Yöntem makalesi

İnsan Preimplantasyon Embriyolarının Harcanan Kültür Ortamı Kullanılarak Kromozom Taraması: Örnek Toplama ve Kromozomal Ploidi Analizi

DOI:

10.3791/62619

⸱

7 Eylül 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology(Peking University Third Hospital), 3Ministry of Education, Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), 4Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproductive Technology, 5Department of Clinical Research, Yikon Genomics Co. Ltd.

* These authors contributed equally

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, embriyo biyopsisini önleyen ve NGS kullanılarak kromozom ploidi tanımlamasını sağlayan, harcanan kültür ortamını kullanan insan embriyolarının kromozom taraması için bir protokol bildirmektedir. Bu makale, kültür ortamının hazırlanması, tüm genom amplifikasyonu (WGA), yeni nesil dizileme (NGS) kütüphanesinin hazırlanması ve veri analizi dahil olmak üzere ayrıntılı prosedürü sunmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klinik in vitro fertilizasyonda (IVF), PGT-A için geçerli yöntem, trofektodermden (TE) birkaç hücrenin biyopsisini gerektirir. Bu, plasentayı oluşturan soydur. Bununla birlikte, bu yöntem özel beceriler gerektirir, invazivdir ve yanlış pozitiflerden ve negatiflerden muzdariptir, çünkü TE'deki kromozom sayıları ve fetüse dönüşen iç hücre kütlesi (ICM) her zaman aynı değildir. Hem TE hem de ICM'den kültür ortamına salınan DNA'nın dizilenmesini gerektiren bir teknoloji olan NICS, bu sorunlara bir çıkış yolu sunabilir, ancak daha önce sınırlı etkinliğe sahip olduğu gösterilmiştir. Bu çalışma, kültür ortamı örnekleme yöntemlerini, tüm genom amplifikasyonunu (WGA) ve kütüphane hazırlığını ve analiz yazılımı ile NGS veri analizini içeren NICS'nin tam protokolünü bildirmektedir. Farklı embriyo laboratuvarlarındaki farklı kriyoprezervasyon süreleri göz önüne alındığında, embriyologların IVF laboratuvarının gerçek koşullarına göre seçilebilecek embriyo kültürü ortamını toplamak için iki yöntemi vardır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yardımcı üreme teknolojileri (ART'ler) infertilite tedavisinde giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, IVF gibi ART'nin başarı oranı sınırlı kalmıştır ve gebelik kaybı oranı normal popülasyondan önemli ölçüde daha yüksektir1. Bu sorunların ana nedeni, preimplantasyon insan embriyolarında yaygın olarak bulunan kromozomal anormalliklerdir2. PGT-A, implantasyondan önce embriyoları kromozomal denge açısından taramak için etkili bir yöntemdir 3,4. Bazı çalışmalar PGT-A'nın düşük oranını azaltabileceğini ve gebelik oranını artırabileceğini kanıtlamıştır 5,6,7,8. Bununla birlikte, PGT-A, özel eğitim ve deneyim gerektiren karmaşık teknik uzmanlık gerektirir. İnvaziv embriyo biyopsisi prosedürü de potansiyel olarak embriyolara zarar verebilir9. Çalışmalar, blastomer biyopsisinin sonraki gelişimi engelleyebileceğini ve biyopsi yapılan TE'lerin sayısının implantasyon oranlarını etkileyebileceğini göstermiştir10. Embriyo biyopsisinin uzun dönem biyogüvenlik konusu insanlarda henüz tam olarak değerlendirilmemiş olsa da, hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar embriyo gelişimi üzerindeki olumsuz etkilerini göstermiştir11,12,13.

Önceki raporlar, embriyo gelişimi sırasında kültür ortamına eser miktarda DNA materyali salgılandığını ve kullanılmış embriyo kültür ortamı 14,15,16,17,18 kullanılarak kapsamlı kromozom taraması (CCS) yapmak için çaba gösterildiğini göstermiştir. Bununla birlikte, tespit oranları ve testlerin doğruluğu, kapsamlı klinik kullanım gereksinimlerini karşılamamıştır. Bu çalışma, NICS testinin doğruluğunun yanı sıra tespit oranlarını artırmak için NICS testinde bir iyileşme olduğunu bildirmiştir19. Son yıllarda, blastokoele sıvısı (BF), minimal invaziv PGT-A'nın analitik bir örneği olarak incelenmiştir. Bununla birlikte, blastosist sıvısı örneklerinde başarılı genom çapında amplifikasyon ve saptanabilir DNA oranı %34,8 ile %82 arasında değişmektedir20,21,22. Çeşitli çalışmalarda bildirilen BF hacmi 0.3 nL ila 1 μL arasında değişmektedir. BF'deki düşük DNA miktarı göz önüne alındığında, tespitin başarı oranını ve tutarlılığını artırmak için blastosist sıvısı ve kültür ortamını karıştırarak hücresiz DNA miktarını artırmak mümkündür. Kuznyetsov ve ark.23 ve Li ve ark.24, zona pellucida'yı bir lazerle tedavi etti ve toplam embriyonik DNA miktarını iyileştirmek için blastosist sıvısını kültür ortamına saldı ve WGA'dan sonra kombine ortam/BF örneklerinin amplifikasyon oranı sırasıyla %100 ve %97.5 idi. Jiao ve ark.25 de aynı yöntemi kullanarak %100 amplifikasyon başarı oranı elde etmiştir.

