Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Çeviri Yönetmeliğinde RNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Optik Cımbız

5.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62589

⸱

12 Şubat 2022

 ,  , 
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty, Julius-Maximilians University Würzburg

Bu makalede

Özet

Bu protokol, optik cımbız kullanarak RNA-protein etkileşimlerini incelemek için eksiksiz bir deneysel iş akışı sunar. Optik cımbızın konfokal mikroskopi ile kombinasyonu da dahil olmak üzere çeşitli olası deneysel kurulumlar özetlenmiştir.

Özet

RNA, işlevleri için gerekli olan ve böylece hücredeki çeşitli süreçleri etkileyebilen çeşitli yapısal kıvrımları benimsemiştir. Ek olarak, bir RNA'nın yapısı ve işlevi proteinler, metabolitler veya diğer RNA'lar gibi çeşitli trans-etkili faktörler tarafından modüle edilebilir. Örneğin, karek değiştirme RNA molekülleri, ribozomları alternatif bir açık okuma çerçevesine yönlendiren ve böylece gen anahtarları olarak hareket eden kodlama bölgelerinde bulunan düzenleyici RNA'lardır. Ayrıca proteinlere veya diğer trans faktörlere bağlanmasından sonra farklı kıvrımları benimseyebilirler. RNA bağlayıcı proteinlerin çevirideki rolünü ve RNA yapısını ve stabilitesini nasıl modüle ettiklerini incelemek için, bu RNA-protein komplekslerinin etkileşim ve mekanik özelliklerini aynı anda incelemek çok önemlidir. Bu çalışma, RNA-protein komplekslerinin konformasyonsal ve termodinamik manzarasını yüksek çözünürlükte keşfetmek için tek moleküllü floresan bağlantılı optik cımbızın nasıl kullanılacağını göstermektedir. Örnek olarak, SARS-CoV-2 programlı ribozomal çerçeve değiştirme elemanının çinko-parmak antiviral proteininin trans-etkili faktör kısa izoformu ile etkileşimi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Ek olarak, floresan etiketli ribozomlar konfokal ünite kullanılarak izlendi ve bu da sonuçta çeviri uzamasının incelenmesini sağlayacaktı. Floresan bağlantılı OT tahlili, çeviriyi düzenleyen çeşitli RNA-protein komplekslerini veya trans-etkili faktörleri araştırmak için yaygın olarak uygulanabilir ve RNA tabanlı gen düzenleme çalışmalarını kolaylaştırabilir.

Giriş

Genetik bilgilerin DNA'dan proteinlere mRNA'lar yoluyla aktarılması, hücrelerin içindeki makromoleküler etkileşimler yoluyla tüm seviyelerde hassas bir şekilde düzenlenen karmaşık bir biyokimyasal süreçtir. Çevirisel düzenleme için, RNA-protein etkileşimleri çeşitli uyaranlara ve sinyallere hızlı bir şekilde tepki vermek için kritik bir rol oynar1,2. Bazı RNA-protein etkileşimleri mRNA stabilitesini etkiler ve böylece bir RNA'nın çevirisel olarak aktif olduğu zamanı değiştirir. Diğer RNA-protein etkileşimleri stop-codon readthrough, bypass veya programlanmış ribozomal frameshifting (PRF)3,4,5,6,7 gibi yeniden kodlama mekanizmaları ile ilişkilidir. Son zamanlarda, hücrede ne zaman ve ne kadar yeniden kodlama olacağını dikte etmek için uyarıcı mRNA elemanları ve çeviri makineleri ile etkileşime giren bir dizi RNA bağlayıcı protein (RBP) gösterilmiştir7,8,9,10,11. Bu nedenle, RNA bağlayıcı proteinlerin çevirideki rolünü ve RNA yapısını ve stabilitesini nasıl modüle ettiklerini incelemek için, bu RNA-protein komplekslerinin etkileşim ilkelerini ve mekanik özelliklerini ayrıntılı olarak incelemek çok önemlidir.

