren TS tamponu (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) kullanarak lipitleri 25 mg/mL'ye yeniden biriktirin.
- 500 μL aliquots'ta aliquot lipitler, sıvı nitrojende flaş dondurma ve -80 °C'de depolayın.
- Bir adet 500 μL lipit aliquot çözün ve 2 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
SSM tabanlı elektrofizyoloji, elektrojenik taşıyıcıların karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada sunulan protokolde, sekonder bir taşıyıcıyı (burada bakteriyel kolin symporter) hedefleyen nanobodileri inhibitör ve inhibitör olmayan özelliklerine göre sınıflandırmak için SSM tabanlı elektrofizyolojinin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Bu tekniğin en kullanışlı özelliklerinden biri, birden çok arabellek koşulunun yüksek verimli taranmasına izin veriyor olmasıdır. Bu özel özellik, bağlayıcıların seçi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada sunulan teknik, elektrojenik taşıyıcıları hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan özelliklere sahip nanobodları sınıflandırır. Substrat taşımacılığının değerlendirilmesi, proteolipozomların zarlarına gömülü taşıyıcı aracılığıyla yüklerin hareketinin tespit edilmesi nedeniyle mümkündür. Bir deneyin kurulumu sırasındaki kritik adımlardan bazıları, lipozomlardaki aktif proteinin yeniden uzlaştırılması, SSM yongalarında kararlı monolayerlerin hazırlanması ve bağlı nanobody moleküllerini çıkarmak için yıkama protokol.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Zürih Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji Enstitüsü'nden Cedric A. J. Hutter ve Markus A. Seeger'a ve Basel Üniversitesi Biozentrum'dan Gonzalo Cebrero'ya sentetik nanobodies (siyadlar) üretimindeki işbirliği için teşekkür ederiz. Nanion Technologies'den Maria Barthmes ve Andre Bazzone'a teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF) (PP00P3_170607 ve NANION Research Grant Initiative tarafından C.P.'ye desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1-oktadekanetiol çözeltisi | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-difitanoyl-sn-glisero-3-fosfokolin | Avanti Polar Lipidler | 850356C-25mg | |
| Biyo-Boncuklar SM-2 Adsorban (Polistiren adsorban boncuklar) | BioRad | # 152-3920 | |
| PD 10 Tuz Giderme Kolonları | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Filtre 200 nm membran | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-Propanol | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Dekan | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodesil-ß-D-maltosid (DDM) | Avanti Polar Lipidler | 850520P-25g | |
| Sodyum Klorür | AppliChem | 131659.1211 | |
| (SSM kurulumu) SURFE2R N1 | Nanion | ----- | |
| SURFE2R N1 Tek Sensör Çipleri | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli Polar Lipid Özü | Avanti Polar Lipidler | 100600C | |
| Yumurta PC L -&alfa; -fosfatidilkolin | Avanti Polar Lipidler | 840051C |
Kaynaklar
- Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
- Hamers-Casterman, C., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
