Bu çalışma, embriyo biyopsisini önleyen ve NGS kullanılarak kromozom ploidi tanımlamasını sağlayan, harcanan kültür ortamını kullanan insan embriyolarının kromozom taraması için bir protokol bildirmektedir. Bu makale, kültür ortamının hazırlanması, tüm genom amplifikasyonu (WGA), yeni nesil dizileme (NGS) kütüphanesinin hazırlanması ve veri analizi dahil olmak üzere ayrıntılı prosedürü sunmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Preimplantasyon Embriyolarının Harcanan Kültür Ortamı Kullanılarak Kromozom Taraması: Örnek Toplama ve Kromozomal Ploidi Analizi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Klinik in vitro fertilizasyonda (IVF), PGT-A için geçerli yöntem, trofektodermden (TE) birkaç hücrenin biyopsisini gerektirir. Bu, plasentayı oluşturan soydur. Bununla birlikte, bu yöntem özel beceriler gerektirir, invazivdir ve yanlış pozitiflerden ve negatiflerden muzdariptir, çünkü TE'deki kromozom sayıları ve fetüse dönüşen iç hücre kütlesi (ICM) her zaman aynı değildir. Hem TE hem de ICM'den kültür ortamına salınan DNA'nın dizilenmesini gerektiren bir teknoloji olan NICS, bu sorunlara bir çıkış yolu sunabilir, ancak daha önce sınırlı etkinliğe sahip olduğu gösterilmiştir. Bu çalışma, kültür ortamı örnekleme yöntemlerini, tüm genom amplifikasyonunu (WGA) ve kütüphane hazırlığını ve analiz yazılımı ile NGS veri analizini içeren NICS'nin tam protokolünü bildirmektedir. Farklı embriyo laboratuvarlarındaki farklı kriyoprezervasyon süreleri göz önüne alındığında, embriyologların IVF laboratuvarının gerçek koşullarına göre seçilebilecek embriyo kültürü ortamını toplamak için iki yöntemi vardır.
Giriş
Yardımcı üreme teknolojileri (ART'ler) infertilite tedavisinde giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, IVF gibi ART'nin başarı oranı sınırlı kalmıştır ve gebelik kaybı oranı normal popülasyondan önemli ölçüde daha yüksektir1. Bu sorunların ana nedeni, preimplantasyon insan embriyolarında yaygın olarak bulunan kromozomal anormalliklerdir2. PGT-A, implantasyondan önce embriyoları kromozomal denge açısından taramak için etkili bir yöntemdir 3,4. Bazı çalışmalar PGT-A'nın düşük oranını azaltabileceğini ve gebelik oranını artırabileceğini kanıtlamıştır<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Pekin Üniversitesi Üçüncü Hastanesi Etik Kurulu'ndan etik izin alınmıştır.
1. Hazırlık
NOT: Gerekli malzeme ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
- Reaktif
- 20-30 μL gamet ortamı/döllenme ortamı ve bölünme/blastosist aşaması kültür ortamı (mineral yağ ile kaplı) ve hyaluronidaz (sıkıca kapatılmış bir tüp içinde) 37 °C'de, %5 CO2 ve% 5 O2'de önceden ısıtın ve dengeleyin (dengeli) kullanımdan önce bir Tri-gaz inkübatörde gece boyunca.
- Hyaluronidazı çeker ocakta bir çalışma yüzeyinde 37 °C'ye ısıtın.
