Genetik Olarak Tasarlanmış Anopheline Sivrisineklerinin Küçük Kafes Laboratuvar Denemeleri

Sıtmaya neden olanlar gibi vektör kaynaklı patojenlerin bulaşmasını kontrol etmek için genetik olarak tasarlanmış sivrisineklere dayalı stratejiler takip ^{edilmektedir1}. Bunlar arasında , Anopheles sivrisineklerinin sayılarını ve yoğunluklarını azaltmayı amaçlayan teknolojiler (popülasyon bastırma) veya 2) vektörlerin patojen iletimini önleyen efektör genleri ifade etmek için tasarlandığı insan hastalığından sorumlu parazitleri (popülasyon modifikasyonu, değiştirilmesi veya değiştirilmesi) iletme yeteneğini bozmayı amaçlayan teknolojiler yer almaktadır. Bu genetik yaklaşımlar CRISPR/Cas9 tabanlı gen tahriklerinin ortaya çıkmasıyla desteklenmiştir, parazit ileten sivrisineklerde yük özelliklerinin etkili bir şekilde yayılmasında ve kafesli popülasyonlarda anti-parazitik efektör moleküllerde kavram kanıtı ile desteklenmiştir.

Küçük laboratuvar kafes denemeleri, transgenik suşların özelliklerini, saha uygulamalarına yönelik daha fazla gelişimlerine yönelik aşamalı bir yaklaşımın bir parçası olarak değerlendirmek için ilk adımı temsil ^eder2. Spesifik sonuç değerlendirmeleri arasında, tanıtılan DNA'nın rekabet ortamında heritability, fenotipin penetrance ve ekspresyitesi ve stabilitesi sayılıyor. İlgili deneysel tasarım özellikleri arasında kafeslerin büyüklüğü, sivrisinek yoğunlukları, çoğaltma sayısı, örtüşen veya örtüşmeyen nesiller, yaş yapılandırılmış hedef popülasyonları, mühendislik suşlarının tek veya çoklu salınımları, sadece erkeklere özel, sadece kadın veya karma cinsiyet salınımları, salınım oranları, kan unu kaynakları (yapay veya canlı hayvan) ve tarama prosedürleri yer almaktadır.

Burada, anopheline sivrisineklerinin inundative salınımlar (gen tahrik sistemi yok) ve Cas9 endonucleases tarafından aracılık edilen otonom gen tahrik sistemlerini taşıyan ve RNA'lara (gRNA) rehberlik eden suşlarını değerlendirmek için kullanılan protokolleri açıklıyoruz. Bu protokollerin uygulamaları Pham ve ark. (2019) ², Carballar-Lejarazú ve diğerleri. (2020) ³ ve Adolfi ve diğerleri. (2020) ⁴.

İnundative salınım denemeleri, çok sayıda transgenik sivrisineğin vahşi bir popülasyona birden fazla salınımını takiben Mendelian mirası altında tasarlanmış bir transjenin yayılma hızını değerlendirir. Transjenin bir tahrik sistemine bağlanması olmadan, inundative release denemelerinden elde edilen veriler, stabilize edilmiş bir popülasyondaki ilgi transgenesinin zindeliği ve dinamiği hakkında bilgi sağlar.

Sivrisinek popülasyonları otonom bir gen tahrik sistemi içerdiğinde, transgene'in tek bir girişinden sonra baskın belirteç artış oranını belirleyerek istenen transjenin yayılma dinamiklerini değerlendirmek için küçük kafes denemeleri tasarlanmıştır. Otonom gen tahrik elemanları, Cas9 çekirdeğini, gRNA'yı ve baskın işaretleyiciyi sonraki nesillerde aktif olacak şekilde kodlayan genleri taşır.