Onlarca yıllık çalışma, hız ve doğruluk elde etmek için çeviri makinelerinin RNA ve protein bileşenleri arasındaki karmaşık iletişime dayanan çok adımlı ve çok bileşenli çeviri sürecini incelemek için temel atmıştır12,13,14. Karmaşık düzenleyici olayları anlamanın önemli bir sonraki adımı, çeviri sırasındaki kuvvetleri, zaman ölçeklerini ve yapısal belirleyicileri yüksek hassasiyetle belirlemektir12,15,16,17. RNA konformasyonel dinamiklerinin incelenmesi ve özellikle trans-etkili yardımcı faktörlerin çeviri sırasında RNA yapısı üzerinde nasıl hareket ettiği, optik cımbız veya sıfır mod dalga kılavuzları dahil olmak üzere tek moleküllü araçların ortaya çıkmasıyla daha da aydınlatılmıştır16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.

Optik cımbızlar (OT), transkripsiyon ve çeviri dahil olmak üzere birçok RNA'ya bağımlı dinamik süreci incelemek için uygulanan son derece hassas bir tek molekül tekniğini temsil eder26,27,28,29,30,31,32. Optik cımbız kullanımı moleküler etkileşimlerin, nükleik asit yapılarının ve termodinamik özelliklerin, kinetiğin ve enerjiklerinin ayrıntılı olarak araştırılmasına izin almıştır16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optik cımbız tahlilleri, mikroskobik nesnelerin odaklanmış bir lazer ışını ile tuzağa getirilmesine dayanır. Tipik bir OT deneyinde, ilgi molekülü iki şeffaf (genellikle polistiren) boncuk (Şekil 1A)27 arasında birbirine bağlıdır. Bu boncuklar daha sonra yaylar gibi davranan optik tuzaklar tarafından yakalanır. Böylece moleküle uygulanan kuvvet, boncukun odaklanmış lazer ışınının (tuzak merkezi) merkezinden yer değiştirmesi esas alınarak hesaplanabilir. Son zamanlarda optik cımbız konfokal mikroskopi (Şekil 1B) ile birleştirilerek floresan veya Förster rezonans enerji transferi (FRET) ölçümleri40,41,42 olarak mümkün olmuştur. Bu, eşzamanlı ölçüme ve dolayısıyla kuvvet spektroskopisi ve floresan verilerinin kesin korelasyonuna izin vererek yepyeni bir olası deney alanı açar.

Burada, çevirisel çerçevelemeyi düzenleyen protein-RNA etkileşimlerini incelemek için konfokal mikroskopi ile birlikte optik cımbız kullanarak deneyler gösteriyoruz. Amaç ve kondenser arasında, beş kanallı bir akış hücresi laminer akış ile sürekli numune uygulaması sağlar. Mikroakışkan kanallar aracılığıyla, çeşitli bileşenler doğrudan enjekte edilebilir, bu da uygulamalı zamanı azaltır ve deney boyunca çok az numune tüketimine izin verir.

İlk olarak, OT deneylerinin tasarımına yardımcı olacak temel bir kılavuz önerilmektedir ve avantajların yanı sıra çeşitli kurulumların tuzakları tartışılmaktadır. Daha sonra, örneklerin ve deneysel iş akışlarının hazırlanması açıklanır ve veri analizi için bir protokol sağlanır. Bir örneği temsil etmek için, sars-CoV-2 çerçeve değiştirme RNA elemanını (Şekil 2A) trans-etkili faktörle incelemek için RNA germe deneylerinden elde edilen sonuçları özetliyoruz, çinko-parmak antiviral proteininin (ZAP) kısa izoformunu, viral RNA'nın alternatif bir okuma çerçevesinden çevirisini değiştiren43. Ek olarak, çeviri makinelerinin prosesliğini ve hızını izlemek için yararlı olacak bu OT konfokal testinde floresan etiketli ribozomların kullanılabileceği gösterilmiştir. Burada sunulan yöntem, çevirinin çeşitli yönlerini incelemek için farklı tamponların, ligandların veya diğer hücresel bileşenlerin etkisini hızlı bir şekilde test etmek için kullanılabilir. Son olarak, yaygın deneysel tuzaklar ve bunların nasıl giderileceği tartışılır. Aşağıda, deneysel tasarımda bazı önemli noktalar özetlenmiştir.