- Vitrifikasyon tamponu ve numune....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu çalışmada önerilen yöntem bir hastaya uygulanmıştır. NICS analizi uygulanmadan önce KİB onayı ve bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Bu çalışmada hastalardan 6 blastosist elde edildi ve 6 embriyonun hepsinde 4. günden 5. güne kadar NICS uygulandı. Ebeveynlerin dengeli translokasyonunun neden olduğu kromozom anormallikleri, NICS testi ile kromozomların beşinde tespit edildi; bu nedenle transfer için kullanılamazlar (Şekil 4A-E). İki embriyonun NICS sonuçları aynı karyotip 45.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Değişiklikler ve sorun giderme
NICS sonuçları ebeveyn genetik materyalleri ile kontamine olmuşsa, tüm kümülüs-korona radiata hücrelerinin çıkarıldığından emin olun ve döllenme için ICSI yapıldığından emin olun. DNA'yı bozabilecek uygun olmayan ortam depolama veya şablon hazırlama işlemlerinden kaçınılır. Çalışma alanı DNase ve RNase dekontaminasyon reaktifleri ile iyice saflaştırıldı. Diğer embriyolardan kontaminasyonu önlemek için, 4. günden itibaren çapraz kontaminasyonu önl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang ve Sijia Lu, Yikon Genomics Co., Ltd.'nin çalışanlarıdır.
Teşekkürler
Yazarlar, NGS veri analizindeki yardımları için Shiping Bo ve Shujie Ma'ya teşekkür eder. Finansman: Bu çalışma Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (Hibe No. 2018YFC1003100) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL EP tüpü, 0.2 mL PCR tüpü | Axygen | MCT-150-C, PCR-02-C | DNase/RNase içermeyen, Düşük Bağlayıcı PCR tüpleri ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri önerilir. |
| 10 ve mikro; L, 200 ve mikro; L, 1000 ve mikro; L DNase / RNase İçermeyen Uçlar | Axygen | T-300-RS, T-200-YRS, T-1000-BRS | Bu başka bir marka ile değiştirilebilir / Numune transferi için |
| % 100 etanol | Sinopharm Chemical | 10009218 | Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir / DNA kütüphanesi saflaştırması için |
| Barkod Primer1-48 | NICSI'de Yikon Genomik | Reaktifiİkinci kütüphane hazırlama kiti | Kütüphane amplificaton |
| BD Falcon Organ Kültürü Tabağı için, Steril | BD Bioscience | 363037 | Bu başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo kültürü için |
| BD Falcon Doku kültürü Kapları (Kolay Tutuş), Steril | BD Bioscience | 353001 | Bu başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo kültürü için |
| BD Falcon Doku kültürü Yemekleri, Steril | BD Bioscience | 353002 | Bu başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo kültürü için |
| Hücre Lizis Tamponu | Yikon | NICSI'de Genomik Reaktifİlk kütüphane hazırlama kiti | Kültür ortamı ön işlemi için |
| Hücre Lizis Enzimi | Yikon Genomik | ReaktifiNICSInst kütüphane hazırlama kiti | Kültür ortamı ön işlemi için |
| ChromGo yazılımı | Yikon Genomik | Veri analizi | |
| CMPure Magbeads | NICSI'de Yikon Genomik | Reaktifiİlk kütüphane hazırlama kiti | Kütüphane saflaştırması için |
| Cryotop açık systerm | KITAZATO BioPharma | 81110 | Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Embriyo vitrifikasyonu için |
| NICSI'de damıtılmış su | Yikon Genomik | Reaktifiİkinci kütüphane hazırlama kiti DNA'yı | çözmek için |
| ES (Vitrifikasyon kiti) | KITAZATO BioPharma | Reaktif inVitrifikasyon kiti | Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Embriyo vitrifikasyonu için |
| HOLDNIG | ORIGIO | MPH-MED-35 | Bu, diğer markası/ICSI |
| Hyaluronidaz çözeltisi için, 80 U/mL | SAGE | ART4007-A | ile değiştirilebilir Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Digest oosit-korona-kümülüs kompleksi |
| ICSI | ORIGIO | MPH-35-35 | Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir / ICSI |
| Illumina MiSeq için > Sistem | Illumina | SY-410-1001 | Kütüphane dizilimi için |
