Yöntem makalesi

Katı Destekli Membran (SSM) Tabanlı Elektrofizyoloji ile Taşıyıcı Hedefli inhibitör nanobodies seçimi

DOI:

10.3791/62578

⸱

3 Mayıs 2021

 , 
1Biozentrum, University of Basel

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanobodies yapısal biyolojide önemli araçlardır ve tedavilerin gelişimi için büyük bir potansiyel oluşturur. Bununla birlikte, inhibitör özelliklere sahip nanobodies seçimi zor olabilir. Burada elektrojenik membran taşıyıcılarını hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodların sınıflandırılması için katı destekli membran (SSM) tabanlı elektrofizyolojinin kullanımını gösteriyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek etki alanı antikorları (nanobodies) proteinlerin mekanistik ve yapısal çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır ve çoğu ışınlayıcılar gibi membran proteinlerinin inhibisyonuna bağlı olan klinik tedaviler geliştirmek için araç olarak muazzam bir potansiyel oluşturmaktadır. Bununla birlikte, taşıma etkinliğinin inhibisyonunu belirlemek için kullanılan yöntemlerin çoğunun yüksek verimli rutinlerde gerçekleştirilmesi zordur ve etiketli substratların kullanılabilirliğine bağlıdır, böylece büyük nanobody kütüphanelerinin taranmasını zorlaştırır. Katı destekli membran (SSM) elektrofizyolojisi, elektrojenik taşıyıcıları karakterize etmek ve taşıma kinetiğini ve inhibisyonunu ölçmek için kullanılan yüksek verimli bir yöntemdir. Burada, elektrojenik ikincil taşıyıcıyı hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodileri seçmek ve nanobodies inhibitör sabitlerini hesaplamak için SSM tabanlı elektrofizyolojinin uygulanmasını gösteriyoruz. Bu teknik özellikle etiketli substratların bulunmadığı taşıyıcıları hedefleyen inhibitör nanobodies seçmek için yararlı olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antikorlar, antijen bağlanmasından sorumlu iki özdeş ağır zincir ve iki ışık zincirinden oluşur. Kamelyalar sadece konvansiyonel antikorlara kıyasla kognat antijenleri için benzer benzeşim gösteren ağır zincirli antikorlara sahiptir1,2. Sadece ağır zincirli antikorların tek değişken etki alanı (VHH) tam antijen bağlama potansiyelini korur ve çok kararlı olduğu gösterilmiştir1,2. Bu izole VHH molekülleri veya "nanobodies" membran proteinleri biyokimya ile ilgili çalışmalarda konsültasyonları stabilize etmek için araçlar olarakuygulanmıştır 3,4, inhibitörler olarak5,6, stabilizasyon ajanları olarak7, ve yapı belirleme için araçlar olarak8,9,10 . Nanobodies, hedefe özgü nanobodları kodlayan B hücrelerinin önceden zenginleştirilmesi ve daha sonra B hücrelerinin izolasyonu için kamelyaların bağışıklanması ve ardından nanobody kütüphanesinin klonlanması ve faj ekranı ile seçilmesi ile üretilebilir11,12,13. Nanobodies oluşturmanın alternatif bir yolu, kütüphanelerin inşasına ve faj ekranı, ribozom ekran veya maya ekranı 14 , 15,16, 17,18,19,20ile seçime dayanan in vitro seçimyöntemlerinedayanmaktadır. Bu in vitro yöntemler büyük kütüphane boyutları gerektirir, ancak hayvan bağışıklamadan kaçınmaktan yararlanır ve nispeten düşük stabiliteye sahip proteinleri hedefleyen nanobodies seçimini tercih eder.

Nanobodilerin küçük boyutu, yüksek stabilite ve çözünürlükleri, güçlü antijen benzeşimi, düşük immünojeniklik ve nispeten kolay üretim, onları terapötiklerin gelişimi için güçlü adaylar haline getirir21,22,23. Özellikle, çoklu membran proteinlerinin aktivitesini engelleyen nanobodies klinik uygulamalar için potansiyel varlıklardır5,24,25,26. Membran taşıyıcıları söz konusu olduğunda, bir nano gövdenin inhibitör aktiviteye sahip olup olmadığını değerlendirmek için, taşınan substratların ve / veya ko-substratların tespit edilmesine izin veren bir test geliştirmek gerekir. Bu tür tahliller genellikle etiketli molekülleri veya evrensel bir uygulamadan yoksun olabilecek substrata özgü algılama yöntemlerinin tasarımını içerir. Ayrıca, inhibitör nanobodies tanımlanması genellikle bağlayıcıların çok sayıda taranır gerektirir. Bu nedenle, yüksek aktarım hızı modunda kullanılabilen ve etiketli alt tabakalara dayanmayan bir yöntem bu seçim için gereklidir.