'Örtüşen' nesiller, yaş yapılandırılmış bir sürekli popülasyon oluşturmak için aynı kafeste birden fazla neslin aynı anda varlığını ifade ederken, 'örtüşmeyen' her ardışık kafesli popülasyonda tek ayrı nesilleri ifade ^eder2. Gen tahrikli kafes deneyleri, tahrik (dönüşüm) oranının ilk dinamikleri belirlenebildiğinde sonlandırılabilir (yapıya bağlı olarak 8-10 nesil) ve sivrisinek popülasyonu içindeki transjenin kısa vadeli stabilitesi hakkında bilgi sağlarken, baskın işaretleyici frekansları tam girişe ulaştığında veya yakınsa (gen tahrik sisteminin en az bir kopyasını taşıyan her sivrisinek) ne olduğunu ortaya ortaya atamayabilirler.

Hayvan etiği beyanı
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerilere uygun olarak gerçekleştirildi. Protokoller Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmıştır (Hayvan Refahı Güvence Numaraları A3416.01).

1. Gensiz tahrik sivrisinekleri üzerinde inundative salınım denemeleri (Şekil 1)

1. Kafes kurulumu ve bakımı
   1. Art arda üç hafta boyunca her kafese 60 ikinci instar vahşi tip (WT) larva ekleyerek üç set üç üçlik 0.216 ^m3 kafes kurun.
      NOT: İkinci instar larvaların cinsiyetini ışık mikroskopisi ile belirlemek mümkün değildir, bu nedenle her kafese eklenen örnekler hem erkeklerden hem de dişilerden oluşacaktır.
   2. Her hafta, yetişkin dişilere kan unu kaynağı olarak anestezi edilmiş fareler (Şekil 2A) ve kan unu sonrası 3 gün sonra bir yumurtlama kabı sağlayın.
      NOT: Alternatif bir yapay besleme aparatı kullanılabilirken, kan değerleri için canlı uyuşturuldu fareler sağlamak, bu büyük (0.216 ^m3) kafes formatlarında daha iyi sivrisinek besleme performansı sağlar. Bu, onaylanmış bir hayvan kullanım protokolü ve farelerin kullanımı için ilgili (örneğin, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, IACUC) onayı gerektirir.
      NOT: Bireysel fareler 4 mg / fare ketamin HCl ve 0.4 mg / fare ksilazinin karışımı ile uyuşturulur. Hayvanlara bu karışımın 0.1 - 0.5 mL arasında enjekte edilir.
   3. Her kafesten haftalık yumurtaları yumurtadan çıkar ve mortaliteyi dengelemek için kendi kafeslerine geri dönmek için rastgele 60 ikinci instar (L2) larva seçin (hafta 4-8).
      NOT: Kafeslerde 'başlangıç aşaması' olarak adlandırılan istikrarlı ve dağıtılmış bir yaş yapılandırılmış popülasyon oluşturmak için 1.1.1 ile 1.1.3 arası adımlar gereklidir.
   4. 9. haftada, istenen erkek salınım oranının serbest bırakılması için 1.1.1 adımında rastgele üç taraflı olarak monte edilen kafesleri atayın.
      1. Deney boyunca tutarlılığı değerlendirmek için kontrol olarak bir üçlü kafes kümesi belirleyin.
      2. İstenen her salınım oranı için bir üçlü ayar seti belirleyin (örneğin, 1:1 veya 1:0.1 transgenik:WT erkekler).
         NOT: Bu nokta 'Deneysel Faz' olarak adlandırılır.
2. Çoğaltma ve serbest bırakma oranları
   1. Kontrol kafeslerine haftalık 60 WT pupa (30 erkek ve 30 kadın) ekleyin.
   2. 1:1 oranını korumak için, her bir kafese haftalık 30 transgenik erkek pupası ve 60 (30 erkek ve 30 kadın) WT pupa ekleyin.
   3. 1:0.1 oranını korumak için, her bir kafese haftalık 300 transgenik erkek pupası ve 60 (30 erkek ve 30 kadın) WT pupa ekleyin.
      NOT: Kafeslere yabani sivrisineklerin sürekli eklenmesi, yaşa bağlı yetişkin ölümleri nedeniyle haftalık olarak azalması beklenen kafes yoğunluğunu korur.
3. Fenotiplerin taranır
   1. Rastgele her kafesten toplam 300 larva seçin. Floresan filtrelerle donatılmış bir stereo mikroskop kullanımı ile larva ve pupal aşamalarında floresan baskın belirtecin ekspresyöneti için ekran ve elde eden yetişkinlerin cinsiyetini puanlamak (Şekil 3).
      NOT: Fenotipik tarama, sivrisineklere entegre transgene yapısında bulunan baskın işaretleyiciye bağlı olacaktır (örneğin, Discosoma sp. kırmızı floresan protein [DsRed], siyan floresan protein [CFP], yeşil floresan protein [GFP]) ve ifadesini yönlendiren organizatörde (sivrisinek transgenezinde en çok kullanılan, gözlerde ve sinir kordonunda 3xP3 promotör sürüş ifadesidir).
   2. Deneysel tasarımda tanımlanan sonuç parametrelerinin gerektirdiği kadar nesil boyunca bu protokolü izleyin.
      NOT: Deneme genellikle tüm sivrisineklerde transjenin en az bir kopyası olduğunda (baskın floresan işaretleyicinin varlığına göre belirlenir) veya bir kafesteki transgenik-WT sivrisineklerinin oranı stabilize edildiğinde ve birkaç (3-5) nesilden sonra büyük ölçüde dalgalanmadığında sonlandırılır.