Tasarım oluşturma
Prensip olarak, OT uyumlu bir RNA yapısı oluşturmak için iki ortak yaklaşım vardır. İlk yaklaşım, tamamlayıcı DNA tutamaçlarıyla melezlenen uzun bir RNA molekülü kullanmaktadır, böylece ortada tek iplikli bir RNA dizisini kuşatan iki RNA / DNA melez bölgesinden oluşan bir yapı elde edilir (Şekil 2B). Bu yaklaşım çoğu OT RNA deneyinde 33,44,45'te kullanılır.

İkinci yaklaşım, kısa (yaklaşık 20 nt) çıkıntilı dsDNA tutamaçlarından yararlanır15,17. Bu çıkıntılar daha sonra RNA molekülü ile melezlenir. Tasarımda daha karmaşık olmasına rağmen, dsDNA tutamaklarının kullanımı DNA / RNA-hibrid sisteminin bazı sınırlamalarının üstesinden geliyor. Prensip olarak, konfokal ölçümler için daha uygun olan çok uzun tutamaklar (>10kb) bile uygulanabilir. Ek olarak, RNA molekülü, bağ stabilitesini artırmak için DNA tutamaklarına bağlanabilir.

Son etiketleme stratejisi
Yapı, güçlü bir moleküler etkileşim yoluyla boncuklara bağlanmalıdır. Sapların boncuklara doğru kurcalanabilir bağlanması için yaklaşımlar mevcut olsa da, streptavidin-biotin ve digoksigenin-antikor gibi güçlü ancak yaygın olmayan etkileşimler OT deneylerinde yaygın olarak kullanılmaktadır15,33,35,45. Açıklanan protokolde, yapı biotin veya digoksigenin ile etiketlenmiştir ve boncuklar sırasıyla streptavidin veya digoksigenin'e karşı antikorlarla kaplanmıştır (Şekil 1A). Bu yaklaşım, yaklaşık 60 pN'a (bağlama başına)47'ye kadar kuvvet uygulamak için uygundur. Ayrıca, farklı 5' ve 3' etiketleme stratejilerinin kullanılması, boncuklar arasında oluşan bağın yönünün belirlenmesine izin verir17.

Floresan ölçümleri için protein etiketleme
Konfokal görüntüleme için floresan etiketleme için yaygın olarak kullanılan birkaç yaklaşım vardır. Örneğin, floroforlar proteinlerde doğal olarak bulunan veya reaktif organik bir grup aracılığıyla bölgeye yönlendirilmiş mutajensis tarafından tanıtılan amino asit kalıntılarına aktif olarak bağlanabilir. Sistein ve lizin kalıntılarının etiketlenebilmesi için sırasıyla tiyol veya amin reaktif boyalar kullanılabilir. Etiketlemenin özgüllüğünü artırmak için birkaç ters çevrilebilir koruma yöntemi vardır48,49, ancak yerel proteinler genellikle birden fazla kalıntıda etiketlenir. Floroforun küçük boyutu bir avantaj sağlasa da, spesifik olmayan etiketleme protein aktivitesini etkileyebilir ve bu nedenle sinyal yoğunluğu değişebilir49. Ayrıca, etiketleme verimliliğine bağlı olarak sinyal yoğunluğu farklı deneyler arasında farklılık gösterebilir. Bu nedenle, denemeden önce bir etkinlik denetimi yapılmalıdır.