SSM tabanlı elektrofizyoloji, membranlar (örneğin, iyon bağlama/taşıma)27,28boyunca yüklerin hareketinin algılanmasını sağlayan son derece hassas, son derece zaman çözülen bir tekniktir. Bu teknik, bu proteinlerin 29 , 30 , 31 ,32, 33 ,34,35'in göreceli düşük cirosu nedeniyle diğer elektrofizyoloji tekniklerini kullanarak çalışması zor olan elektrojenik taşıyıcıları karakterize etmek için uygulanmıştır. SSM elektrofizyolojisi etiketli substratların kullanılmasını gerektirmez, yüksek verimli tarama için uygundur ve ilgi çekici taşıyıcıyı içeren proteolipozomlar veya membran vezikülleri kullanılabilir. Burada, SSM tabanlı elektrofizyolojinin ışınlayıcı hedefli nanobodies'i inhibitör ve inhibitör olmayan özelliklerle sınıflandırmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz. İlke kanıtı olarak, bakteriyel kolin taşıyıcısının lipozomlara yeniden yapılandırılmasını ve ardından SSM sensörlerindeki proteolipozomların hareketsiz hale getirilmesi için ayrıntılı adımları açıklıyoruz. Daha sonra kolin taşımacılığının SSM tabanlı elektrofizyoloji ölçümlerinin nasıl gerçekleştirildiğini ve yarı maksimal etkili konsantrasyonun nasıl belirlendiğini açıklıyoruz (EC50). Daha sonra birden fazla nanobodiyleri taramak ve kolin taşıma inhibitörlerini tanımlamak için SSM tabanlı elektrofizyolojinin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Son olarak, seçilen inhibitör nanobodilerin yarı maksimal inhibitör konsantrasyonlarının(IC 50)nasıl belirlendiğini açıklıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Membran proteini rekonsyh

  1. 3 mL E. coli polar lipidleri 1 mL fosfatidylcholine ile havalandırılmış bir kaputun altında yuvarlak bir alt şişede karıştırın.
  2. Lipid karışımını, kloroformu çıkarmak için bir döner evaporatör ve 37 °C'de bir su banyosu kullanarak vakum altında 20 dakika kurutun. Gerekirse, azot veya argon gazı altında daha fazla kurulayın.
  3. 2 mM β-mercaptoethanol içeren TS tamponu (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) kullanarak lipitleri 25 mg/mL'ye yeniden biriktirin.
  4. 500 μL aliquots'ta aliquot lipitler, sıvı nitrojende flaş dondurma ve -80 °C'de depolayın.
  5. Bir adet 500 μL lipit aliquot çözün ve 2 mM β-mercaptoethanol içeren TS tamponu kullanarak 1:1'i seyreltin.
  6. Lipid süspansiyonunu 400 nm membran kullanarak 15 kez ekstrüde edin.
  7. Lipid süspansiyonu 4.4 mg/mL'lik son lipit konsantrasyonuna sahip olacak şekilde seyreltin.
  8. Son konsantrasyonu %0,2 olacak şekilde n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 200 rpm'de 1 saat boyunca dönmeye bırakın.
  9. 1:10 ile 1:100 (w:w) arasında lipid-protein oranı kullanarak saflaştırılmış proteini lipitlere ekleyin.
    NOT: Oranın, substrat taşımacılığının SSM-elektrofizyoloji ölçümlerinde tespit edilen sinyalin gücüne bağlı olarak ayarlanması gerekir (aşağıya bakın). Daha büyük sinyaller elde etmek için daha küçük lipid-protein oranları kullanın.
  10. RT'de 1 saat boyunca 200 rpm'de dönen karışımı kuluçkaya yaslayın.
  11. TS tamponunda önceden yıkanmış 30 mg/mL polistiren adsorbent boncuk ekleyin.
    NOT: Polistiren boncukları adım adım ekleyin.
  12. Boncuk-lipit karışımını yavaş karıştırma altında RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  13. Boncukları çıkarmak için boncuk-lipit karışımının boncukların yerleşmesi için durmasına izin verin. Çözeltiyi yeni bir tüpe aktarın ve boncukları geride bırakın. Ayrılmış lipit karışımına 30 mg/mL taze polistiren adsorbent boncuk ekleyin.
  14. Karışımı yavaş karıştırma altında 4 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  15. Boncukları 1.13 adımında açıklandığı gibi karışımdan ayırın ve 30 mg/ mL taze polistiren adsorbent boncuk ekleyin.
  16. Karışımı 4 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın.
  17. Boncukları adım 13'te açıklandığı gibi karışımdan ayırın ve 30 mg / mL taze polistiren adsorbent boncuk ekleyin.
  18. Dördüncü ve son yıkama için karışımı 4 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
  19. 4 °C'de 30 dakika boyunca 110.000 x g'da santrifüj.
  20. Peletin 2 mM β-mercaptoethanol içeren 500 μL TS tampon ile yıkayın.
  21. 4 °C'de 30 dakika boyunca 110.000 x g'da tekrar santrifüj.
  22. Peletin 2 mM β-mercaptoethanol ile TS tamponunda 25 mg/mL'lik son lipit konsantrasyonuna yeniden harcayın.
  23. Protein konsantrasyonunun jel veya amido siyahı bir test kullanarak tahminedin 36.
  24. Proteoliposomes aliquot, sıvı azot flaş dondurma ve -80 °C'de saklayın.