2. Gen tahrikli sivrisineklerin örtüşen nesil denemeleri (Şekil 4)

NOT: Gen tahrik sistemleri taşıyan sivrisinekler yazılı ve gözden geçirilmiş protokoller gerektirir ve gerektiğinde Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) veya eşdeğeri ve diğerleri tarafından onaylanmalıdır. Sivrisinek muhafazası (ACL 2⁺ seviyesi) önerilen prosedürleri izlemelidir5,6,7. Özellikle, gen tahrik deneyleri iki sıkı hapsetme stratejisi kullanmalıdır. Birincisi genellikle organizmalar ve çevre arasındaki fiziksel engellerdir (Bariyer Stratejisi). Bu, sivrisineklerin kaçamamasını sağlamak için güvenli bir böcek ve standart çalışma prosedürlerine (izleme dahil) sahip olmayı gerektirir. İkinci hapsetme stratejisi Moleküler, Ekolojik veya ^Üreme5 olabilir.

1. Kafes kurulumu
   1. İstenen her transgenik:WT erkek salınım oranı için iki set triplikat 0.216 ^m3 kafes kurun.
      1. 1:1 erkek salınım oranı elde etmek için, her bir kopya kafese pupa aşamasında 120 transgenik erkek, 120 WT erkek ve 120 WT dişi ekleyin.
      2. 1:10'luk bir salınım oranı elde etmek için, her bir çoğaltma kafesine pupa aşamasında 12 transgenik erkek, 120 WT erkek ve 120 WT dişi ekleyin.
         NOT: Farklı salınım oranları test edilebilir (1:1, 1:3, 1:10, vb.) ve deneyleri başlatmak için kullanılan sivrisineklerin sayısı buna göre değişir. Bununla birlikte, düşük sayıların verilerin istatistiksel değerlendirmesi üzerindeki etkilerini göz önünde bulundurmak önemlidir.
2. Nüfus bakımı ve taraması
   1. Her kafeste 4-7 günlük dişilere uyuşturuldulu fareler kullanarak bir kan unu sağlayın (Şekil 2A).
   2. Kan yemeğinden üç gün sonra, her kafese bir yumurtlama kabı yerleştirin.
   3. Yumurtaları bir larva tepsisinde yumurtadan çıkar, her kafesten rastgele ~240 ilk başlangıç (L1) larvasını seçin, yetişkinliğe kadar yetiştirin ve kendi kafeslerine geri döndürün.
   4. 2.2.1. adımda açıklandığı gibi, yeni ortaya çıkan yetişkinler için her 3-4 günde bir ek (2-3) kan yemeği sağlayın.
      NOT: Sonraki nesillerin hiçbirinde ek transgenik erkek eklenmez.
   5. Her kafesten rastgele toplam 300 larva seçin ve floresan stereo mikroskop kullanarak larva ve pupal aşamalarında baskın belirteç fenotipinin varlığını tarayın ve seks için ortaya çıkan yetişkinleri puanlayın (Şekil 3).
      NOT: Daha önce olduğu gibi, fenotipik tarama gen tahrik sistemine dahil edilen ve transgenik sivrisineklere (örneğin, DsRed, CFP veya GFP) entegre edilen baskın işaretleyiciye ve promotöre bağlı olacaktır. Hedeflenen genlerin homozigot veya heteroallik bozulmaları görünür bir fenotiple (örneğin, göz pigmentasyonu ile ilgili genler) sonuçlanırsa, bu özelliğin taranması, değiştirilen fenotipi görselleştirmenin en kolay olduğu aşamaya bağlı olacaktır.
   6. Deneysel tasarımda tanımlanan sonuç parametrelerinin gerektirdiği kadar nesil boyunca bu protokolü izleyin.
      NOT: Her nesil (kan unu ile sınırlandırılmış) ~ üç hafta sürer. Deneme genellikle tüm sivrisinekler gen tahrik yapısı için homozigöz olarak kabul edildiğinde veya popülasyonlar gen tahrikli yapının en az bir kopyasını taşıyan sivrisineklerin maksimum yüzdesinde stabilize edildiğinde sona erer.