Bu çalışma, harcanan ortam örneği hazırlama, NGS hazırlama ve veri analizini içeren ayrıntılı bir protokol bildirmektedir. Bu çalışmada oositlerden kümülüs hücreleri dikkatlice çıkarılarak intrasitoplazmik tek sperm enjeksiyonu (ICSI) ve blastosist kültürü uygulandı. 4. gün 5/6. gün WGA ve NGS kütüphane hazırlığı için orta toplandı. Bu çalışmada NICS teknolojisi kullanılarak WGA ve NGS kütüphanesi hazırlama adımları yaklaşık 3 saatte kolaylaştırılmış ve CCS sonuçları yaklaşık 9 saat içinde noninvaziv olarak elde edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pekin Üniversitesi Üçüncü Hastanesi Etik Kurulu'ndan etik izin alınmıştır.

1. Hazırlık

NOT: Gerekli malzeme ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

  1. Reaktif
    1. 20-30 μL gamet ortamı/döllenme ortamı ve bölünme/blastosist aşaması kültür ortamı (mineral yağ ile kaplı) ve hyaluronidaz (sıkıca kapatılmış bir tüp içinde) 37 °C'de, %5 CO2 ve% 5 O2'de önceden ısıtın ve dengeleyin (dengeli) kullanımdan önce bir Tri-gaz inkübatörde gece boyunca.
    2. Hyaluronidazı çeker ocakta bir çalışma yüzeyinde 37 °C'ye ısıtın.
    3. Vitrifikasyon tamponu ve numune toplama reaktiflerini üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
  2. Araçları
    1. Ateşle parlatılmış açık ince uçlar oluşturmak için cam Pasteur pipetlerini çekerek numune toplama ve transfer pipetlerini (iç çap ~200 ila 250 μm), denudasyon/sıyırıcı pipetleri (iç çap ≥150 μm, ~130-140 μm ve ~120 μm) ve yıkama için pipetleri (~150 μm iç çap) hazırlayın.
      NOT: Numune toplama/aktarma, ayırma ve yıkama için kullanılan pipetler doğrudan satın alınabilir. Tutma iğneleri ve enjeksiyon iğneleri de doğrudan satın alınabilir.