İlgi proteini, His-tag veya strep-tag gibi bir N veya C-terminal etiketi içeriyorsa, bu etiketlerin özel etiketlemesi başka bir popüler yaklaşımı temsil eder. Ayrıca, etiket hedefli etiketleme, floroforun protein aktivitesini engelleme şansını azaltır ve çözünürlüğü artırabilir49. Bununla birlikte, etikete özgü etiketleme genellikle mono-florofor etiketli proteinler verir ve bu da tespit edilmesi zor olabilir. Spesifik etiketlemenin başka bir yolu antikorlar kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Mikroakışkanlar kurulumu
OT'nin mikroakışkanlar sistemi ile kombinasyonu, farklı deneysel koşullar arasında hızlı bir geçiş sağlar. Ayrıca, akım sistemleri akış hücresinin içindeki laminar akışı korumaktan yararlanır, bu da diğer kanallardan gelen sıvıların akış yönüne göre dik yönde karıştırılmasını önler. Bu nedenle, laminar akış özellikle deneysel tasarım için avantajlıdır. Şu anda, 5 kanala kadar akış hücreleri yaygın olarak dirilmektedir (Şekil 3).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Numune hazırlama

  1. İlgi sırasını, sap dizileri olarak hizmet eden Lambda DNA parçalarını içeren vektöre klonlayın (Şekil 2)43,50.
  2. İlk önce PCR ile sonraki in vitro transkripsiyon için bir DNA şablonu oluşturun (Şekil 2B; reaksiyon 1). Bu PCR adımında, T7 promotörü dna molekülünün 5' ucuna eklenir32,33,43,50. PCR reaksiyonlarını Tablo 1'e göre ayarlayın. PCR'ı termosikler içinde uygun döngülerle 50 μL aliquots'ta çalıştırın.
  3. Tutamaçları iki ayrı PCR reaksiyona göre hazırlayın (Tablo 1, Şekil 2B; reaksiyon 2 ve 3). İlk olarak, PCR ile 5' tutamacını oluşturun. Ardından, 3' tutamağı oluşturun ve aynı anda 5' digoksigenin etiketli bir astar32,33,43,50 kullanarak digoxigenin ile etiketlendir.
  4. PCR'den sonra, silika spin sütunlarını kullanarak DNA'yı arındırın.
  5. T7 RNA polimeraz kullanarak in vitro transkripsiyon reaksiyonunu gerçekleştirin (Tablo 2)32,33,43,50. Reaksiyonun 37 °C'de 2-4 saat boyunca RNA'nın uzunluğuna bağlı olarak kuluçkaya yatırın. Ardından, reaksiyona I. Dayı'yı ekleyin ve DNA şablonını sindirmek için 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın. Silika döndürme sütunlarını kullanarak RNA'yı arındırın.
  6. 5' sapının etiketleme reaksiyonu sırasında (Tablo 3), kolun 3' ucuna T4 DNA polimeraz38,50 ile biotin-16-dUTP ekleyin. Reaksiyonun oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca gerçekleştirilmesi. Daha sonra, silika spin sütunlarını kullanarak DNA'yı arındırın.
    NOT: 5' tutamacın 3' ucunda (Şekil 2B) etiketli olması gerektiğinden, etiketleme PCR sırasında gerçekleştirilemez.















    2. figure-protocol-1


      figure-protocol-2


Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu bölümde ağırlıklı olarak floresan optik cımbız ile RNA-protein/ligand etkileşimlerinin ölçümlerine odaklanılmalıdır. Genel RNA optik cımbız deneylerinin ve buna karşılık gelen temsili sonuçların açıklaması için bkz. RNA/DNA-protein etkileşimlerinin daha ayrıntılı tartışılması için ayrıca bkz.

Prensip olar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, çeşitli ligandlarla RNA moleküllerinin etkileşimlerini ve dinamik davranışlarını incelemek için floresan bağlantılı optik cımbızların kullanımını gösteriyoruz. Aşağıda, mevcut tekniğin kritik adımları ve sınırlamaları tartışılmıştır.