2. Çip hazırlama

  1. Tek bir sensör çipini 50-100 μL 0,5 mM 1-octadecanethiol çözeltisi (izopropanol ile yeniden kullanılır) ile doldurun.
  2. Rt'de 30 dakika boyunca çipi çözelti ile kuluçkaya yatırın.
  3. Çipi bir dokuya dokunarak tiol çözeltisini çıkarın.
  4. Sensörü 5 mL saf izopropanol ile 3 kez durulayın.
  5. Sensörü 5 mL çift damıtılmış su ile 3 kez durulayın.
  6. Bir kağıt mendile dokunarak sensörü kurulayın.
  7. 1,5 μL 7,5 μg/μL 1,2-diphytanoyl-sn-glisero-3-fosfokolin uygulayın (lipitler döner evaporatörde kurutulur ve n-dekane ile yeniden depolanır).
  8. Hemen ardından sensörü, alt tabakayı içermeyen 50 μL aktive olmayan SSM tamponu ile doldurun. Bu, SSM tabakasının kendiliğinden oluşmasına yol açacaktır.
    NOT: SSM arabelleği, düşük arka plan gürültüsüne sahip en uygun koşulları belirlemek için önceden optimize edilmelidir. Başlangıç noktası olarak 30 mM HEPES pH 7.4, 5 mM MgCl2, 140 mM NaCl içeren genel bir tampon kullanılabilir. Substratsız SSM tamponu, ölçümden önce ve sonra yıkamak için kullanılır (aktif olmayan tampon). Arabellek uyuşmazlıklarını önlemek için, alt tabakayı içeren arabelleği hazırlamak için etkinleştirilemeyen arabelleği kullanın (arabelleği etkinleştirme). Substrat, seyreltmeleri önlemek için doğrudan bir toz olarak veya yüksek konsantrasyonlu bir stoktan küçük bir hacimde eklenebilir.
  9. RT'de 1.24.
  10. Proteolipozomları 1:5 ile 1:100 (proteoliposomes:buffer, (v:v)) arasında aktive olmayan SSM tamponunda seyreltin (burada 1:20).
  11. Sonicate proteoliposomes için 20-30 s veya 3 kez 10 s, gerekirse sonication arasında buz üzerine yerleştirme. Burada 45 kHz'de bir su banyosu sonicator kullanıldı.
  12. Seyreltilmiş sonik proteolipozom örneğinin 5-10 μL'lik kısmını dokunmadan sensörün yüzeyine uygulayın.
  13. 2.000 ila 3.000 x g arasında bir hız kullanarak rt'de çözelti ile yongaları 30 dakika santrifüj edin.
    NOT: Düz tabanlı 50 mL tüpler kullanın. Sensör yongalarını cımbız kullanarak dikkatlice dik yerleştirin. 6 kuyulu plakalar ve plaka tutuculu bir santrifüj de kullanılabilir.
  14. Sensör çiplerini aynı gün kullanın.

