Proteotoksik Stresör ile Escherichia coli Tedavisinden Sonra Protein Agregalarının Ekstraksiyonu ve Görselleştirilmesi

Özet

Bu protokol, proteotoksik antimikrobiyal ile tedaviden sonra Escherichia coli'den agrega ve çözünür proteinlerin çıkarılmasını ve görselleştirilmesini açıklar. Bu prosedürün ardından, farklı bakteri suşlarında ve/veya tedaviler arasında in vivo protein agrega oluşumunun nitel bir karşılaştırmasına izin verir.

Özet

Canlı organizmaların çevresel ve hücresel streslere maruz kalması genellikle protein homeostazında bozulmalara neden olur ve protein toplanmasına neden olabilir. Bakteri hücrelerinde protein agregalarının birikmesi, hücresel fenotipik davranışta büyüme oranlarında azalma, stres direnci ve virülans da dahil olmak üzere önemli değişikliklere yol açabilir. Bu stresör aracılı fenotiplerin incelenmesi için çeşitli deneysel prosedürler mevcuttur. Bu makalede, gümüş ruthenium içeren bir antimikrobiyal ile tedavi edildikten sonra farklı Escherichia coli suşlarından agrega ve çözünür proteinlerin çıkarılması ve görselleştirilmesi için optimize edilmiş bir test açıklanmaktadır. Bu bileşiğin reaktif oksijen türleri ürettiği ve yaygın protein toplamasına neden olduğu bilinmektedir.

Yöntem, protein agregalarının ve çözünür proteinlerin işlenmiş ve işlenmemiş hücrelerden santrifüj bazlı ayrıştırılmasını, sodyum dodecyl sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve Coomassie boyama ile daha sonra ayırma ve görselleştirme ile birleştirir. Bu yaklaşım basit, hızlıdır ve farklı E. coli suşlarında protein agrega oluşumunun nitel bir karşılaştırmasına izin verir. Metodoloji, diğer proteotoksik antimikrobiyallerin çok çeşitli bakterilerde in vivo protein toplama üzerindeki etkisini araştırma imkanı da dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalara sahiptir. Ayrıca, protokol proteotoksik maddelere karşı direncin artmasına katkıda bulunan genleri tanımlamak için kullanılabilir. Jel bantlar, özellikle toplanmaya eğilimli proteinlerin daha sonra tanımlanması için kullanılabilir.

Giriş

Bakteriler kaçınılmaz olarak düşük pH da dahil olmak üzere sayısız çevresel strese maruz kalır (örneğin,^memelimidesinde) 1^,2, reaktif oksijen ve klor türleri (ROS/RCS) (örneğin, fagositlerde oksidatif patlama sırasında)^3,4,^5,yüksek sıcaklıklar (örneğin, kaplıcalarda veya ısı şoku sırasında)^6,7ve birkaç güçlü antimikrobiyal (örneğin, bu protokolde kullanılan AGXX)^8. Proteinler bu stresörlerden herhangi birine karşı özellikle savunmasızdır ve maruz kalma, proteinin toplanmasına neden olabilir. Tüm organizmalar protein yanlış katlama ile başa çıkmalarını sağlayan koruyucu sistemler kullanmaktadır⁹. Bununla birlikte, şiddetli stres protein kalite kontrol makinelerini bunaltabilir ve proteinlerin ikincil ve/veya üçüncül yapısını bozabilir ve sonuçta proteinleri devre dışı bırakabilir. Sonuç olarak, protein agregaları bakteri üreme ve hayatta kalma, stres direnci ve virülans için gerekli kritik hücresel fonksiyonları ciddi şekilde bozabilir¹⁰. Bu nedenle, protein toplama ve bakterilerdeki sonuçlarına odaklanan araştırmalar, bulaşıcı hastalık kontrolü üzerindeki potansiyel etkisi nedeniyle ilgili bir konudur.