Protokolde kritik adımlar
Diğer birçok yöntemde olduğu gibi, numunenin kalitesi güvenilir veri elde etmek için çok önemlidir. Bu nedenle, mümkün olan en yüksek kalitede numuneler elde etmek için, numune hazırlama prosedürünü optimize et...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Anuja Kibe ve Jun. Prof. Redmond Smyth'e makaleyi eleştirel bir şekilde inceledikleri için teşekkür ederiz. Uzman teknik yardım için Tatyana Koch'a teşekkür ederiz. Kristyna Pekarkova'ya deneysel videoların kaydediltiren yardımı için teşekkür ederiz. Laboratuvarımızdaki çalışmalar Helmholtz Derneği tarafından desteklenmekte ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) Grant Nr. 948636 (NC'ye) fon sağlamıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Bakteriyel Suşlar
E. coli HB101laboratuvar koleksiyonuN/Avektörlerin klonlanması
Kimyasallar ve enzimler
Sodyum klorürSigma-Aldrich31424Tamponlar
Biotin-16-dUTPRoche11093070910Biyotinilasyon
BSASigma-AldrichA4737Tamponlar
KatalazLumicksN/AOksijen scavanger sistemi
Dithiothreitol (DTT)Melford LabsD11000
Sığır pankreasından DNAse I'iSigma-AldrichD4527in vitro transkripsiyon
dNTP'lerTh.Geyer11786181PCR
EDTASigma-AldrichE9884Tamponlar
FormamidSigma-Aldrich11814320001Tamponları
GlikozSigma-AldrichG8270-1KGOksijen scavanger sistemi
Glikoz-oksidazLumicksN/AOksijen scavanger sistemi
HEPESCarl RothHN78.3Tamponlar
Magnezyum klorürCarl Roth2189.1Tamponlar
Phusion DNA polimerazNEBM0530LGibson montajı, klonlama
Potasyum klorürMerck529552-1KGTamponlar
PrimeSTAR GXL DNA PolimerazTakara Bio ClontechR050APCR
Pirofosfotaz, termostabil, inorganikNEBM0296Lin vitro transkripsiyon
RNaz İnhibitörüMolox1000379515Tamponları
rNTPSyaşam teknolojileriR0481in vitro transkripsiyon
Sodyum tiyosülfatSigma-AldrichS6672-500GÇamaşır suyu deaktivasyonu
Sytox GreenLumicksN/Akonfokal ölçümler
T4 DNA PolimerazNEBM0203SBiyotinilasyon
T5 eksonükleazNEBM0363SGibson düzeneği, klonlama
T7 RNA polimerazŞirket içinde üretilenN/Ain vitro transkripsiyon
Taq DNA polimerazNEBM0267SPCR
Taq ligazBiozymL6060LGibson düzeneği, klonlama
TWEEN 20 BioXtraSigma-AldrichP7949Tamponlar
Kits
Monolit Protein Etiketleme Kiti RED-NHS 2.Nesil (Amin Reaktif)NanotemperMO-L011Ribozom etiketleme için kullanılır
Purefrex 2.0GeneFrontierPF201-0.25-EXEtiketleme için kullanılan Ribozomlar
Oligonükleotidler< / güçlü >
5' kolu T7 ileriMicrosynthözel sipariş5' - CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC - 3', PCR 1'de OT in vitro transkripsiyon şablonu oluşturmak için kullanılır
3' kolu tersMicrosynthözel sipariş5' -  GTCAAAGTGCGCCGTTATCC - 3', PCR 1'de OT in vitro transkripsiyon şablonu oluşturmak için kullanılır
5' tutamak ileriMicrosynthözel sipariş5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3', PCR 2'de 5' tutamak oluşturmak için kullanılır
5' tutamak tersMicrosynthözel sipariş5' - CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', PCR 2'de 5' tanıtıcı oluşturmak için kullanılır
3' tutamak ileriMicrosynthözel sipariş5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG - 3', PCR 3'te 3' tutamak oluşturmak için kullanılır
3' tutamak ters 5' digoxigeninMicrosynthözel sipariş5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3' ile etiketlenmiş, PCR 3'de 3' tutamak oluşturmak için kullanılır 3
DNA vektörleri
pMZ_OTşirket içinde üretilmiştirN/A"Kardiyovirüs 2A proteininin yapısal çalışmaları, RNA tanıma ve translasyonel kontrol için moleküler temeli ortaya koymaktadır" bölümünde daha fazla açıklama
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Çalışkan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Yazılım ve Algoritmalar
Atomhttps://atom.io/packages/ide-pythonYok
BluelakeLumicksYok
Graphpadhttps://www.graphpad.com/Yok
InkScape 0.92.3https://inkscape.org/Yok
Matlabhttps://www.mathworks.com/products/matlab.htmlN/A
PATATESN/A
RNA yapısıhttps://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.htmlN/A
Diğer
Streptavidin Kaplı Polistiren Parçacıkları, 1.5-1.9 & mikro; m, 5 ml, %1.0 w/vSpherotechSVP-15-5
Anti-digoksigenin Kaplı Polistiren Partikülleri, 2.0-2.4 & mikro; m, 2 ml, %0,1 w/vSpherotechDIGP-20-2
ŞırıngalarVWRTERUMO SS+03L1
Devices
C-trapLumicksN/A  Konfokal mikroskopi ile birleştirilmiş optik cımbız
Tamponlar https://github.com/lpekarek/POTATO.git Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A