2. Protokol 1: Numune toplama

  1. Hyaluronidaz ile sindirimden önce oosit-korona-kümülüs kompleksinin (OCCC'ler) ön tedavisi
    1. Hem folikül uyarıcı hormon (FSH) hem de insan menopozal gonadotropin (hMG) preparatları ile yumurtalık stimülasyonu elde edin. Kurşun folikül >18 mm olduğunda, son oosit olgunlaşması için 10.000 IU koryonik gonadotropin (hCG) kullanın.
    2. Tetik atışından 36 saat sonra oosit alımı yapın. Oositleri alın ve mineral yağ ile kaplanmış 2,5 mL önceden ısıtılmış m-HTF ile doku kültürü kaplarına aktarın.
    3. OCCC'leri, bir transfer pipeti kullanarak 1 mL Döllenme Ortamı içeren bir organ kültürü kabının merkezi kuyucuğuna hızla aktarın ve ardından oositlerle 37 °C'de %5 CO 2 ve% 5 O 2 inkübatörde2-4 saat inkübe edin.
  2. OCCC'leri içeren bir organ kültürü kabının merkezi kuyucuğuna 1 mL 37 °C önceden ısıtılmış hyaluronidaz (80 IU / mL) ekleyerek OCCC'leri hyaluronidaz ile sindirin (adım 2.1.3). Son hyaluronidaz konsantrasyonunu 40 IU / mL'de tutun ve iyice karıştırın.
    1. OCCC'leri 37 °C'lik bir termal platformda 2 dakika inkübe edin. Sadece 1-2 kat granüloza hücresi kalana kadar her 30 saniyede bir mikroskop altında değişiklikleri gözlemleyin.
  3. Granüloza hücrelerinin denudasyonu
    1. Oosit kullanımı için sindirilmiş OCCC'leri kültür kabına hızla aktarın ve her kuyucuğu mineral yağ ile kaplayın.
    2. Ayrılan granüloza hücrelerini mikroskop altında gözlemleyin. Oositlerin etrafındaki kalıntı granüloza hücrelerini çıkarmak için oositleri 5 kez nazikçe aspire edin ve serbest bırakın.
    3. Granüloza hücrelerini tamamen çıkarmak için kalan 3 kuyucukta önceki adımı tekrarlayın.
      NOT: Yukarıdaki adımlar (2.1-2.3) her laboratuvarın rutin işleyişine göre gerçekleştirilebilir.
  4. Oositin değerlendirilmesi
    1. Bir mikroskop kullanarak granüloza hücresi çıkarılmasının eksiksizliğini değerlendirin. Hücreler tamamen çıkarılamazsa, şu anda 5 veya daha az granüloza hücresinin tutulması kabul edilebilir.
      NOT: Kümülüs hücreleri hala oosit ile bağlıysa, embriyo bölünme evresi kültür ortamından blastosist aşaması kültür ortamına aktarılmadan önce kalıntı 3. günde çıkarılabilir.
  5. İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI)26 gerçekleştirdikten sonra, oositleri transfer pipetleri kullanarak 20-30 μL bölünme embriyo kültürü ortamı mikrodamlacıklarına (bir oosit bir mikrodamlacığa karşılık gelir) aktarın ve 37 °C, %5 CO2 ve %5O2 inkübatörde inkübe edin.
    1. ICSI gününü 0. gün olarak kaydedin. Döllenme için 1. gün (yaklaşık 18 saat), embriyo bölünmesi için 2. gün (yaklaşık 45 saat) ve embriyo bölünmesi için 3. gün (yaklaşık 68 saat) embriyo değerlendirmesine ilişkin İstanbul konsensüs çalıştayına göre embriyoları kontrol edin ve puanlayın27.
  6. Embriyo yıkama
    1. 37 °C, %5 CO2 ve %5O2 inkübatörde 2. günde doku kültürü kaplarında mineral yağ ile kaplanmış her embriyo için 20-30 μL blastosist kültürü ortamı mikrodamlacıkları hazırlayın.
    2. Mineral yağ ile kaplanmış üç mikro damlacık daha hazırlayın ve 1-3 numaralı yıkama için yeni doku kültürü kaplarını etiketleyin.