3. Çözünen taşımanın ölçülmesi: doygunluk koşullarının belirlenmesi

NOT: İlke kanıtı olarak, bu deneyler yukarıda açıklanan protokolün ardından lipozomlarda yeniden inşa edilen bakteriyel kolin taşıyıcı kullanılarak gerçeklendirilmiştir. Nanobodiies tarafından inhibisyon ölçümünden önce substrat kolin doygunluk koşullarını belirleme adım adım süreci burada gösterilmiştir.

  1. Etkinleştirilmeyen SSM tamponunun 1-2 L'sını hazırlayın.
    NOT: Tüm ölçümler boyunca tüm etkinleştirme ve etkinleştirmeyen tamponlar için aynı SSM tampon stoğunu hazırlayın ve kullanın.
  2. 10 temiz tüp alın ve her birine 10 mL aktif olmayan SSM tamponu aktarın.
  3. Aktif SSM tamponlarını hazırlamak için alt tabakayı 3.2 adımından itibaren, beklenen yarım maksimum konsantrasyonun etrafında bir dizi konsantrasyon kullanarak (burada 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 mM kolin) ekleyin. Seyreltmeleri önlemek için yüksek konsantrasyonda bir stok kullanın.
  4. SSM makinesini aç.
  5. SSM yazılımını başlatın ve makinenin otomatik olarak başlatılmasına izin verin. Veriler için kaydetme yolunu ayarlayın ve Tamam düğmesine basarak onaylayın. İş akışı seçeneklerinde standart İlk Temizleme İletişim Kuralı'nı seçin ve Çalıştır'ı tıklatın.
  6. Proteoliposome kaplamalı çipi sokete monte edin, çipi kilitlemek için kolu hareket ettinin ve monte edilen çipi kapakla kapatın.
  7. İş akışında CapCom programını seçin ve iletkenliği ve kapasitansı belirlemek için Çalışmasına izin verin. İletkenliğin 5 nS'nin altında olduğunu ve ölçüm için kullanmadan önce kapasitansının 15 ila 35 nF arasında olduğunu onaylayın.
    NOT: 3 mm çip kullanırken üretici tarafından 15-35 nF kapasitans değeri ve 5 nS'nin altında iletkenlik önerilir.
  8. Etkinleştirme çözümlerini şişelere aktarın ve tamponları prob örnekleyicisine yerleştirin.
  9. Aktive olmayan tamponu bir rezervuara aktarın ve sağdaki rezervuar konumunda çip tutucunun yanına yerleştirin.
  10. Etkinleştirilmeyen (B), etkinleştirmeyen (A) ve etkinleştirilmeyen (B-A-B sırası) çözümleri ve üç ölçüm gerçekleştiren ve 3.3 adımında hazırlanan 10 arabelleğin tümü için bir sonraki etkinleştirme arabelleğine taşınan bir döngü kullanarak iş akışı için bir protokol oluşturun. B-A-B dizisi için 1 s - 1 s - 1 s akış sürelerini kullanarak 200 μL/s'de varsayılan akış hızını kullanın. Ölçümü başlatmak için Yürüt'ü tıklatın.
    NOT: Tipik bir deney, aktive olmayan (B), etkinleştirme (A) ve etkinleştirilmeyen (B) çözümlerin sıralı akışından oluşur (B-A-B olarak yazılır; bkz. Şekil 1A). Sensördeki hareketsiz proteolipozomlar çözeltilerle yıkanacaktır. Bu nedenle, B-A çözelti değişimi, elektrojenik taşıma reaksiyonunu yönlendiren bir substrat konsantrasyon gradyanı oluşturur.
  11. Protokolü kaydedin ve Yürüt düğmesine tıklayarak iş akışının çalışmasına izin verin. Aynı tür deneyi yapın, ancak protein içermeyen lipozomlar kullanarak. Bu, arka plan akımlarının yoğunluğunu göstereceği için son derece önemlidir. Proteolipozomlarla ölçülen elektrojenik taşıma verilerini analiz ederken bu dikkate alınmalıdır (Şekil 1C).
  12. Ölçülen akım ile zamanı çizmek için veri analizi için tercih edilen yazılımları kullanın. Tepe akımını manuel olarak okuyun veya yazılımı kullanıyorsanız, etkinleştirme arabelleği ekleme aralığında en yüksek yükseklik tahmini işlevini kullanın.
  13. Doğrusal olmayan regresyon yoluyla substratın EC50'sini belirlemek için pik akımını substrat konsantrasyonuna karşı çizin (Şekil 1B,C). Tepe akımının maksimum değere ulaştığı en düşük konsantrasyonu okuyun, bu konsantrasyon doygunluk koşullarına karşılık gelir.
    NOT: Hareketsiz kalan proteolipozomların sayısının çipten yongaya değiştiğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu varyasyon, aynı ölçüm koşullarındaki tepe akımları farklı genlikler göstereceği için belirgindir. Bu nedenle, ölçümleri farklı talaş preparatları arasında karşılaştırmadan önce her çip üzerinde yapılan ölçümlerin mevcut genliklerini ayrı ayrı normalleştirmek gerekir.