Kaynaklar

  1. Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096(2019).
  2. Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118(2021).
  3. Firth, A. E., Brierley, I. Non-canonical translation in RNA viruses. Journal of General Virology. 93, Pt 7 1385-1409 (2012).
  4. Caliskan, N., Peske, F., Rodnina, M. V. Changed in translation: mRNA recoding by −1 programmed ribosomal frameshifting. Trends in Biochemical Sciences. 40 (5), 265-274 (2015).
  5. Jaafar, Z. A., Kieft, J. S. Viral RNA structure-based strategies to manipulate translation. Nature Reviews Microbiology. 17 (2), 110-123 (2019).
  6. Eswarappa, S. M., et al. Programmed translational readthrough generates antiangiogenic VEGF-Ax. Cell. 157 (7), 1605-1618 (2014).
  7. Rodnina, M. V., et al. Translational recoding: canonical translation mechanisms reinterpreted. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1056-1067 (2020).
  8. Li, Y., et al. Transactivation of programmed ribosomal frameshifting by a viral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 2172(2014).
  9. Napthine, S., et al. Protein-directed ribosomal frameshifting temporally regulates gene expression. Nature Communications. 8 (1), 15582(2017).
  10. Patel, A., et al. Molecular characterization of the RNA-protein complex directing -2/-1 programmed ribosomal frameshifting during arterivirus replicase expression. Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 17904-17921 (2020).
  11. Napthine, S., Bell, S., Hill, C. H., Brierley, I., Firth, A. E. Characterization of the stimulators of protein-directed ribosomal frameshifting in Theiler's murine encephalomyelitis virus. Nucleic Acids Research. 47 (15), 8207-8223 (2019).
  12. Marshall, R. A., Aitken, C. E., Dorywalska, M., Puglisi, J. D. Translation at the Single-Molecule Level. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 177-203 (2008).
  13. Rodnina, M. V. The ribosome in action: Tuning of translational efficiency and protein folding. Protein science : A publication of the Protein Society. 25 (8), 1390-1406 (2016).
  14. Rodnina, M. V., Fischer, N., Maracci, C., Stark, H. Ribosome dynamics during decoding. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 372 (1716), (2017).
  15. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160 (5), 870-881 (2015).
  16. Liu, T., et al. Direct measurement of the mechanical work during translocation by the ribosome. eLife. 3, 03406(2014).
  17. Desai, V. P., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
  18. Choi, J., O'Loughlin, S., Atkins, J. F., Puglisi, J. D. The energy landscape of -1 ribosomal frameshifting. Science Advances. 6 (1), (2020).
  19. Prabhakar, A., Puglisi, E. V., Puglisi, J. D. Single-molecule fluorescence applied to translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032714(2019).
  20. Bao, C., et al. mRNA stem-loops can pause the ribosome by hindering A-site tRNA binding. Elife. 9, 55799(2020).
  21. Chen, J., Tsai, A., O'Leary, S. E., Petrov, A., Puglisi, J. D. Unraveling the dynamics of ribosome translocation. Current Opinion in Structural Biology. 22 (6), 804-814 (2012).
  22. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475 (7354), 118-121 (2011).
  23. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1044-1056 (2014).
  24. Blanchard, S. C. Single-molecule observations of ribosome function. Current Opinion in Structural Biology. 19 (1), 103-109 (2009).
  25. Juette, M. F., et al. The bright future of single-molecule fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 103-111 (2014).
  26. McCauley, M. J., Williams, M. C. Mechanisms of DNA binding determined in optical tweezers experiments. Biopolymers. 85 (2), 154-168 (2007).
  27. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
  28. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current Opinion in Structural Biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  29. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23(2019).
