Yöntem makalesi

Mitokondrinin Termojenik Kapasitesini İncelemek için Yama-Kelepçe Tekniğinin Kullanımı

DOI:

10.3791/62618

⸱

3 Mayıs 2021

1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem makalesi, mitokondrinin termojenik kapasitesini incelemek için yeni bir yaklaşım olan yama-kelepçe tekniği ile iç mitokondriyal membran boyunca H + sızıntısını ölçmedeki ana adımları detaylandırmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal termogenez (mitokondriyal ayrılma olarak da bilinir), metabolik sendromla mücadele etmek için enerji harcamasını artırmak için en umut verici hedeflerden biridir. Kahverengi ve bej yağlar gibi termojenik dokular, ısı üretimi için oldukça uzmanlaşmış mitokondri geliştirir. Öncelikle ATP üreten diğer dokuların mitokondrileri, toplam mitokondriyal enerji üretiminin% 25'ini ısıya dönüştürür ve bu nedenle tüm vücudun fizyolojisi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Mitokondriyal termojenez sadece vücut ısısını korumak için gerekli değildir, aynı zamanda diyete bağlı obeziteyi önler ve hücreleri oksidatif hasardan korumak için reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini azaltır. Mitokondriyal termogenez, hücresel metabolizmanın önemli bir düzenleyicisi olduğundan, bu temel sürecin mekanik bir anlayışı, mitokondriyal disfonksiyonla ilişkili birçok patolojiyle mücadele etmek için terapötik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Önemli olarak, mitokondride termojenezin akut aktivasyonunu kontrol eden hassas moleküler mekanizmalar zayıf bir şekilde tanımlanmıştır. Bu bilgi eksikliği, büyük ölçüde, ayrıştırıcı proteinlerin doğrudan ölçümü için yöntemlerin eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Mitokondriye uygulanan yama-kelepçe metodolojisinin son zamanlardaki gelişimi, ilk kez, mitokondriyal termogenezin kökenindeki fenomenin doğrudan incelenmesini, İBB'den H + sızıntısını ve bundan sorumlu mitokondriyal taşıyıcıların ilk biyofiziksel karakterizasyonunu, kahverengi ve bej yağlara özgü ayrışma proteini 1'i (UCP1) ve diğer tüm dokular için ADP / ATP taşıyıcısını (AAC) mümkün kılmıştır. Bu benzersiz yaklaşım, H + sızıntısını ve mitokondriyal termojenezi kontrol eden mekanizmalara ve metabolik sendromla mücadele için nasıl hedeflenebileceklerine dair yeni bilgiler sağlayacaktır. Bu makalede, İBB aracılığıyla H + akımlarını doğrudan ölçerek termojenik kapasitelerini incelemek için mitokondrilere uygulanan yama kelepçesi metodolojisi açıklanmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri, hücrenin güç merkezi olmasıyla ünlüdür. Aslında, kimyasal enerjinin ana kaynağı olan ATP'dirler. Daha az bilinen şey, mitokondrinin de ısı ürettiğidir. Aslında, her mitokondri sürekli olarak iki tür enerji (ATP ve ısı) üretir ve iki enerji formu arasındaki ince bir denge metabolik hücre homeostazını tanımlar (Şekil 1). Mitokondrinin ATP ve ısı arasında enerjiyi nasıl dağıttığı, biyoenerjetik alanındaki en temel sorudur, ancak hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Mitokondriyal ısı üretimini arttırmanın (mitokondriyal termojenez olarak adlandırılır) ve sonuç olarak ATP üretimini azaltmanın enerji harcamasını artırdığını biliyoruz ve bu, metabolik sendromla mücadele etmenin en iyi yollarından biridir1.