4. Inhibitör ve inhibitör olmayan nanobodların seri sınıflandırılması

NOT: Bu bölümde, özellikle bakteriyel kolin taşıyıcısına bağlanan nanobodies varlığında kolin taşımacılığının nasıl ölçülecekleri gösterdir. Nanobodilerin varlığında daha küçük tepe akımları taşıma inhibisyonunu gösterir. İnhibisyonel olmayan nanobodies substrat taşımacılığını etkilemez, yani tepe akım sinyalinin azalmasına neden olmaz.

  1. 1-2 L etkin olmayan SSM tamponu hazırlayın.
  2. Aktif olmayan SSM tamponunun 50 mL'lik kısmını temiz bir tüpe aktarın. Substrat kolinini 5 mM'lik son konsantrasyona (doygunluk koşulları) ekleyin. Pozitif kontrol ölçümü için bunu kullanın.
  3. Etkinleştirilmeyen SSM tamponunun 10 mL'lik kısmını temiz bir tüpe aktarın. Alt tabaka kolinini 5 mM'lik (doygunluk koşulları) son konsantrasyona ekleyin ve 500 nM'lik son konsantrasyona nanobody ekleyin.
  4. Etkinleştirme çözümlerini hazırlamak için her nano gövde için 4.3 adımını yineleyin.
    NOT: Saflaştırılmış nanobodies SSM arabellekten farklı bir arabellekte yeniden harcanırsa, etkinleştirme ve etkinleştirmeyen arabelleklere eklenmesi arabellek uyumsuzluğuna yol açar. Yüksek gürültüye yol açabileceğinden tampon uyuşmazlığı önlenmelidir. Saflaştırılmış nanobodies tamponunun SSM tamponu ile takas edilmesi bu sorunu önlemeye yardımcı olabilir. Ayrıca, doygunluk koşullarına ulaşmayı sağlayan nanobody konsantrasyonlarının kullanılması önerilir. Nanobodilerin bağlama sabitlerinin genellikle 100 nM'nin altında olduğu göz önüne alındığında, bu deney için 500 nM'lik bir nano gövde konsantrasyonu önerilir. Bununla birlikte, optimum konsantrasyonlar için ön tarama yapmak önemlidir.
  5. SSM makinesini çalıştırın ve proteolipozom kaplı çipin kapasitansını ve iletkenliğini 3.4-3.7 adımlarında açıklandığı gibi ölçün.
  6. Aktif hale getirici çözeltiyi nanobody olmadan bir şişeye aktarın ve tamponu prob örnekleyicisine yerleştirin. Aktif olmayan tamponu nanobody olmadan bir rezervuara aktarın ve prob örnekleyicisine yerleştirin.
  7. Nanobodies içeren aktive edici çözeltileri şişelere aktarın ve tamponları prob örnekleyicisine yerleştirin. Nanobodies içeren aktif olmayan tamponları şişelere aktarın ve tamponları prob örnekleyicisine yerleştirin.
  8. Etkinleştirilmeyen (B), etkinleştirmeyen (A) ve etkinleştirilmeyen (B) çözümler (B-A-B sırası) dizisini kullanarak iş akışı için bir protokol oluşturun.
  9. Aşağıdakileri gerçekleştiren bir döngü oluşturun: nanobody içermeyen tamponlar kullanarak B-A-B dizisinin üç ölçümü, nanobody içeren tamponlarla B-A-B dizisinin iki ölçümü, nanobody ile inkübasyon için 120 s gecikme süresi, daha sonra nanobody içeren tamponlarla B-A-B dizisinin 3 ölçümü.
  10. İş akışını kaydedin ve Yürüt düğmesini tıklatarak çalışmasına izin verin.