  30. Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. Recent advances in optical tweezers. Annual Reviews of Biochemistry. 77, 205-228 (2008).
  31. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA Unfolds and Refolds. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 77-100 (2008).
  32. Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of single RNA molecules by optical tweezers. Journal of Visualized Experiments. (90), e51542(2014).
  33. Halma, M. T. J., Ritchie, D. B., Cappellano, T. R., Neupane, K., Woodside, M. T. Complex dynamics under tension in a high-efficiency frameshift stimulatory structure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (39), 19500(2019).
  34. Hansen, T. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B., Sørensen, M. A. Correlation between mechanical strength of messenger RNA pseudoknots and ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5830-5835 (2007).
  35. Zhong, Z., et al. Mechanical unfolding kinetics of the SRV-1 gag-pro mRNA pseudoknot: possible implications for -1 ribosomal frameshifting stimulation. Science Reports. 6, 39549(2016).
  36. McCauley, M. J., Rouzina, I., Li, J., Núñez, M. E., Williams, M. C. Significant differences in RNA structure destabilization by HIV-1 GagDp6 and NCp7 proteins. Viruses. 12 (5), 484(2020).
  37. de Messieres, M., et al. Single-molecule measurements of the CCR5 mRNA unfolding pathways. Biophysics Journal. 106 (1), 244-252 (2014).
  38. Yang, L., et al. Single-molecule mechanical folding and unfolding of RNA hairpins: Effects of single A-U to A·C pair substitutions and single proton binding and implications for mRNA structure-induced -1 ribosomal frameshifting. Journal of American Chemical Society. 140 (26), 8172-8184 (2018).
  39. McCauley, M. J., et al. Targeted binding of nucleocapsid protein transforms the folding landscape of HIV-1 TAR RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13555-13560 (2015).
  40. Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. High-resolution "Fleezers": Dual-trap optical tweezers combined with single-molecule fluorescence detection. Methods in Molecular Biology. 1486, Clifton, N.J. 183-256 (2017).
  41. Yerramilli, V. S., Kim, K. H. Labeling RNAs in live cells using malachite green aptamer scaffolds as fluorescent probes. ACS Synthetic Biology. 7 (3), 758-766 (2018).
  42. Gross, P., Farge, G., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Combining optical tweezers, single-molecule fluorescence microscopy, and microfluidics for studies of DNA-protein interactions. Methods in Enzymology. 475, 427-453 (2010).
  43. Zimmer, M. M., et al. The short isoform of the host antiviral protein ZAP acts as an inhibitor of SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting. Nature Communications. 12 (1), 7193(2021).
  44. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A. N., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39 (17), 7677-7687 (2011).
  45. Ritchie, D. B., Soong, J., Sikkema, W. K., Woodside, M. T. Anti-frameshifting ligand reduces the conformational plasticity of the SARS virus pseudoknot. Journal of the American Chemical Society. 136 (6), 2196-2199 (2014).
  46. Janissen, R., et al. Invincible DNA tethers: covalent DNA anchoring for enhanced temporal and force stability in magnetic tweezers experiments. Nucleic Acids Research. 42 (18), 137(2014).
  47. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science. 271 (5250), 795(1996).
  48. Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Labeling of specific cysteines in proteins using reversible metal protection. Biophysical Journal. 100 (10), 2513-2521 (2011).
  49. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  50. Hill, C. H., et al. Structural and molecular basis for Cardiovirus 2A protein as a viral gene expression switch. Nature Communications. 12 (1), 7166(2021).
  51. Butterworth, S. On the theory of filter amplifiers. Experimental Wireless and the Wireless Engineer. 7, 536-541 (1930).