Isı kaynaklı protein açma ve toplama genellikle geri^{dönüşümlüdür 7}. Buna karşılık, oksidatif stres gibi diğer proteotoksik gerilmeler, spesifik amino asit yan zincirlerinin oksidasyonu yoluyla geri dönüşü olmayan protein değişikliklerine neden olabilir ve bu da proteinin yanlış/ yanlış katlanmasına ve sonunda protein toplama⁴. Çözünmeyen protein agregalarının stres kaynaklı oluşumu, moleküler refakatçiler ve maya ve bakterilerdeki koruyucu işlevleri bağlamında kapsamlı bir şekilde incelenmiştir^11,12,13. Çözünmeyen protein agregalarının izolasyonu ve analizi için çeşitli biyokimyasal teknikler kullanan çeşitli protokoller yayınlanmıştır^14,15,16,17. Mevcut protokoller esas olarak ısı şoku ve/veya moleküler refakatçilerin tanımlanması üzerine bakteriyel protein toplamayı incelemek için kullanılmıştır. Bu protokoller kesinlikle sahaya ilerlemekle birlikte, deneysel prosedürlerde bazı büyük rahatsızlıklar vardır, çünkü (i) hücre bozucuların, Fransız basınının ve/veya sonication^{14 , 15,17}veya (iii) zaman alıcı tekrarlanan kullanımı da dahil olmak üzere 10 L 14^,17, (ii) karmaşık fiziksel bozulma süreçlerine kadar büyük bir bakteri kültürü hacmi gerektirirler. yıkama ve kuluçka adımları^15,16,17.

Bu makale, önceki yaklaşımların sınırlamalarını ele almayı amaçlayan ve proteotoksik antimikrobiyal yüzey kaplaması ile tedaviden sonra iki farklı Escherichia coli suşunda oluşan protein agregalarının miktarının analiz edilmesine izin veren değiştirilmiş bir protokolü açıklar. Kaplama, askorbik asit ile şartlandırılmış metal-gümüş (Ag) ve ruthenium (Ru) oluşur ve antimikrobiyal aktivitesi reaktif oksijen türlerinin üretilmesi ile elde edilir^8,18. Burada, antimikrobiyal bileşik ile tedaviden sonra bakteri kültürünün hazırlanmasının ayrıntılı bir açıklaması ve antimikrobiyal konsantrasyonun artmasına karşı belirgin duyarlılık profillerine sahip iki E. coli suşunun maruz kalması üzerine protein toplama durumunun karşılaştırılması yer alıyor. Açıklanan yöntem ucuz, hızlı ve tekrarlanabilir ve diğer proteotoksik bileşiklerin varlığında protein toplamayı incelemek için kullanılabilir. Ek olarak, protokol, belirli gen silmelerinin çeşitli farklı bakterilerde protein toplama üzerindeki etkisini analiz etmek için değiştirilebilir.

Protokol

1. E. coli suşlarının stres tedavisi MG1655 ve CFT073

1. Sırasıyla tek bir kommensal E. coli suşu MG1655 ve üropatojen E. coli (UPEC) suşu CFT073 kolonisi ile 5 mL lysojeny et suyu (LB) ortamını aşıleyin ve 37 °C ve 300 rpm'de 14-16 saat (bir gecede) kuluçkaya yatırın.
   NOT: Escherichia coli CFT073 bir insan patojenidir. CFT073'ün kullanımı Biyogüvenlik Seviye-2 sertifikalı bir laboratuvarda uygun biyogüvenlik önlemleri ile yapılmalıdır.
2. Her suş, 70 mL 3-(N-morfolino)propansülfonic asit (MOPS)-glikoz (MOPS-g) ( Tablo1) içeren 500 mL'lik bir şişeye seyreltin ve 0,1 600 nm (OD₆₀₀₎değerinde optik yoğunluğa kadar orta. Orta kütük aşamasına ulaşılana kadar 37 °C ve 300 rpm'de kuluçkaya yaslanın (OD₆₀₀ = 0.5-0.55).
3. Her kültürün 20 mL'lik kısmını önceden ısıtılmış üç 125 mL şişeye aktarın ve 37 °C ve 300 rpm'de 2 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Örneklerin zamanında işlenmesi gerektiğinden, aynı anda en fazla 6 kültürü işleyin.
4. MOPS-g ortamında 2 mg/mL konsantrasyonda bir antimikrobiyal bileşik çözelti hazırlayın. Belirtilen konsantrasyonlara ulaşmak için her kültüre antimikrobiyal ekleyin. İşlenmemiş kontrol için gerekli MOPS-g orta hacmini ekleyin.
   NOT: Bileşik parçacıkların eşit bir şekilde dağıtılmasına izin vermek ve sedimansasyonu önlemek için 2 mg/mL antimikrobiyal çözeltiyi girdap.
5. Kültürleri 37 °C ve 300 rpm'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.