    NOT: Bu iş akışı, B-A-B protokolünü nanobody olmadan (B) ve aktif tamponları (A) kullanarak 3 kez çalıştırarak taşımanın başlangıç koşullarını ölçecektir (Şekil 1B,C), ardından nanobodiies içeren aktif olmayan ve etkinleştirici tamponlarla B-A-B protokolünü 5 kez çalıştırarak taşıma üzerindeki nanobody etkisinin ölçülmesi (Şekil 2A ). İkinci sıra bağlayıcı kinetikler nanobodies ve hedef proteinlerinin etkileşimini belirler. Bu nedenle, nanobodilerin çip üzerindeki proteolipozomlardaki taşıyıcılara bağlanmaları için yeterli zaman vermek için B-A adımında bir zaman gecikmesi kullanmak önemlidir. Optimum süreler nanobody konsantrasyonuna bağlıdır, yani daha düşük konsantrasyonlarda daha uzun süreler gerekir. Sistemi yeni koşullara uyarlamak için ilk iki ölçüm gereklidir ve ikinci çalıştırma 120 s gecikme süresinden sonra yapılmalıdır. Veri analizi için yalnızca aşağıdaki üç ölçüm kullanılmalıdır.
  11. Ters çevrilebilir şekilde bağlanmış nano gövdeyi yıkamak için bir dizi etkinleştirilmeyen (B), etkinleştirmeyen (A) ve etkinleştirilmeyen (B-A-B dizisi) çözümleri ve 5 ölçümden oluşan bir döngü kullanarak iş akışı için yeni bir protokol oluşturun.
    NOT: İsteğe bağlı olarak, nanobodilerin yavaş kinetiklerle ayrışmasına izin vermek için bir kuluçka adımı ekleyin.
  12. İş akışını kaydedin ve Yürüt düğmesini tıklatarak çalışmasına izin verin.
  13. Ölçümlerin son tepe akımını adım 4.10'daki yalnızca ilk substrat ölçümüyle karşılaştırın. Nanobody başarıyla yıkandı ve tepe akımı başlangıç değerine ulaşırsa ilk koşullar yeniden belirlendi, aksi takdirde 4.12-4.13 adımlarını tekrarlayın veya yeni bir yongaya değiştirin.
  14. 4.6-4.13 adımlarını tekrarlayın ve her nano gövde ekranı için ayrı yongalar kullanın (Şekil 2C) veya aynı çipi kullanarak birden fazla nanobodies ile tekrarlayın (Şekil 2D).
  15. Ölçülen akım ile zamanı çizmek için veri analizi için tercih edilen yazılımları kullanın. En yüksek akımı el ile okuyun veya varsa, kullanılan yazılımda, etkinleştirme arabelleği ekleme aralığında en yüksek yükseklik tahmini işlevini otomatik olarak seçin.
  16. Tepe akımını, önceki substrat ölçümüne bağlı olarak nano gövdenin varlığında normalleştirin. Bir histogramdaki tepe akımlarını çizin ve substrat ölçümlerinin tepe akımlarını, inhibitör nanobodies'i tanımlamak için nanobodies (Şekil 2C, D) varlığında ölçülen tepe akımlarıyla karşılaştırın.
    NOT: Nanobody'nin önceki ölçümden yokluğunda pik akım göz önünde bulundurularak, nanobody ile çalıştırılan her bir bireyin belirlenen tepe akımlarının normalleştirilmesi yapılmalıdır. Ayrıca, hareketsiz kalan proteolipozomların sayısı çipten yongaya değiştiğinden, ölçümleri farklı talaş preparatları arasında karşılaştırmadan önce her çipte yapılan ölçümlerin mevcut genliklerini ayrı ayrı normalleştirmek önemlidir.

5. inhibitör nanobodies ileIC 50 ölçümü

NOT: inhibitör nanobodileri tanımladıktan sonra, yarı maksimal inhibitör konsantrasyonlarını belirlemek mümkündür (IC50). Bu, kolinlerin sabit konsantrasyonda taşınmasının ölçülmesi ve inhibitör nano gövdenin konsantrasyonlarının değişmesiyle yapılır.