Mitokondriyal termogenez, iç mitokondriyal membran (IMM) boyunca H + sızıntısından kaynaklanır ve substrat oksidasyonunun ve ATP sentezinin ısı üretimi ile ayrılmasına yol açar, bu nedenle "mitokondriyal ayrışma"1 adı verilir (Şekil 1). Bu H + sızıntısı, ayrışma proteinleri (UCP'ler) adı verilen mitokondriyal taşıyıcılara bağlıdır. UCP1, tanımlanan ilk UCP'dir. Sadece termojenik dokularda, kahverengi yağda ve mitokondrinin ısı üretimi için uzmanlaşmış olduğu bej yağda ifade edilir 2,3,4. İskelet kası, kalp ve karaciğer gibi yağ olmayan dokularda UCP'nin kimliği tartışmalı kalmıştır. Bu dokulardaki mitokondri, ısıya dönüştürülen toplam mitokondriyal enerjinin yaklaşık% 25'ine sahip olabilir ve bu da tüm vücudun fizyolojisini önemli ölçüde etkileyebilir1. Çekirdek vücut ısısını korumanın yanı sıra, mitokondriyal termogenez ayrıca kalorileri azaltarak diyete bağlı obeziteyi de önler. Ek olarak, hücreleri oksidatif hasardan korumak için mitokondri ile reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini azaltır1. Bu nedenle, mitokondriyal termogenez normal yaşlanma, yaşa bağlı dejeneratif bozukluklar ve iskemi-reperfüzyon gibi oksidatif stres içeren diğer durumlarda rol oynar. Bu nedenle, mitokondriyal termogenez, hücresel metabolizmanın güçlü bir düzenleyicisidir ve bu temel sürecin mekanik bir anlayışı, mitokondriyal disfonksiyonla ilişkili birçok patolojiyle mücadele etmek için terapötik stratejilerin geliştirilmesini teşvik edecektir.

Mitokondriyal solunum, mitokondriyal termogenezin hücresel metabolizmadaki önemli rolünü ortaya koyan ilk tekniktir ve hala toplumda en popüler olanıdır1. Bu teknik, mitokondriyal H + sızıntısı aktive edildiğinde artan mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC) tarafından oksijen tüketiminin ölçülmesine dayanmaktadır. Bu teknik, enstrümantal olmasına rağmen, İBB1'deki mitokondriyal H + sızıntısını doğrudan inceleyemez, böylece özellikle ısı üretiminin ATP üretimine kıyasla ikincil olduğu yağ dışı dokularda, bundan sorumlu proteinlerin kesin olarak tanımlanmasını ve karakterizasyonunu zorlaştırır. Son zamanlarda, mitokondriye uygulanan yama-kelepçe tekniğinin geliştirilmesi, çeşitli dokularda tüm İBB'de H + sızıntısının ilk doğrudan çalışmasını sağlamıştır 5,6,7.

Tüm İBB'nin mitokondriyal yama kelepçesi ilk olarak Kirichok ve ark.8 tarafından tekrarlanabilir bir şekilde kurulmuştur. 2004 yılında mitokondriyal kalsiyum uniporter (MCU) akımlarının ilk doğrudan ölçümünü, COS-7 hücre hatlarından mitoplastlar kullanarak tanımladılar8. Daha sonra, Kirichok laboratuvarı, fare 9 ve Drosophila dokuları9'un IMM'lerinden kalsiyum akımları gösterdi. Diğer laboratuvarlar şimdi MCU10,11,12,13,14'ün biyofiziksel özelliklerini incelemek için bu tekniği rutin olarak kullanmaktadır. Potasyum ve klorür iletkenliğinin tüm İBB yama-kelepçe analizi de mümkündür ve birkaç makalede bahsedilmiştir, ancak henüz bir yayının ana konusu olmamıştır 6,7,9. İBB'deki H + akımlarının ilk ölçümü 2012 yılında fare kahverengi yağ mitokondrisi6'dan ve 2017'de fare bej yağ mitokondrisinden7 bildirilmiştir. Bu akım, termojenik dokuların spesifik ayrışma proteini UCP1 6,7'den kaynaklanmaktadır. 2019'da yayınlanan son çalışmalar, AAC'yi kalp ve iskelet kası gibi yağ dışı dokularda mitokondriyal H + sızıntısından sorumlu ana protein olarak nitelendirdi5.