Şekil 1: Escherichia coli stres tedavisi. Bakteri kültürleri MOPS-g'de yetiştirilir ve orta kütük fazı ulaştığında gümüş-ruthenium içeren antimikrobiyalin belirtilen konsantrasyonları ile tedavi edilir. Kısaltmalar: LB = lysogeny et suyu; Ag-Ru = gümüş-ruthenium; MOPS-g = 3-(N-morpholino)propansülofik asit (MOPS)-glikoz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Bakteri hücresi örneklerinin toplanması

1. 45 dakikalık stres tedavisinden sonra, her kültürün_{OD 600'ü} belirleyin. Her örnek için, 4 mL OD₆₀₀ = 15 mL santrifüj tüplerinde 3.000 × g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüjleme ile eşdeğer hücreler hasat edin.
2. Süpernatant'ı tamamen çıkarın ve hücre peletlerini 50 μL buz gibi lizis tamponunda yeniden depolar (Tablo 1). Örnekleri buzda 30 dakika kuluçkaya yatır.
   NOT: Bu lizis adımı peptidoglikan tabakasını bozayır. Her zaman yeni hazırlanmış lizis tamponu kullanın.
3. Numuneleri 1,7 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de dondurun.

Şekil 2: Bakteriyel numune toplama. Hücre örnekleri santrifüjleme ile toplanır ve lizis tamponunda yeniden depolanır ve ardından -80 °C'de depolanır.

3. Çözünmeyen protein agregalarının çıkarılması

1. Buzdaki örnekleri eritin.
   NOT: Donma-çözülme döngüsü hücre lizizine katkıda bulunur.
2. 360 μL buz gibi tampon A (Tablo 1) ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın.
   NOT: Ozmotik şok hücre lizizine de katkıda bulunacaktır.
3. Numuneyi ~ 200 μL 0,5 mm cam boncuk içeren 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 1.400 rpm'de sallanan bir termokserde 8 °C'de 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
   NOT: Bu adım hücrenin fiziksel bozulmasına neden olur. Protein bozulmasını en aza indirmek için bir proteaz inhibitörü kullanılabilir. Kesinti 4 °C'de yapılabilir. Cam boncuk kullanımının maya^19'daküçük bir protein alt kümesinin toplanmasına neden olduğu bildirilmiştir.
4. Cam boncukları yerleştirmek için titremeden buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya yatın. Hücre lisatının 200 μL'lik kısmını 1,7 mL mikrosantrifüj tüplere aktarın.
   NOT: Cam boncukların aktarılmasından kaçının.
5. 16.000 × g ve 4 °C'de 20 dakika santrifüj. Çözünür proteinler içeren süpernatantı toplayın ve bölüm 4'e geçin.
6. Pipet kullanarak peletin 200 μL buz gibi tampon A(Tablo 1)ile yeniden depolansın. 16.000 × g ve 4 °C'de 20 dakika santrifüj. Üst kuruluşu dikkatlice çıkarın.
7. 200 μL buz gibi tampon B ekleyin (bkz. Tablo 1 ve Malzeme Tablosu)ve peletin pipetlenerek dikkatlice yeniden depolanarak yeniden depolanır.
   NOT: İyonik olmayan deterjan membran proteinini çözünür.
8. Santrifüjü 16.000 g × ve 4 °C'de 20 dakika boyunca tekrarlayın. Üst saltanayı dikkatlice çıkarın.
9. Peletin boru ile 200 μL soğuk tampon A(Tablo 1)olarak yeniden depolansın. 16.000 × g ve 4 °C'de 20 dakika santrifüj. Üst saltanayı tamamen çıkarın.
10. Peleti 100 μL 1x azaltıcı SDS numune tamponunda (Tablo 1) yeniden sakla ve bir termokserde 95 °C'de 5 dakika kaynatın.
11. Daha sonra devam etmek için numuneyi -20 °C'de saklayın veya ayırma için hemen bir SDS poliakrilamid jeline yükleyin.