| İnkübatör | Labotect | Inkubator C16 | Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo kültürü için |
| NICSI'de kütüphane tamponu | Yikon Genomik | ReaktifiBirinci kütüphane hazırlama kiti | Kütüphane amplifikası için |
| Kütüphane Enzim Karışımı | NICSI'de Yikon Genomik | ReaktifiBirinci kütüphane hazırlama kiti | Kütüphane için amplificaton |
| Manyetik Stand | DynaMagTM-2 | 12321D | Kütüphane arıtma |
| Mikroskobu | için OLYMPUS | 1X71 | Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo gözlemi için |
| Mini-santrifüj | ESSENSCIEN | ELF6 | Ayırma için |
| MT Enzim Karışımı | Yikon Genomik | Reaktifi NICSInst kütüphane hazırlama kiti | Kültür ortamı ön işlemi için |
| NICSInst kütüphane hazırlama kiti | Yikon Genomics | KT1000800324 | Tüm genom amplifikasyonu ve kütüphane yapımı |
| NICSInst Örnek Hazırlama İstasyonu | Yikon Genomics | ME1001003 | Amplificate DNA |
| Nunc IVF 4 Kuyulu Çanak | Termo Bilimsel | 144444 | Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo yıkama ve blastosist kültürü için |
| Pasteur Pipet | Oirgio | MXL3-IND-135 | Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Embriyo tansfer |
| Pasteur pipetleri | ORIGIO | PP-9-1000 | Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Tüp bebek laboratuvarı için |
| NICSI'de Pre-Lib Tamponu | Yikon Genomik | Reaktifiİkinci kütüphane hazırlama kiti | Kütüphane öncesi hazırlık |
| Pre-Lib Enzimi | Yikon Genomik | Reaktifiİlk kütüphane hazırlama kiti, | Kütüphane öncesi hazırlık |
| Qubit® 3.0 Florometre | Thermo Scientific | Q33216 | Kütüphane ölçümü için |
| Quinn'in Avantajı Blastosist Ortamı | SAGE | ART-1029 | Embriyo blastosist aşaması kültürü için |
| Quinn'in Avantajı Göğüs Dekoltesi Ortamı | SAGE | ART-1026 | Bu başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo bölünme aşaması kültürü için |
| Quinn'in Avantajı Döllenme Orta | SAGE | ART-1020 | Bu başka bir marka ile değiştirilebilir / Oosit ve sperm döllenmesi için |
| Quinn's Advantage m-HTF Medium HEPES | SAGE | ART-1023 | değiştirilebilir Bu başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo clutrure için |
| Quinn's Advantage SPS Serum protein İkame Kiti | SAGE | ART-3010 | Bu başka bir marka ile değiştirilebilir / Oositi |
| yok etmek içinQuinn'in Avantajı Doku kültürü mineral yağı | SAGE | ART-4008P | Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Kültür ortamını kaplamak için |
| STRIPTİZCİ İPUÇLARI ORİGIO | MXL3-IND-135 | Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Granüloza hücrelerini yok etmek için | |
| Vitrifikasyon Cryotop Açık systerm | KIZTAZATO | 81111 | Bu başka bir marka ile değiştirilebilir/Embriyo vitrifikasyonu için |
| Vitrifikasyon kiti | KITAZATO BioPharma | VT101 | Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir/Embriyo vitrifikasyonu için |
| Vortexer | Qilinbeier | DNYS8 | Örnek karışımı |
| VS (Vitrifikasyon kiti) | KITAZATO BioPharma | Reaktif inVitrifikasyon kiti | Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir / Embriyo vitrifikasyonu için |
| ZILOS-tk Lazer Sistemi | Hamilton Thorne | SINIF 1 lazer | Bu, başka bir marka ile değiştirilebilir / Yapay blastocoel çökmesi için |
Kaynaklar
- Barlow, P. Early pregnancy loss and obstetrical risk after in-vitro fertilization and embryo replacement. Human Reproduction. 3 (5), 671-675 (1988).
- Munne, S. Chromosome abnormalities and their relationshi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.
In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:
After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).
to:
After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).
In the Representative Results, Figure 3 was updated from:
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.