    3. 3. gün embriyolarını yıkama mikro damlacıklarına aktarın. Denudasyon pipetleri kullanarak embriyoları her damlacıkta 3 kez nazikçe aspire edin ve serbest bırakın.
      NOT: Bu prosedür aynı zamanda embriyoya bağlı kalan granüler hücrelerin çıkarılmasına da yardımcı olabilir.
    4. Morfolojik puanlama için ortam bölünme aşaması kültür ortamından blastosist kültür ortamına değiştirilmeden önce 3. günde embriyoları mikroskop altında gözlemleyin ve değerlendirin. Kümülüs hücreleri hala embriyoya bağlıysa, kümülüs hücreleri tamamen çıkarılana kadar bir sıyırıcı pipet ile mineral yağ ile kaplanmış önceden ısıtılmış ve dengelenmiş başka bir blastosist kültürü ortamı damlacığında uygun şekilde yukarı ve aşağı pipetleyin.
      NOT: Embriyo bölünme evresi kültür ortamı plakasından blastosist aşaması kültür ortamı plakasına transfer edilmeden önce tüm bağlı kümülüs hücrelerinin 3. günde tamamen çıkarılması gerekiyordu. Kalan kümülüs hücreleri son analize müdahale edecek ve yanlış negatif sonuçlar verecektir.
  7. Kültür ortamı toplama için iki seçenek
    NOT: Tüp bebek merkezi, merkezin kaynaklarına, taleplerine ve tercihlerine bağlı olarak kültür ortamı toplama için iki yöntemden birini seçebilir.
    1. Seçenek 1: Embriyo yıkama ve kültür
      NOT: Bu seçenek, 5. günün sabahı vitrifikasyon yapan IVF laboratuvarları içindir.
      1. Embriyoyu önceden ısıtılmış (37 ° C) kültür ortamının mikro damlacıklarına aktarın ve her embriyoyu 4. gün öğleden sonra pipetleyerek 3 mikro damlacıkta seri olarak yıkayın.
      2. Numune toplama için her embriyoyu önceden ısıtılmış (37 °C) tek bir mikro damlacık kültür ortamına aktarın. Tek bir kültür ortamı damlacığının hacmi 25 μL'yi geçemez.
      3. Blastosist embriyo kültürünü 5/gün 6'da 37 °C, %5 CO2 ve% 5 O2'de gerçekleştirin.
    2. Seçenek 2: Embriyo yıkama ve kültür
      NOT: Bu seçenek, 5. gün öğleden sonra veya 6. günde vitrifikasyon yapan IVF laboratuvarları içindir.
      1. Embriyoyu önceden ısıtılmış (37 °C) 10-15 μL kültür ortamındaki mikrodamlacıklara aktarın ve 5. günde pipetleyerek her embriyoyu 3 mikrodamlacıkta seri olarak nazikçe yıkayın.
      2. Numune toplama için her embriyoyu önceden ısıtılmış (37 °C) tek bir mikro damlacık kültür ortamına aktarın. Tek bir kültür ortamı damlacığının hacmi 15 μL'yi geçemez.
      3. Blastosist embriyo kültürünü 5. günde 6. günde 37 ° C ve% 5 CO2'de gerçekleştirin.
  8. Numune Koleksiyonu
    1. ICM'yi, sıvıyı blastocoel boşluğundan serbest bırakmak için trofektodermde küçük bir delik oluşturmak için trofektodermin hücre bağlantısına odaklanan lazer ışınının hedeflenen noktasından önemli bir mesafede nazikçe ayarlayın. Daha sonra embriyolar, geleneksel işleme göre kriyoprezervasyon için dondurma çözeltisine taşınır.
    2. Her kültürlenmiş embriyodan kültür ortamını 5 μL hücre lizis tamponu içeren bir RNase / DNaz içermeyen PCR tüpüne aktarın.
    3. Negatif kontrol olarak embriyo kültürü için kullanılmadan aynı miktarda kültür ortamı toplayın. Toplanan tüm numuneleri hemen sıvı nitrojen içinde dondurun ve toplandıktan sonra NICS testine tabi tutulana kadar -80 °C'de saklayın.
  9. Protokolde açıklandığı gibi vitrifikasyon gerçekleştirin.