Şekil 3: Çözünmeyen protein agregalarının ekstraksiyonu. Protein agregalarının çıkarılması, hücre bozulması, protein agregalarının çözünür proteinlerden ayrılması, membran proteinlerinin çözünmesi ve yıkanması dahil olmak üzere bir dizi adımı içerir. Kısaltma: SDS = sodyum dodecyl sülfat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Çözünür protein numunesi hazırlama

1. 3.6. adımdan 4 hacim çözünür protein örneği ile 1 hacim 0 trikloroasetik asit (TCA) karıştırın.
   NOT: TCA'nın taşınması için duman davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipman ve onaylanmış atık bertaraf prosedürü gerekir.
2. Protein çökeltme için 4 °C'de 10 dakika kuluçkaya yaslanın.
   NOT: Beyaz çökeltici çok yakında görünecektir.
3. Santrifüj, 5 dakika boyunca 21.000 × g ve 4 °C'de çökeltmek ve süpernatantı çıkarmak için. Hücresel kalıntıları gidermek için peleti 200 μL buz gibi asetonla yıkayın. 21.000 × g ve 4 °C'de 5 dakika santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Bu eylemleri adım 4.3'te toplam üç kez yineleyin.
4. Açık kapaklı mikrosantrifüj tüplerini, kalan asetonları peletten çıkarmak için 37 °C'de bir termomikser içine yerleştirin.
   NOT: 5 dakikadan fazla inkübasyon protein peletinin çözünürlüğü azaltabilir.
5. 100 μL 1x azaltıcı SDS tamponu ekleyin (Tablo 1) ve peletin tamamen çözün. Numuneyi 95 °C'de 5 dakika kaynatın.
6. Numuneyi daha sonra devam etmek için -20 °C'de saklayın veya ayırma için hemen bir SDS poliakrilamid jeline yükleyin.

Şekil 4: Çözünür proteinlerin hazırlanması. Çözünür proteinin hazırlanması, trikloroasetik asit ile bir çökeltme adımı ve buz gibi aseton ile tekrarlanan yıkamayı içerir. Kısaltmalar: TCA = trikloroasetik asit; SDS = sodyum dodecyl sülfat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. SDS-PAGE kullanılarak çıkarılan protein agregalarının ayrılması ve görselleştirilmesi

1. % 12 SDS-poliakrilamid jel hazırlayın.
   1. İki ayırma jeli için pipet 5,1 mL çift damıtılmış su (ddH₂O), 3,75 mL Tris-HCl (pH 8,8), (w/v) SDS'nin 7,5 mL'si, 0 akrilamid/bisacrylamide (29:1) çözeltisinin 6 mL'si, w/v amonyum persülfatın 75 mL'si ve 10 mL tetrametrinediamin (TEMED) 15 mL santrifüj tüpüne karışır ve hava kabarcıkları sokmadan hafifçe karıştırın. Jelin cam plakalar içinde 1 mL pipet kullanarak dökün ve üst 2 cm'yi karışımdan arındırın. Ayırma jelinin üstüne% 70 etanol ekleyin ve iki katman arasında eşit bir arayüze izin verin.
   2. Ayırma jelinin polimerizasyonundan sonra, istifleme jelini 1.535 mL ddH₂O, 625 mL Tris-HCl (pH 6.8), 12.5 mL% 20 (w/ v) SDS pipetleyerek hazırlayın, 0 akrilamid/bisacrylamide (29:1) çözeltisinin 335 mL'si, w/v amonyum persülfatın 12,5 mL'si ve 2,5 mL TEMED. Etanol ayırma jellerinden çıkarın ve istifleme jeli çözeltisini ekleyin. Hava kabarcıkları tanıtmadan istediğiniz sayıda cepli bir tarak takın. Polimerizasyona 20-30 dakika izin verin.
2. Her numune ve protein merdiveninin 4 μL'sini ayrı kuyulara yükleyin ve jelleri Tris-Glisine çalışan tamponda(Tablo 1)oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 144 V'ta çalıştırın.
   NOT: Bromophenol bandı jelden çıkmak üzereyken jeli durdurun.
3. Jelleri önceden ısıtilmiş bir Fairbanks çözeltisi A(Tablo 1)içinde bir rocker üzerinde 30 dakika lekelendir.
4. Jelleri önceden ısıtilmiş bir Fairbanks çözümü D'de(Tablo 1)bir rocker üzerinde istenen arka plana (örneğin, bir gecede) kadar renksizleştirilmiştir.