  1. Etkinleştirilmeyen SSM tamponunun 1-2 L'sını hazırlayın.
  2. Aktif olmayan SSM tamponunun 50 mL'lik kısmını temiz bir tüpe aktarın. Substrat kolinini 5 mM'lik son konsantrasyona (doygunluk koşulları) ekleyin. Pozitif kontrol için etkinleştirici çözüm olarak bunu kullanın.
  3. 8 temiz tüp alın ve her birine 5 mL aktive olmayan çözelti ekleyin. Substrat kolinini 5 mM'lik son konsantrasyona (doygunluk koşulları) ekleyin. Inhibitör nano gövdeyi beklenen IC50 aralığındaki konsantrasyonlarda tüplere ekleyin (burada 500 nM - 1 nM).
  4. 8 temiz tüp alın ve her birine 10 mL aktive olmayan çözelti ekleyin. Her tüpe ayrı ayrı 5.3 adımında olduğu gibi aynı konsantrasyonda inhibitör nanobody ekleyin. Bu, etkinleştirilmeyen arabelleğe karşılık gelir.
    NOT: Bu, aynı inhibitör nano gövdenin farklı konsantrasyonlarında bir dizi aktive edici ve aktive olmayan tampon çifti üretecektir.
  5. SSM kurulumunu başlatın ve proteolipozom kaplı çipin kapasitansını ve iletkenliğini 3.4-3.7 adımlarında açıklandığı gibi ölçün.
  6. Aktif hale getirici çözeltiyi nanobody olmadan bir şişeye aktarın ve prob örnekleyicisine yerleştirin. Aktif olmayan tamponu nanobody olmadan bir rezervuara aktarın ve sağdaki talaş tutucunun yanındaki rezervuar konumuna yerleştirin.
  7. Nanobodies içeren aktive edici çözeltileri şişelere aktarın ve tamponları prob örnekleyicisine yerleştirin. Nanobodies içeren aktif olmayan tamponları şişelere aktarın ve tamponları prob örnekleyicisine yerleştirin.
  8. Etkinleştirilmeyen (B), etkinleştirmeyen (A) ve etkinleştirilmeyen (B) çözümler (B-A-B sırası) dizisini kullanarak iş akışı için bir protokol oluşturun. Her konsantrasyonu 2 kez ölçmek, 120 s kuluçkaya yatırmak ve 3 kez daha ölçmek için bir döngü ekleyin. İş akışı, yalnızca substratın pozitif kontrolü ve ardından nano gövdenin en düşük konsantrasyonu ile başlayacaktır. Her nano gövde ölçümü, bir sonraki daha yüksek nano gövde konsantrasyonuna geçmeden önce, ilk tepe genliğini geri yüklemek için pozitif kontrolün sadece substratla daha sonra ölçüleceği şekilde takip edilecektir.
    NOT: İkinci sıra kinetik nanobodies bağlamasını belirler. Bu nedenle, B-A adımında bir zaman gecikmesi kullanmak önemlidir. Optimum süreler nanobody konsantrasyonuna bağlıdır, yani daha düşük konsantrasyonlarda daha uzun süreler gereklidir; burada tatmin edici sonuçlarla 120 s kullanıldı.
  9. Ölçülen akım ile zamanı çizmek için veri analizi için tercih edilen yazılımları kullanın. Tepe akımını manuel olarak okuyun veya yazılım kullanıyorsanız, etkinleştirme arabelleği ekleme aralığındaki tepe yüksekliği tahmini işlevini seçin (Şekil 3A). Doğrusal olmayan regresyon yoluyla IC50'yi belirlemek için pik akımları nanobody konsantrasyonuna karşı çizin (Şekil 3B).
    NOT: Ölçümleri farklı talaş preparatları arasında karşılaştırmadan önce her bir çip için gerçekleştirilen ölçümlerin mevcut genliklerini normalleştirin.