Bu benzersiz yaklaşım şimdi mitokondriyal iyon kanallarının ve mitokondriyal termojenezden sorumlu taşıyıcıların doğrudan yüksek çözünürlüklü fonksiyonel analizine izin vermektedir. Yöntemin genişlemesini kolaylaştırmak ve mitokondriyal solunum gibi diğer çalışmaları tamamlamak için, UCP1 ve AAC tarafından taşınan H + akımlarını ölçmek için aşağıda ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Üç önemli adım açıklanmaktadır: 1) AAC'ye bağımlı H + akımını analiz etmek için fare kahverengi yağından mitokondriyal izolasyon ve AAC'ye bağımlı H + akımını analiz etmek için kalpten mitokondriyal izolasyon, 2) dış mitokondriyal membranın (OMM) mekanik rüptürü için bir Fransız Basını ile mitoplastların hazırlanması, 3) UCP1 ve AAC'ye bağımlı H + akımlarının yama-kelepçe kayıtları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gerçekleştirilen tüm hayvan deney prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına uygundur ve Kaliforniya Üniversitesi Los Angeles Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

NOT: Mitokondriyal izolasyon prosedürü diferansiyel santrifüjlemeye dayanır ve dokudan dokuya biraz değişir. Örneğin, kahverengi yağ dokusu lipitler bakımından son derece zengin olduğundan, mitokondri toplanmadan önce hücre kalıntılarını ve organelleri lipit fazından ayırmak için ek bir adım gerektirir. Karışıklığı önlemek için, iki mitokondriyal izolasyon prosedürü (biri kahverengi yağdan, diğeri kalpten) aşağıda detaylandırılmıştır.

1. Fare interskapuler kahverengi yağından mitokondriyal izolasyon (Bertholet ve ark. 2020'den modifiye edilmiştir)15

  1. Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Paneli ve IACUC Komitesi tarafından önerildiği gibi, CO2 boğulması ve ardından servikal çıkık kullanarak C57BL / 6 erkek fareyi ötenazileştirin.
  2. Fareyi göbeği masaya bakacak şekilde konumlandırdıktan sonra, saçları temizlemek ve ıslatmak için alkol püskürtün (Mann ve ark., 2014'ten değiştirilmiştir)16.
  3. Cildi cımbızla kavradıktan sonra üst sırtta 2 cm'lik bir kesi yapın.
  4. Kelebek şeklinde16 olan iki loblu bir organa karşılık gelen farenin kahverengi interskapular yağını çıkarın.
  5. Kahverengi yağları, daha önce buz üzerine yerleştirilmiş 5 mL soğuk izolasyon tamponu (Tablo 1) ile doldurulmuş 35 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
  6. Kahverengi yağı dürbün altındaki beyaz yağdan temizleyin.
  7. Kahverengi yağı, ince parçalar halinde doğramak için 5 mL soğuk izolasyon tamponu (Tablo 1) ile 10 mL'lik bir behere aktarın. Buzda soğutulmuş 10 mL cam homojenizatöre (plastik malzeme politetrafloroetilen (PTFE) havane) aktarın.
  8. Önceden kesilmiş dokuyu buz üzerinde altı yumuşak vuruşla 275 rotasyon/dk kontrollü bir hızda homojenize etmek için bir baş üstü karıştırıcı kullanın.
  9. Homojenatı 8.500 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca 15 mL buz gibi soğuk konik bir tüp içinde santrifüj edin. Lipid fazını içeren süpernatantı atın.
  10. Peleti 5 mL buz gibi soğuk izolasyon tamponunda (Tablo 1) yeniden askıya alın ve buz üzerindeki süspansiyonu ikinci kez 275 dönme / dak hızında altı yavaş vuruşla homojenize edin.
  11. Homojenatı 15 mL buz gibi soğuk konik bir tüpe aktarın ve tüm çekirdekleri ve kırılmamış hücreleri peletlemek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 700 x g'de santrifüj yapın.
  12. Süpernatantı taze bir 15 mL tüpte toplayın ve buzun üzerine yerleştirin.
  13. Mitokondri içeren bir pelet elde etmek için süpernatantı 8.500 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
  14. Mitokondri içeren peleti 3.8 mL buz gibi soğuk hipertonik-mannitol tamponunda (Tablo 2) yeniden askıya alın ve mitokondriyal süspansiyonu buz üzerinde 10-15 dakika inkübe edin.