Şekil 5: Protein ayırma ve görselleştirme. Örnekler SDS-PAGE ile ayrılır ve Coomassie boyama ile görselleştirilir. Kısaltma: SDS-PAGE = sodyum dodecyl sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Şekil 6: Kommensal Escherichia coli suşu MG1655 ve UPEC suşu CFT073'te antimikrobiyal kaynaklı protein toplamanın temsili sonuçları. E. coli suşları MG1655 ve CFT073 belirtilen konsantrasyonlarla tedaviden önce MOPS-g ortamlarında 37 °C ve 300 rpm'de OD₆₀₀= 0.5-0.55 arasında yetiştirildi (-, 0 mg/mL; +, 175 mg/mL; ++, 200 mg/mL) a...

Tartışma

Bu protokol, farklı E. coli suşlarının proteotoksik bir antimikrobiyal ile tedavisinden sonra protein agrega oluşumunun analizi için optimize edilmiş bir metodolojiyi açıklar. Protokol, tedavi edilen ve işlenmemiş E. coli hücrelerinden çözünmeyen ve çözünür protein fraksiyonlarının aynı anda çıkarılmasını sağlar. ^{14 , 15 , 16,20}hücrelerinden protein agrega yalıtımı için mevcut protokolle...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
< güçlü > Kimyasallar / Reaktifler< / güçlü >
Aseton	Fisher Scientific	67-64-1
%30 Akrilamid/Bisakrilamid çözeltisi 29:1	Bio-Rad	1610156
Amonyum persülfat	Millipore Sigma	A3678-100G
Benzonaz	nükleaz Sigma	E1014-5KU
Bluestain 2 Protein merdiveni, 5-245 kDa	GoldBio	P008-500
β-merkaptoetanol	Millipore Sigma	M6250-100ML
Bromofenol	mavisi GoldBio	B-092-25
Coomassie Brilliant Blue R-250	MP Biyomedikal LLC	821616
D-Glikoz	Kırlangıç Sigma	G8270-1KG
D-Sükroz	Acros Organics	57-50-1
Etilendiamin tetra asetik asit (EDTA)	Sigma-Aldrich	SLBT9686
Buzul Asetik asit	Millipore Sigma	ARK2183-1L
Gliserol,% 99	Sigma-Aldrich	G5516-1L
Glisin	GoldBio	G-630-1
Hidroklorik asit, ACS reaktifi	Sigma-Aldrich	320331-2.5L
İzopropanol (2-Propanol)	Sigma	402893-2.5L
LB suyu (Miller)	Millipore Sigma	L3522-1KG
agar ile LB suyu (Miller)	Millipore Sigma	L2897-1KG
Lizozim GoldBio		L-040-25
10x MOPS Tamponu	Teknova	M2101
Nonidet P-40	Thomas Scientific	9036-19-5
Potasyum fosfat, dibazik	Sigma-Aldrich	P3786-1KG
Potasyum fosfat, monobazik	Acros Organics	7778-77-0
Sodyum dodesil sülfat (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771-500G
Tetrametiletilendiamin (TEMED)	Millipore Sigma	T9281-50ML
Tiamin	Sigma-Aldrich	T4625-100G
% 100 Trikloroasetik asit	Millipore Sigma	T6399-100G
Tris tabanı	GoldBio	T-400-1
Malzeme / Ekipman< / güçlü >
Santrifüj tüpleri (15 mL)	Alkali Scientific	JABG-1019
Erlenmeyer şişesi (125 mL)	Carolina	726686
Erlenmeyer şişesi (500 mL)	Carolina	726694
Dondurucu: -80 derece; C	Fisher Scientific
Cam boncuklar (0,5 mm)	BioSpec Products	1107-9105
Mikrosantrifüj	Hermle	Z216MK
Mikrosantrifüj tüpleri (1,7 mL)	VWR International	87003-294
Mikrosantrifüj tüpleri (2,0 mL)	Axygen Maxiclear Mikrotüpler	MCT-200-C
Plastik küvetler	Fischer Scientific	14-377-012
Güç kaynağı	ThermoFisher Scientific	EC105
Rocker	Alkali Scientific	RS7235
Çalkalama inkübatörü (37 ° C)	Benchmark Scientific
Küçük cam plaka	Bio-Rad	1653311
Spacer plakalar (1 mm)	Bio-Rad	1653308
Spektrofotometre	Termobilimsel	3339053
15 mL santrifüj tüpleri için masa üstü santrifüj	Beckman-Coulter
Dikey jel elektroforez odası	Bio-Rad
Vortexer	Fisher Vortex Genie 2	12-812
Thermomixer	Benchmark Scientific	H5000-HC
10 kuyulu tarak	Bio-Rad	1653359