6. Sensörlerin temizlenmesi

  1. Tek sensör yongalarını 10 mL damıtılmış su ile kullandıktan sonra durulayın.
  2. Çipi bir kağıt mendile dokunarak kurulayın.
  3. Çipin sensör boşluğunu 100 μL saf izopropanol ile doldurun ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. Saf izopropanol içine bir pamuklu çubuk yerleştirin ve 1-3 dakika kuluçkaya yatırın.
  5. Önceden sulanmış pamuklu çubukları kullanın ve kalıntıları gidermek için sensörün yüzeyinde basınç olmadan hafifçe döndürün.
  6. Sensörü 5 mL saf izopropanol ile durulayın.
  7. Sensörü 10 mL damıtılmış su ile durulayın.
  8. Çipi bir dokuya dokunarak sensörü kurutun.
  9. Sensörün RT'de bir gecede kurumasına izin verin ve kuru koşullar altında RT'de saklayın.
    NOT: Sensörler temizlendiğinde ve düzgün depolandığında 4-5 kata kadar yeniden kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SSM tabanlı elektrofizyoloji, elektrojenik taşıyıcıların karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada sunulan protokolde, sekonder bir taşıyıcıyı (burada bakteriyel kolin symporter) hedefleyen nanobodileri inhibitör ve inhibitör olmayan özelliklerine göre sınıflandırmak için SSM tabanlı elektrofizyolojinin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Bu tekniğin en kullanışlı özelliklerinden biri, birden çok arabellek koşulunun yüksek verimli taranmasına izin veriyor olmasıdır. Bu özel özellik, bağlayıcıların seçi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan teknik, elektrojenik taşıyıcıları hedefleyen inhibitör ve inhibitör olmayan özelliklere sahip nanobodları sınıflandırır. Substrat taşımacılığının değerlendirilmesi, proteolipozomların zarlarına gömülü taşıyıcı aracılığıyla yüklerin hareketinin tespit edilmesi nedeniyle mümkündür. Bir deneyin kurulumu sırasındaki kritik adımlardan bazıları, lipozomlardaki aktif proteinin yeniden uzlaştırılması, SSM yongalarında kararlı monolayerlerin hazırlanması ve bağlı nanobody moleküllerini çıkarmak için yıkama protokol...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zürih Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji Enstitüsü'nden Cedric A. J. Hutter ve Markus A. Seeger'a ve Basel Üniversitesi Biozentrum'dan Gonzalo Cebrero'ya sentetik nanobodies (siyadlar) üretimindeki işbirliği için teşekkür ederiz. Nanion Technologies'den Maria Barthmes ve Andre Bazzone'a teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF) (PP00P3_170607 ve NANION Research Grant Initiative tarafından C.P.'ye desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1-oktadekanetiol çözeltisiSigma AldrichO1858-25ML
1,2-difitanoyl-sn-glisero-3-fosfokolinAvanti Polar Lipidler850356C-25mg
Biyo-Boncuklar SM-2 Adsorban (Polistiren adsorban boncuklar)BioRad# 152-3920
PD 10 Tuz Giderme KolonlarıGE HealthcareGE17-0851-01
Filtre 200 nm membranWhatman NucleoporeWHA800282
2-PropanolMerck33539-1L-R
n-DekanSigma Aldrich8034051000
n-dodesil-ß-D-maltosid (DDM)Avanti Polar Lipidler850520P-25g
Sodyum KlorürAppliChem131659.1211
(SSM kurulumu) SURFE2R N1Nanion-----
SURFE2R N1 Tek Sensör ÇipleriNanion# 161001
Trizma BaseSigma AldrichT1503
E. coli Polar Lipid ÖzüAvanti Polar Lipidler100600C
Yumurta PC L -&alfa; -fosfatidilkolin Avanti Polar Lipidler840051C

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
  2. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  3. Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641(2017).
  4. Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216(2020).
  5. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
  6. Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296(2017).
  7. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  8. Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
  9. Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
  10. Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
  11. Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
  12. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
  13. Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).
  14. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317(2018).
  15. McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
  16. Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
  17. Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228(2016).
  18. Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343(2014).
  19. Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
  20. Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
  21. vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
  22. Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
  23. Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273(2018).
  24. Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
  25. Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
  26. Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187(2015).
  27. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  28. Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
  29. Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
  30. Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
  31. Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
  32. Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).
  33. Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392(2016).
  34. Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183(2020).
  35. Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
  36. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
  37. Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064(2020).
  38. Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ta y c nhibisyonuSSM ElektrofizyolojisiElektrojenik Ta y c larNanobody TaramaProteolipozom AnaliziMembran Proteini nhibisyonuTa ma Kineti iIC50 Belirleme

İlgili makaleler