3. Protokol 2: Kütüphane İnşaatı

  1. Kültür ortamı lizisi
    1. 1 μL pozitif kontrolü (10 ng insan gDNA'sı) 199 μL taze kültür ortamı ile seyreltin. İyice karıştırın ve tüpü kısaca santrifüjleyin (5 saniye boyunca 200 x g ).
    2. 10 μL 5 günlük 6 blastosist kültür ortamı, seyreltilmiş pozitif kontrol ve taze kültür ortamını yeni 0.2 mL PCR tüplerine aktarın.
    3. Her bir PCR tüpüne 1 μL MT Enzim Karışımı ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın ve hemen 200 x g'da 2-3 saniye santrifüjleyin.
    4. Adım 3.1.3'teki PCR tüp(ler)ini önceden ısıtılmış bir NICS Numune Hazırlama İstasyonuna koyun ve lizis programını aşağıdaki gibi çalıştırın: 75 °C'de 10 dakika; 95 °C'de 4 dakika; 22 °C'de tutun.
      NOT: Numune hazırlama istasyonu, standart bir PCR makinesiyle karşılaştırılabilir.
      1. Kurulum ekranına girmek için Lysis simgesine tıklayın.
      2. Kontrol modu için Tüp'ü seçin; Numune hacmi için 10 μL giriş; Hotlid kontrolü için Açık'ı seçin ve sıcaklık için 105 °C girin. İlk adımda Duraklat için Hayır'ı seçin. Devam etmek için Tamam'a tıklayın.
      3. Kalan süre, programın sonunu gösteren --:--:-- görünene kadar bekleyin ve ardından programı sonlandırmak için Durdur'u tıklatın.
    5. İşlem tamamlandıktan sonra programı durdurun. Hemen bir sonraki adıma geçin.
  2. Kütüphane Öncesi Hazırlık
    1. Pre-Lib arabelleğini RT'ye çözün. Pipetleyerek iyice karıştırın ve hemen 200 x g'da 2-3 saniye santrifüjleyin.
    2. Kütüphane öncesi reaksiyon için aşağıdaki gibi bir ana karışım hazırlayın: 60 μL Pre-Lib Tamponuna 2 μL Pre-Lib Enzim Karışımı ekleyin, reaksiyonu iyice karıştırın ve kısaca santrifüjleyin.
    3. Önceki adımdan her bir ön işlem görmüş ortam örneğine 60 μL kütüphane öncesi reaksiyon karışımı ekleyin. Pipetleyerek iyice karıştırın ve hemen 200 x g'da 2-3 saniye santrifüjleyin.
    4. Adım 3.2.3'teki PCR tüp(ler)ini Numune Hazırlama İstasyonuna yerleştirin ve ön kütüphane programını aşağıdaki gibi çalıştırın: 95 dakika boyunca 2 °C; 40 sn için 15 °C, 40 sn için 22 °C, 30 sn için 33 °C, 30 sn için 65 °C, 40 sn için 72 °C, 10 sn için 95 °C ve 10 sn için 63 °C olmak üzere 12 döngü; ve 4 °C'de tutun.
      1. Kurulum ekranına girmek için Pre_Lib simgesine tıklayın.
      2. Kontrol modu için Tüp'ü seçin; Numune hacmi için 70 μL giriş; Sıcak kapak kontrolü için Açık öğesini seçin ve sıcaklık için 105 °C girin. İlk adımda Duraklat için Hayır'ı seçin. Devam etmek için Tamam'a tıklayın.
      3. Kalan süre, programın sonunu gösteren --:--:-- gösterene kadar bekleyin ve programı sonlandırmak için Durdur'a tıklayın.
    5. İşlem tamamlandığında programı durdurun. Hemen bir sonraki adıma geçin.
  3. Kütüphane Hazırlığı
    1. Kitaplık Tamponunu RT'ye çözün. Pipetleyerek iyice karıştırın ve hemen 200 x g'da 2-3 saniye santrifüjleyin.
    2. Kütüphane reaksiyonu için aşağıdaki gibi bir ana karışım hazırlayın: 60 μL Kütüphane Tamponuna 1.6 μL Kütüphane Enzim Karışımı ekleyin, reaksiyonu iyice karıştırın ve kısaca santrifüjleyin.
    3. Adım 3.2.3'ten itibaren her bir kütüphane öncesi ürüne 60 μL kütüphane reaksiyon karışımı ve 2 μL Barkod Astarı ekleyin. Reaksiyonu iyice karıştırın ve kısa bir süre santrifüjleyin.
    4. Adım 3.2.3'teki PCR tüp(ler)ini termal döngüleyiciye yerleştirin ve kitaplık hazırlama programını aşağıdaki gibi çalıştırın: 30 saniye boyunca 94 °C; 25 sn boyunca 94 °C, 30 sn için 62 °C ve 45 sn için 72 °C'lik 17 döngü); ve ardından 4 °C'de tutun.
      1. Kurulum ekranına girmek için Lib_Prep simgesine tıklayın.
      2. Kontrol modu için Tüp'ü seçin; Giriş 130 μL Örnek hacim için; Hotlid kontrolü için Açık'ı seçin ve ilgili sıcaklık için 105 °C girin. İlk adımda Duraklat için Hayır'ı seçin. Devam etmek için Tamam'a tıklayın.
      3. Kalan süre, programın sonunu gösteren --:--:-- gösterene kadar bekleyin ve programı sonlandırmak için Durdur'a tıklayın.
  4. Kütüphane Arıtma