2. Fare kalbinden mitokondriyal izolasyon (Garg ve ark. 2019'dan değiştirilmiştir)17

  1. Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Paneli ve IACUC Komitesi tarafından önerildiği gibi, CO2 boğulması ve ardından servikal çıkık kullanarak C57BL / 6 erkek fareyi ötenazileştirin.
  2. Fareyi sırtına yerleştirdikten sonra, saçları temizlemek ve ıslatmak için alkol püskürtün. Daha sonra cildi cımbızla kavradıktan sonra toraks üzerinde 2 cm'lik bir kesi yapın.
  3. Kalbi hayvanın göğsünden disseke edin ve 5 mL soğuk izolasyon çözeltisi ile 10 mL'lik bir beherdeki tüm kanı çıkarmak için durulayın (Tablo 1).
  4. Kalp kan izlerinden temizlendikten sonra, ince parçalara ayırmak için 5 mL soğuk izolasyon tamponu içeren başka bir 10 mL beher'e aktarın (Tablo 1). Daha sonra, buzla soğutulmuş 10 mL cam homojenizatöre (PTFE havaneli) aktarın.
  5. Önceden kesilmiş dokuyu buz üzerinde altı yumuşak vuruşla 275 rotasyon/dk kontrollü bir hızda homojenize etmek için bir baş üstü karıştırıcı kullanın.
  6. Homojenatı 15 mL buz gibi soğuk konik bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 700 x g'da santrifüj ederek pelet çekirdeklerine ve kırılmamış hücrelere aktarın.
  7. Süpernatantı taze bir 15 mL tüpte toplayın ve buzun üzerine yerleştirin.
  8. Mitokondri içeren bir pelet elde etmek için süpernatantı 8.500 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
  9. Mitokondriyal peleti 3.8 mL buz gibi soğuk hipertonik-mannitol tamponunda (Tablo 2) yeniden askıya alın ve mitokondriyal süspansiyonu buz üzerinde 10-15 dakika inkübe edin.

3. OMM'nin mekanik rüptürü için bir Fransız Presi ile mitoplastların hazırlanması.

NOT: Fransız basın prosedürü, İBB'nin matris ve crista dahil olmak üzere bütünlüğü korunarak OMM'den serbest bırakılmasına izin verir (Şekil 2)18. Mitokondri, hipertonik-mannitol tamponunda (Tablo 2) önceden inkübe edilir ve OMM yırtıldığında İBB'nin sert bir şekilde gerilmesini önlemek için Fransız pres prosedürü sırasında daha düşük bir basınca tabi tutulur.

  1. Mitokondriyal-hipertonik-mannitol süspansiyonunu Fransız presinin soğutulmuş bir mini basınç hücresine (piston çapı 3/8") doldurun (Şekil 3A).
  2. French Press'in Orta modunu seçin ve süspansiyonu, kahverengi yağ mitokondrisi için French Press kadranındaki 110'da ve kalp mitokondrisi için 140'ta (~ 2.000 psi) mini basınç hücresinden sıkıştırın.  Süspansiyonun mini basınç hücresinden yaklaşık 1 damla / s oranında çıktığından emin olun.
  3. Damlaları 15 mL buz soğutmalı konik bir tüpte toplayın.
  4. Süspansiyonu 4 °C'de 10 dakika boyunca 10.500 x g'de santrifüj yapın.
  5. Mitoplast peletini 0.5-2 mL buz gibi soğuk Hypertonic-KCl tamponunda (Tablo 3) yeniden askıya alın ve süspansiyonu buz üzerinde saklayın.
    NOT: Kahverengi yağ ve kalp mitoplastları yama kelepçeli kayıtlar için hazırdır ve yaklaşık 3-6 saat boyunca kullanılabilir durumda kalmalıdır.