  52. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophysics Journal. 72 (3), 1335-1346 (1997).
  53. Mukhortava, A., et al. Structural heterogeneity of attC integron recombination sites revealed by optical tweezers. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1861-1870 (2019).
  54. Buck, S., Pekarek, L., Caliskan, N. POTATO: An automated pipeline for batch analysis of optical tweezers data. bioRxiv. , (2021).
  55. Zhang, Y., Jiao, J., Rebane, A. A. Hidden Markov modeling with detailed balance and its application to single protein folding. Biophysical Journal. 111 (10), 2110-2124 (2016).
  56. Sgouralis, I., Pressé, S. An introduction to infinite HMMs for single-molecule data analysis. Biophysics Journal. 112 (10), 2021-2029 (2017).
  57. Müllner, F. E., Syed, S., Selvin, P. R., Sigworth, F. J. Improved hidden Markov models for molecular motors, part 1: basic theory. Biophysical Journal. 99 (11), 3684-3695 (2010).
  58. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical Journal. 103 (7), 1490-1499 (2012).
  59. Re, A., Joshi, T., Kulberkyte, E., Morris, Q., Workman, C. T. RNA-protein interactions: an overview. Methods Molecular Biology. 1097, 491-521 (2014).
  60. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  61. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  62. Sunbul, M., Jäschke, A. SRB-2: a promiscuous rainbow aptamer for live-cell RNA imaging. Nucleic Acids Research. 46 (18), 110(2018).
  63. Sanchez de Groot, N., et al. RNA structure drives interaction with proteins. Nature Communications. 10 (1), 3246(2019).
  64. Zeffman, A., Hassard, S., Varani, G., Lever, A. The major HIV-1 packaging signal is an extended bulged stem loop whose structure is altered on interaction with the Gag polyprotein. Journal of Molecular Biology. 297 (4), 877-893 (2000).
  65. Mangeol, P., et al. Probing ribosomal protein-RNA interactions with an external force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18272(2011).
  66. Luo, X., et al. Molecular mechanism of RNA recognition by Zinc-Finger antiviral protein. Cell Reports. 30 (1), 46-52 (2020).
  67. Qu, X., Lancaster, L., Noller, H. F., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (36), 14458-14463 (2012).
  68. Chandra, V., Hannan, Z., Xu, H., Mandal, M. Single-molecule analysis reveals multi-state folding of a guanine riboswitch. Nature Chemical Biology. 13 (2), 194-201 (2017).
  69. Savinov, A., Perez, C. F., Block, S. M. Single-molecule studies of riboswitch folding. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (10), 1030-1045 (2014).
  70. Kelly, J. A., et al. Structural and functional conservation of the programmed ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Journal of Biological Chemistry. 295 (31), 10741-10748 (2020).
  71. Neupane, K., et al. Structural dynamics of single SARS-CoV-2 pseudoknot molecules reveal topologically distinct conformers. Nature Communications. 12 (1), 4749(2021).
  72. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  73. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  74. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  75. Rill, N., Mukhortava, A., Lorenz, S., Tessmer, I. Alkyltransferase-like protein clusters scan DNA rapidly over long distances and recruit NER to alkyl-DNA lesions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 117 (17), 9318-9328 (2020).
  76. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  77. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  78. Wen, J. -D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophysical journal. 92 (9), 2996-3009 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tek Molek l TeknikleriKonfokal MikroskopiKuvvet Rampas DeneyleriRNA Ba layan ProteinlerRibozomal er eve KaymasRNA Yap StabilitesiFloresan Etiketleme
Çeviri Yönetmeliğinde RNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Optik Cımbız
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.