3. Gen tahrikli sivrisineklerin örtüşmeyen nesil denemeleri (Şekil 5).

1. Kafes kurulumu
   1. Araştırılacak transgeniklerin WT erkeklerine her bir spesifik salınım oranı için üç taraflı 0.005 ^m3 kafes popülasyonları ayarlayın (örneğin, her biri 1:1, 1:3, 1:10 serbest bırakma oranlarıyla kurulan üç üç üçlik kafes seti). Tüm kafesleri eşit sayıda erkek ve dişi ile kurun.
      NOT: Ek Dosya , 0.005 ^m3 koloni kafesinin yapımını gösteren bir videodur.
      1. 1:1 erkek salınım oranı elde etmek için üç çoğaltma kafesinin her birine 50 transgenik erkek, 50 WT erkek ve 100 WT dişi ekleyin.
      2. 1:3 erkek salınım oranı elde etmek için üç çoğaltma kafesinin her birine 25 transgenik erkek, 75 WT erkek ve 100 WT dişi ekleyin.
      3. 1:10 erkek salınım oranı elde etmek için üç çoğaltma kafesinin her birine 9 transgenik erkek, 90 WT erkek ve 100 WT dişi ekleyin.
         NOT: Farklı salınım oranları test edilebilir ve deneyleri başlatmak için kullanılan sivrisineklerin sayısı buna göre değişebilir. Bununla birlikte, düşük sayıda sivrisineklerin istatistiksel analizler üzerindeki etkisini göz önünde bulundurmak önemlidir. Bunlar tek sürümlerdir; sonraki nesillerde ek transgenik erkek eklenmez.
2. Nüfus bakımı ve taraması
   1. Her kafesteki 4-7 günlük dişilere art arda iki gün boyunca yapay bir beslenme aparatı (Şekil 2B) kullanarak kan yemekleri sağlayın.
      NOT: Kadınlar için rutin kan yemekleri, bir besleme cihazından sağlanan ticari olarak mevcut bir kan kaynağından (örneğin, baldır kanı) oluşur. Canlı uyuşturuluz fareler, daha iyi beslenme performansı için sadece daha büyük (0.216 ^m3) kafes formatlarında kan metriyalleri sağlamak için kullanılır.
   2. İkinci kan unu 3 gün sonra bir yumurtlama kabı ekleyin. Üç gün sonra, yumurtlama kaplarını çıkarın.
      NOT: Bu adımda, her kafesten rastgele 5-10 kadın seçilebilir ve gerekirse doğurganlık ve doğurganlık gibi ek fitness parametrelerini değerlendirmek için şişelere ayrı ayrı yerlenebilir.
   3. Kafeste kalan tüm yetişkinleri (ölü ve diri) cinsiyete göre puanlayın ve moleküler analiz için -80 °C'de saklayın.
   4. Yumurtaları yumurtadan çıkar ve yeni nesil için yeni kafesleri doldurmak için 1:1 ve 1:3 oranlı kafeslerden rastgele 200 L1 larva seçin.
      NOT: 1:10 oranlı kafeslerde transgenik bireye başlama sıklığının düşüklüğü nedeniyle, rastgele örnekleme, popülasyonu devam ettirmek için gelecek nesilde aşırı transgenik soy kaybına yol açabilir.