4. UCP1 ve AAC 5,7,15 üzerinden H + sızıntısının elektrofizyolojik kayıtları

NOT: Aşağıdaki elektrofizyolojik kurulumu kullanın (Şekil 3B): diferansiyel girişim kontrastlı (DIC) ters mikroskop, 60x suya daldırma hedefi, titreşim izolasyon tablosu ve Faraday kafesi, düşük gürültülü kayıtları destekleyen standart bir amplifikatör, elektrofizyolojik kurulum için kullanılan standart bir sayısallaştırıcı, pClamp 10, bir mikromanipülatör, banyo referans elektrodu (kalıplanmış gümüş/gümüş klorür pelet içeren bir mikroelektrot tutucu içine yerleştirilmiş 3 M KCl-agar tuz köprüsü) tutucu gövdeye (Liu et al. 2021'de tanımlanmıştır)19, yerçekimi ile beslenen bir perfüzyon sistemine bağlı, 0.13 mm cam kapaklı bir tabana sahip perfüzyon odası.

  1. Borosilikat cam filamentleri kayıt gününde bir mikropipet çektirici kullanarak çekin. Yüksek derecede tekrarlanabilirliğe sahip pipetler üretmek için kullanılan çektirme makinesine bir program yerleştirin20.
    NOT: Bu program tasarımı, IMM yama kelepçesi için optimize edilmiş pipetler elde etmek için birkaç deneme gerektirir. Standart bir pipet, progresif konik şekle sahip ince uçlara sahiptir.
  2. Çektirme makinesinin içine bir cam filaman yerleştirin ve bir borosilikat filamentten neredeyse iki özdeş yama pipeti elde etmek için çekin.
  3. Pipetler, çektirmenin ısıtma kutusu filamentinin eskimesi nedeniyle çekme döngüleri arasında tutarsız hale geldiğinde programı ayarlayın.
  4. Pipetleri pipet parlatıcısının içine yerleştirin ve ateşle parlatmak için ucu filamentin yanına 100x büyütmenin altına yerleştirin.
  5. Filamenti tıkanmadan veya uç eğrisine zarar vermeden ısıtmak için ayak pedalına birkaç kez basın.
  6. TMA bazlı pipet çözeltisi ile doldurulduğunda 25 ila 35 MΩ arasında bir dirence sahip pipetler elde edilene kadar cilalanır (tetrametilamonyum hidroksit için TMA, Tablo 4).
  7. Mitoplast yapışmasını azaltmak için %0,1 jelatinli ön inkübasyon kapakları (5 mm çap, 0,1 mm kalınlık) ve mitoplast süspansiyonunu biriktirmeden önce KCl banyo çözeltisi (Tablo 5) ile durulayın.
  8. Konsantre mitoplast süspansiyonun ~35 μL'sini 500 μL KCl banyo çözeltisi (Tablo 5) ile karıştırarak ham bir seyreltme hazırlayın ve daha önce 4 delikli bir plakanın kuyucuğuna yerleştirilmiş kapaklara yerleştirin.
  9. Mitoplastların kapak kayması üzerindeki tortuya neden olması için 15 ila 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
  10. Banyo odasını tamamen ~ 50 μL KCl banyo çözeltisi ile doldurun (Tablo 5).
  11. Bükülmüş uçlu ince mikrodiseksiyon cımbızları kullanarak hazne içinde mitoplastlı bir kapak kayması aktarın.
  12. Kapak kapağını odanın dibinde düzenleyin. Mitoplastları kapak kayması üzerinde sabit tutmak için odacığı delmeyin.