    1. Magbeads'i saflaştırma adımından önce en az 2-8 °C'de en az 20 dakika depodan çıkarın. Magbeads'i 20 saniye boyunca vorteksleyin ve karıştırın. Saflaştırma adımı için yeterli sayıda boncuğu yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne ve sıcak boncukları RT'ye dağıtın.
    2. Her kitaplığa 1x Magbeads ekleyin. ≥10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve RT'de 5 dakika inkübe edin.
      NOT: Örneğin, 100 μL kitaplık örneğine 100 μL Magbeads ekleyin.
    3. İnkübasyondan sonra, tüpü kısa bir süre santrifüjleyin ve manyetik bir stand üzerine yerleştirin.
    4. Çözelti berraklaşana kadar yaklaşık 5 dakika bekleyin. Tüpü manyetik stand üzerinde tutarken, çözeltiyi dikkatlice aspire edin ve atın.
    5. Tüpe 200 μL taze hazırlanmış% 80 etanol ekleyin. RT'de 30 saniye inkübe edin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Bir kez daha tekrarlayın.
    6. Etanolü mümkün olduğunca tamamen çıkarın. Manyetik stand üzerindeki boncukları RT'de yaklaşık 5-10 dakika havayla kurutun.
    7. Tüpü manyetik standdan çıkarın, 17.5 μL elüsyon tamponu ekleyin ve boncukları yeniden süspanse etmek için tüpü vorteksleyin. Tüpü kısa bir süre santrifüjleyin ve RT'de 5 dakika inkübe edin.
    8. Tüpü manyetik standın üzerine yerleştirin ve çözelti berraklaşana kadar bekleyin. 15 μL süpernatanı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın.
  5. Kütüphane nicelemesi
    1. Kübit dsDNA HS Test kitlerinin kullanım kılavuzuna göre florometreyi kullanarak saflaştırılmış kitaplıklarıölçün 28. Kütüphanelerin verimi ~15 ila 300 ng arasında değişmektedir.
  6. Kütüphane Havuzu
    1. Havuzlama için her kitaplık örneğinin 10 nanogramını kullanın.
  7. Sıralama
    1. Sıralama kullanıcı kılavuzuna bakın (15027617 v01)29.
    2. Platformda tek bir uçta 50 bp'lik saflaştırılmış kütüphane dizileri, her örnek için yaklaşık 2 milyon okuma sağladı ve 0,03 × dizileme derinliği önerildi.
  8. Veri analizi
    1. Oturum açma sayfasında kullanıcıların Adını ve Parolasını girin
    2. Sisteme giriş yaptıktan sonra Analiz tıklayınız ve karşınıza yeni bir sayfa çıkacaktır. NICS-A sekmesi altındaki Form Gönderimi Oluştur'a tıklayın. Ardından, platform için NGS'yi seçin, şirketi seçin, reaktif için NICSInst'i seçin, Proje Kimliği altındaki kutuya proje bilgilerini girin, analiz tercihlerini ayarlayın ve dosyaları yükleyin. Tüm sıralama dosyaları başarıyla yüklendikten sonra, analizi başlatmak için Gönder'e tıklayın (Şekil 3A).
    3. Gönderilen projelerin listesini görmek için Gönderimleri Görüntüle'ye tıklayın. Analiz tamamlandıktan sonra, projenin durumu Tamamlandı olur ve rapor alanında bir Göster düğmesi görünür. NICS analizinin özet tablosunu görüntülemek için Göster düğmesine tıklayın (Şekil 3B).
    4. Raporları kaydetmek için Raporu dışa aktar düğmesine tıklayın (Şekil 3C).
      NOT: Her analiz için üç tür dosya dışa aktarılacaktır. Her kromozom ve tüm genom için tüm kopya sayısı varyasyonu (CNV) grafiklerini içeren ve "grafik" klasörü altında saklanacak bir grafik dosyası; bu analiz çalışmasının örnek kalite kontrol ayrıntılarını içeren bir elektronik tablo; kullanıcı tarafından özelleştirilen NICS raporlarını içeren bir belge dosyası; ve bu analiz çalışmasının örnek özet bilgilerini içeren bir elektronik tablo.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada önerilen yöntem bir hastaya uygulanmıştır. NICS analizi uygulanmadan önce KİB onayı ve bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Bu çalışmada hastalardan 6 blastosist elde edildi ve 6 embriyonun hepsinde 4. günden 5. güne kadar NICS uygulandı. Ebeveynlerin dengeli translokasyonunun neden olduğu kromozom anormallikleri, NICS testi ile kromozomların beşinde tespit edildi; bu nedenle transfer için kullanılamazlar (Şekil 4A-E). İki embriyonun NICS sonuçları aynı karyotip 45...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Değişiklikler ve sorun giderme