   5. 1:10 kafesleri ve yeterli sayıda transgenik sivrisinek için doğru bir örnekleme sağlamak için, baskın işaretleyici için tüm larvaları tarayın ve yeni kafesleri doldurmak için gözlemlenen transgene frekansını yansıtan 200 larva seçin.
      NOT: 1:10 kafesler% 80'≥ transgene frekansa ulaştıklarında 1:1 ve 1:3 kafesleriyle aynı şekilde tutulabilir.
   6. Derinlemesine bir analiz için her kafesten rastgele 500 larva seçin. Larva ve pupal evrelerinde beklenen belirteç fenotipleri için floresan stereo mikroskop altında tarama yapın ve yetişkinlerin seks puanını (Şekil 3).
      NOT: Dirençli alele oluşumunu izlemek için moleküler olarak daha fazla çaprazlanacak ve analiz edilecek 'olağanüstü' fenotipler seçilebilir.
   7. Bu protokol, deneysel tasarımda tanımlanan sonuç parametrelerinin gerektirdiği kadar nesil boyunca takip edilebilir.
      NOT: Her nesil kan kütlü tarafından sınırlandırılmıştır ve ~ üç hafta sürer. Deneme genellikle tüm sivrisinekler gen tahrik yapısı için homozigöz olarak kabul edildiğinde veya popülasyonlar transgenik sivrisineklerin maksimum yaygınlığında stabilize edildiğinde sona erer. Ve daha önce olduğu gibi, fenotip taraması transgenik sivrisineklere (örneğin, DsRed, CFP, GFP) veya görünür bir fenotip (örneğin, göz pigmentasyonu ile ilgili genler) sundukları takdirde hedeflenen genlere entegre edilen baskın belirteçlere ve promotöre bağlı olacaktır.

Gen dışı tahrik veya otonom gen tahriki modifikasyonları taşımak için üretilen transgenik anopheline sivrisinekleri, Protokoller bölümünde açıklandığı gibi kafes denemeleri için ayarlanır. Burada gösterilen temsili sonuçlar, Pham ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilen kafes denemeleri deneylerinin en iyi performans gösteren kopyalarının fenotip dinamiklerini tasvir eder. (2019) Anopheles stephensi sivrisinekleri için 2. Üç deneme (sırasıyla 1 - 3: inundative non-gen drive, çakışan gen tahriki ve örtüşmeyen gen tahriki), kafesin büyüklüğü (0.216 m3 vs 0.005 m3), hedef popülasyonun yaş yapılandırılmış olup olmadığı, kan unu kaynağı (fareler veya yapay besleyici) ve serbest bırakma oranları gibi farklı parametrelerde farklı parametrelerde değişti. Temsil aracı olarak Şekil 6, yedi nesil boyunca kullanılan üç protokol için de aynı sürüm oranından (1:1) seçilen gözlemlenen verileri görüntüler.

Yazarların hiçbir açıklaması yok.