  13. Mikroskop altındaki kapak kaymasını 60x hedefle tarayarak 8 şeklinde ayrı bir yapışkan olmayan mitoplast seçin.
  14. Pipete pipet çözeltisi (~50 μL) yükleyin ve pipet tutucuya yerleştirin.
  15. Pipetleri bir mikromanipülatörle banyo çözeltisine getirin ve IMM'ye yaklaşmak için seçilen mitoplastın hemen üstüne yaklaşın. Amplifikatör programı, pipetin banyo çözeltisine girdikten sonra direncini verir. Membran potansiyelini 0 mV'de tutun ve amplifikatör programındaki membran test komutunu kullanarak 10 mV darbeler uygulayın.
  16. İBB ile hızlı bir şekilde gigaseal oluşturmak için hafif negatif basınç uygulayın (Şekil 2B).
  17. Deney sırasında pipetin sürüklenmesi nedeniyle conta kırılmasını önlemek için pipeti kapak kaymasından uzak tutmak için mitoplast takılı olarak yükseltin.
  18. Kopma sonrası mitoplast membranı için doğru bir kapasitans (Cm) ölçümü elde etmek için tüm mitoplast konfigürasyonunu test etmeden önce amplifikatör programındaki "membran testi" komutu ile başıboş kapasitans geçicilerini telafi edin.
  19. Cam pipetin altındaki membran yamasını yırtmak ve tüm mitoplast konfigürasyonunu elde etmek için amplifikatör programı ile kısa süreli (5-15 ms) voltaj darbeleri (250-600 mV) uygulayın (Şekil 2C). Başarılı bir mola, kapasitans geçicilerinin yeniden ortaya çıkmasıyla yansıtılır.
  20. Kırılmadan sonra, membran kapasitansını (mitoplastın boyutunu yansıtan) ve erişim direnci Ra'yı (tüm mitoplast konfigürasyonunun kalitesini yansıtan) değerlendirmek için amplifikatör programının membran test seçeneğiyle kapasitans geçicilerini takın. Kırılmadan sonra, Ra 40 ila 80 MΩ arasında olmalıdır. Yama-kelepçe deneyleri için kullanılan mitoplastlar (2-6 μm boyutunda) tipik olarak 0.5-1.1 pF'lik membran kapasitanslarına sahiptir.
  21. Kırılmadan hemen sonra, perfüzyonu başlatarak KCl banyo çözeltisini (Tablo 5) HEPES banyo çözeltisi (Tablo 6) ile değiştirin.
  22. Mitoplastı 0 mV'de tutarken, amplifikatör programı ile tasarlanmış 850 ms rampa protokolünü -160 mV'den +100 mV'a 5 s aralıklarla uygulayın. Bu protokol UCP1 6,7,15 ve AAC 5 çalışmaları için geçerlidir (Şekil 4 ve Şekil 5).
    NOT: UCP1 ve AAC'ye bağımlı H+ akım ölçümlerinin tüm elektrofizyolojik verileri 10 kHz'de elde etmesi ve amplifikatörü ve sayısallaştırıcıyı çalıştıran yeterli yazılımı kullanarak 1 kHz'de filtrelemesi önerilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriye uygulanan yama kelepçesi metodolojisinin geliştirilmesi, İBB ve bundan sorumlu olan mitokondriyal taşıyıcılar, UCP1 ve AAC yoluyla H + sızıntısının ilk doğrudan çalışmasını sağlamıştır. UCP1 ve AAC'ye bağımlı H + sızıntılarının elektrofizyolojik analizi, mitokondrinin termojenik kapasitesine ilk bakışı sağlayabilir. Sonuçlar bölümünde, UCP1 ve AAC aracılığıyla H + sızıntısını ölçmek için standart prosedürler açıklanmaktadır.