NICS sonuçları ebeveyn genetik materyalleri ile kontamine olmuşsa, tüm kümülüs-korona radiata hücrelerinin çıkarıldığından emin olun ve döllenme için ICSI yapıldığından emin olun. DNA'yı bozabilecek uygun olmayan ortam depolama veya şablon hazırlama işlemlerinden kaçınılır. Çalışma alanı DNase ve RNase dekontaminasyon reaktifleri ile iyice saflaştırıldı. Diğer embriyolardan kontaminasyonu önlemek için, 4. günden itibaren çapraz kontaminasyonu önl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang ve Sijia Lu, Yikon Genomics Co., Ltd.'nin çalışanlarıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, NGS veri analizindeki yardımları için Shiping Bo ve Shujie Ma'ya teşekkür eder. Finansman: Bu çalışma Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (Hibe No. 2018YFC1003100) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL EP tüpü, 0.2 mL PCR tüpüAxygenMCT-150-C, PCR-02-CDNase/RNase içermeyen, Düşük Bağlayıcı PCR tüpleri ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri önerilir.
10 ve mikro; L, 200 ve mikro; L, 1000 ve mikro; L DNase / RNase İçermeyen UçlarAxygenT-300-RS, T-200-YRS, T-1000-BRSBu başka bir marka ile değiştirilebilir / Numune transferi için
% 100 etanolSinopharm Chemical10009218Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir / DNA kütüphanesi saflaştırması için
Barkod Primer1-48NICSI'de Yikon GenomikReaktifiİkinci kütüphane hazırlama kitiKütüphane amplificaton
BD Falcon Organ Kültürü Tabağı için, SterilBD Bioscience363037Bu başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo kültürü için
BD Falcon Doku kültürü Kapları (Kolay Tutuş), SterilBD Bioscience353001Bu başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo kültürü için
BD Falcon Doku kültürü Yemekleri, SterilBD Bioscience353002Bu başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo kültürü için
Hücre Lizis TamponuYikon NICSI'de Genomik Reaktifİlk kütüphane hazırlama kitiKültür ortamı ön işlemi için
Hücre Lizis EnzimiYikon GenomikReaktifiNICSInst kütüphane hazırlama kitiKültür ortamı ön işlemi için
ChromGo yazılımıYikon GenomikVeri analizi
CMPure MagbeadsNICSI'de Yikon GenomikReaktifiİlk kütüphane hazırlama kitiKütüphane saflaştırması için
Cryotop açık systerm  KITAZATO BioPharma81110Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Embriyo vitrifikasyonu için
NICSI'de damıtılmış suYikon GenomikReaktifiİkinci kütüphane hazırlama kiti DNA'yıçözmek için
ES (Vitrifikasyon kiti)  KITAZATO BioPharmaReaktif inVitrifikasyon kitiBu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Embriyo vitrifikasyonu için
HOLDNIGORIGIOMPH-MED-35Bu, diğer
markası/ICSI
Hyaluronidaz çözeltisi için, 80 U/mLSAGEART4007-Aile değiştirilebilir Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Digest oosit-korona-kümülüs kompleksi
ICSIORIGIOMPH-35-35Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir / ICSI
Illumina MiSeq için > SistemIlluminaSY-410-1001Kütüphane dizilimi için
İnkübatörLabotectInkubator C16Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo kültürü için
NICSI'de kütüphane tamponuYikon GenomikReaktifiBirinci kütüphane hazırlama kitiKütüphane amplifikası için
Kütüphane Enzim KarışımıNICSI'de Yikon GenomikReaktifiBirinci kütüphane hazırlama kitiKütüphane için amplificaton
Manyetik StandDynaMagTM-212321DKütüphane arıtma
Mikroskobuiçin OLYMPUS1X71Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo gözlemi için
Mini-santrifüjESSENSCIENELF6Ayırma için
MT Enzim KarışımıYikon GenomikReaktifi NICSInst kütüphane hazırlama kitiKültür ortamı ön işlemi için
NICSInst kütüphane hazırlama kitiYikon GenomicsKT1000800324Tüm genom amplifikasyonu ve kütüphane yapımı
NICSInst Örnek Hazırlama İstasyonuYikon Genomics  ME1001003Amplificate DNA
Nunc IVF 4 Kuyulu ÇanakTermo Bilimsel144444Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo yıkama ve blastosist kültürü için
Pasteur PipetOirgio  MXL3-IND-135Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Embriyo tansfer
Pasteur pipetleriORIGIOPP-9-1000Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Tüp bebek laboratuvarı için
NICSI'de Pre-Lib TamponuYikon GenomikReaktifiİkinci kütüphane hazırlama kitiKütüphane öncesi hazırlık
Pre-Lib EnzimiYikon GenomikReaktifiİlk kütüphane hazırlama kiti,Kütüphane öncesi hazırlık
Qubit® 3.0 FlorometreThermo ScientificQ33216Kütüphane ölçümü için
Quinn'in Avantajı Blastosist OrtamıSAGEART-1029Embriyo blastosist aşaması kültürü için
Quinn'in Avantajı Göğüs Dekoltesi OrtamıSAGEART-1026Bu başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo bölünme aşaması kültürü için
Quinn'in Avantajı Döllenme OrtaSAGEART-1020Bu başka bir marka ile değiştirilebilir / Oosit ve sperm döllenmesi için
Quinn's Advantage m-HTF Medium HEPESSAGEART-1023değiştirilebilir Bu başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo clutrure için
Quinn's Advantage SPS Serum protein İkame KitiSAGEART-3010Bu başka bir marka ile değiştirilebilir / Oositi
yok etmek içinQuinn'in Avantajı Doku kültürü mineral yağıSAGEART-4008PBu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Kültür ortamını kaplamak için
STRIPTİZCİ İPUÇLARI ORİGIOMXL3-IND-135Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Granüloza hücrelerini yok etmek için
Vitrifikasyon Cryotop Açık systermKIZTAZATO81111Bu başka bir marka ile değiştirilebilir/Embriyo vitrifikasyonu için
Vitrifikasyon kiti  KITAZATO BioPharmaVT101Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Embriyo vitrifikasyonu için
VortexerQilinbeierDNYS8Örnek karışımı
VS (Vitrifikasyon kiti)  KITAZATO BioPharmaReaktif inVitrifikasyon kitiBu, başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo vitrifikasyonu için
ZILOS-tk Lazer SistemiHamilton ThorneSINIF 1 lazerBu, başka bir marka ile değiştirilebilir / Yapay blastocoel çökmesi için
için , , , NICSI'de, ile