UCP1'e bağlı H<...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem makalesi, mitokondriyal termojenezden sorumlu İBB aracılığıyla H + sızıntısını doğrudan incelemek için yeni bir yaklaşım olan mitokondriye yakın zamanda uygulanan yama-kelepçe tekniğini sunmayı amaçlamaktadır 5,6,7,15. Bu teknik dokularla sınırlı değildir ve HAP1, COS7, C2C12 ve MEF hücreleri gibi farklı standart insan ve hücre modellerinde İBB'nin H + sızıntısın...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar, birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Yuriy Kirichok'a laboratuvarında parçası olduğum büyük bilim için ve Kirichok laboratuvarının üyelerine yararlı tartışmalar için teşekkür ederim. Ayrıca AAC1 nakavt fareleri sağladığı için Dr. Douglas C. Wallace'a teşekkür ederim. Finansman: A.M.B, Amerikan Kalp Derneği Kariyer Geliştirme Ödülü 19CDA34630062 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.1 jelatinMilliporeES-006-B
60X suya daldırma objektif, sayısal açıklık 1.20OlympusUPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifikatörMoleküler Cihazlar
Borosilikat cam kılcal damarlarSutter InstrumentsBF150-86-10
Digidata 1550B SayısallaştırıcıMoleküler Cihazlar
Faraday kafesiEv Yapımı
Fransız PresGlen Mills5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratuvar tepegöz karıştırıcı
Ters MikroskopOlympusIX71 veya IX73
Mikro Dövme(Narishige)MF-830
Mikro Manupülatör MPC-385Sutter AletlerFG-MPC325
Agar köprüsü için mikroelektrot tutucuDünya Hassas AletleriMEH3F4515
Mikropipet Çektirme(Sutter Instruments)P97
Fransız Presi için Mini HücreGlen Mills5500-FA-004
MİKSER IKA 6-2000RPMCole ParmerEW-50705-50
Objektif 100X büyütmeNikon ve nbsp lensMPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10Moleküler Cihazlar
Perfüzyon odasıWarner InstrumentsRC-24E
Potter-Elvehjem homojenizatör 10 mlWheaton358039
Soğutmalı santrifüj SORVALL X4R PRO-MDThermo Scientific75 009 521
Küçük yuvarlak cam lameller: 5 mm çap, 0,1 mm kalınlıkWarner Instruments640700
Titreşim izolasyon tablosuNewportVIS3036-SG2-325A
Kimyasallar
D-glukonik asitSigma AldrichG1951
D-mannitolve nbsp; Sigma AldrichM4125
EGTA  Sigma Aldrich3777
HES&nbsp; Sigma AldrichH7523
KCl  Sigma Aldrich60128
MgCl2  Sigma Aldrich63068
sukroz  Sigma AldrichS7903
TMA  Sigma Aldrich331635
TrisBase  Sigma AldrichT1503
TrisCl  Sigma AldrichT3253

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).
  2. Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).
  3. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  4. Nicholls, D. G. The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis. Biochimie. 134, 9-18 (2017).
  5. Bertholet, A. M., et al. H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier. Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).
  6. Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
  7. Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling. Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).
  8. Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).
  9. Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues. Nature Communications. 3, 1317(2012).
  10. Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents. eLife. 2, 00704(2013).
  11. Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).
  12. Vais, H., et al. EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter. Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).
  13. Vais, H., et al. MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter. Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).
  14. Kamer, K. J., et al. MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).
  15. Bertholet, A. M., Kirichok, Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat. Frontiers in Physiology. 11, 326(2020).
  16. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174(2014).
  17. Garg, V., Kirichok, Y. Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter. Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).
  18. Decker, G. L., Greenawalt, J. W. Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation. Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).
  19. Liu, B., et al. Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).
  20. Flaming, D. G., Brown, K. T. Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter. Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).
  21. Klingenberg, M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mitokondriyal TermogenezProton S z nt sMitokondriyal MembranA ma Proteini 1Kahverengi Ya MitokondrileriMitoplast Haz rlamaProton Ak m l mADP ATP Ta y cMetabolik Sendrom

İlgili makaleler