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
  2. Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationship to morphology and development of human embryos. Reproductive BioMedicine Online. 12 (2), 234-253 (2006).
  3. Harton, G. L. Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array comparative genomic hybridization. Fertility and Sterility. 100 (6), 1695-1703 (2013).
  4. Hodes-Wertz, B. Idiopathic recurrent miscarriage is caused mostly by aneuploid embryos. Fertility and Sterility. 98 (3), 675-680 (2012).
  5. Keltz, M. D. Preimplantation genetic screening (PGS) with Comparative genomic hybridization (CGH) following day 3 single cell blastomere biopsy markedly improves IVF outcomes while lowering multiple pregnancies and miscarriages. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (10), 1333-1339 (2013).
  6. Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 697-703 (2013).
  7. Forman, E. J. In vitro fertilization with single euploid blastocyst transfer: a randomized controlled trial. Fertility and Sterility. 100 (1), 100-107 (2013).
  8. Yang, Z. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Molecular Cytogenetics. 5 (1), 24(2012).
  9. Cimadomo, D. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. BioMed Research International. 2016, 7193075(2016).
  10. Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
  11. Wu, Y. Blastomere biopsy influences epigenetic reprogramming during early embryo development, which impacts neural development and function in resulting mice. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (9), 1761-1774 (2014).
  12. Zhao, H. C. Aberrant epigenetic modification in murine brain tissues of offspring from preimplantation genetic diagnosis blastomere biopsies. Biology of Reproduction. 89 (5), 117(2013).
  13. Zeng, Y. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) influences adrenal development and response to cold stress in resulting mice. Cell and Tissue Research. 354 (3), 729-741 (2013).
  14. Palini, S. Genomic DNA in human blastocoele fluid. Reproductive BioMedicine Online. 26 (6), 603-610 (2013).
  15. Gianaroli, L. Blastocentesis: a source of DNA for preimplantation genetic testing. Results from a pilot study. Fertility and Sterility. 102 (6), 1692-1699 (2014).
  16. Stigliani, S., Anserini, P., Venturini, P. L., Scaruffi, P. Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmentation. Human Reproduction. 28 (10), 2652-2660 (2013).
  17. Stigliani, S. Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1238-1246 (2014).
  18. Wu, H. Medium-Based Noninvasive Preimplantation Genetic Diagnosis for Human α-Thalassemias-SEA. Medicine. 94 (12), e669(2015).
  19. Xu, J. Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11907-11912 (2016).
  20. Capalbo, A. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
  21. Tobler, K. J. Blastocoel fluid from differentiated blastocysts harbors embryonic genomic material capable of a whole-genome deoxyribonucleic acid amplification and comprehensive chromosome microarray analysis. Fertility and Sterility. 104 (2), 418-425 (2015).
  22. Magli, M. C. Preimplantation genetic testing: polar bodies, blastomeres, trophectoderm cells, or blastocoelic fluid? Fertility and Sterility. 105 (3), 676-683 (2016).
  23. Kuznyetsov, V. Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach. PLoS One. 13 (5), e0197262(2018).
  24. Li, P. Preimplantation Genetic Screening with Spent Culture Medium/Blastocoel Fluid for in Vitro Fertilization. Scientific Reports. 8 (1), 9275(2018).
  25. Jiao, J. Minimally invasive preimplantation genetic testing using blastocyst culture medium. Human Reproduction. 34 (7), 1369-1379 (2019).
  26. Palermo, G. D. Births after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter's syndrome. New England Journal of Medicine. 338 (9), 588-590 (1998).
  27. Alpha Scientists in Reproductive, M., & Embryology, E. S. I. G. o. The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Human Reproduction. 26 (6), 1270-1283 (2011).
  28. Thermo Fisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kit. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32851?ICID=search-product (2015).
  29. Miseq system use guide. , Available from: https://support.illumina.com/downloads/miseq_system user _ guide 15027617.html (2016).
  30. Lane, M. Ability to detect aneuploidy from cell free DNA collected from media is dependent on the stage of development of the embryo. Fertility and Sterility. 108 (3), (2017).
  31. Rubio, C. Multicenter prospective study of concordance between embryonic cell-free DNA and trophectoderm biopsies from 1301 human blastocysts. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 223 (5), 751-751 (2020).
  32. Rubio, C. Embryonic cell-free DNA versus trophectoderm biopsy for aneuploidy testing: concordance rate and clinical implications. Fertility and Sterility. 112 (3), 510-519 (2019).
  33. Lledo, B. Consistent results of non-invasive PGT-A of human embryos using two different techniques for chromosomal analysis. Reproductive BioMedicine Online. 42 (3), 555-563 (2021).
  34. Kuznyetsov, V. Minimally Invasive Cell-Free Human Embryo Aneuploidy Testing (miPGT-A) Utilizing Combined Spent Embryo Culture Medium and Blastocoel Fluid -Towards Development of a Clinical Assay. Scientific Reports. 10 (1), 7244(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.

In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

to:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

In the Representative Results, Figure 3 was updated from:

Data analysis software screenshots, report export, computational results, chromatography data analysis.
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Data analysis software interface for embryo implantation potential; input form, result summary, export options.
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.

Etiketler

Non nvaziv Kromozom TaramasT m Genom AmplifikasyonuK t phane Haz rlYeni Nesil DizilemeEmbriyo K lt r OrtamAneuplodi Tespiti

İlgili makaleler