Alternatif ekleme (AS) ve alternatif poliadenilasyon (APA), transkript izoformlarının ve ürünlerinin çeşitliliğini genişletir. Burada, deneysel koşullar arasında değişen AS ve APA'yı tespit etmek ve görselleştirmek için toplu RNA-seq ve 3' uç dizileme testlerini analiz etmek için biyoinformatik protokolleri açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
RNA-seq Verilerinde Alternatif Ekleme ve Poliadenilasyonun Tanımlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Deneysel / biyolojik koşullar boyunca diferansiyel gen ekspresyonunu (DGE) ölçmek için RNA-Seq'in tipik analizinin yanı sıra, RNA-seq verileri ekzon seviyesindeki diğer karmaşık düzenleyici mekanizmaları keşfetmek için de kullanılabilir. Alternatif ekleme ve poliadenilasyon, transkripsiyon sonrası seviyede gen ekspresyonunu düzenlemek için farklı izoformlar üreterek bir genin fonksiyonel çeşitliliğinde çok önemli bir rol oynar ve analizleri tüm gen seviyesine sınırlamak bu önemli düzenleyici katmanı kaçırabilir. Burada, Bioconductor ve DEXSeq, Limma paketinden diffSplice ve rMATS dahil olmak üzere diğer paketleri ve fonksiyonları kullanarak, koşullar arasında diferansiyel ekzon ve poliadenilasyon sahası kullanımının tanımlanması ve görselleştirilmesi için ayrıntılı adım adım analizler gösteriyoruz.
Giriş
RNA-seq, yıllar boyunca tipik olarak diferansiyel gen ekspresyonunu ve gen keşfini tahmin etmek için yaygın olarak kullanılmıştır1. Ek olarak, farklı izoformları ifade eden gen nedeniyle değişen ekzon seviyesi kullanımını tahmin etmek için de kullanılabilir, böylece transkripsiyon sonrası seviyede gen düzenlemesinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunur. Ökaryotik genlerin çoğunluğu, mRNA ekspresyonunun çeşitliliğini arttırmak için alternatif ekleme (AS) ile farklı izoformlar üretir. AS olayları farklı kalıplara ayrılabilir: bir ("kaset") ekzonun yan tarafındaki intronlarla birlikte transkriptten tamamen çıkarıldığı tam ekzonların (SE) atlanma....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Analizde kullanılan aletlerin ve R paketlerinin kurulumu
- Conda, paketlerin tüm platformlardaki bağımlılıklarıyla birlikte kolayca kurulmasını sağlayan popüler ve esnek bir paket yöneticisidir. Analiz için gerekli araçları/paketleri yüklemek için kullanılabilecek 'conda'yı yüklemek için 'Anaconda' (conda paket yöneticisi) kullanın.
- https://www.anaconda.com/products/individual#Downloads'dan sistem gereksinimlerine göre 'Anaconda'yı indirin ve grafik yükleyicideki istemleri izleyerek yükleyin. Linux komut satırına aşağıdakileri yazarak 'conda' kullanarak gerekli tüm paketleri yükleyin.
conda....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yukarıdaki adım adım iş akışını çalıştırdıktan sonra, AS ve APA analiz çıktıları ve temsili sonuçlar, aşağıdaki gibi oluşturulan tablolar ve veri grafikleri şeklindedir.
GİBİ:
AS analizinin ana çıktısı (diffSplice için Ek Tablo 1; DEXSeq için Tablo 2), koşullar arasında diferansiyel kullanımı gösteren ekzonların bir listesi ve istatistiksel anlamlılığa göre sıralanmış, bir veya daha fazla kurucu ekzonun önemli genel ekleme aktivitesini göst.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada, toplu RNA-Seq ve 3' uç dizileme verilerinde AS ve APA'yı saptamak için ekzon tabanlı ve olay tabanlı yaklaşımlar değerlendirildi. Ekzon tabanlı AS yaklaşımları, hem diferansiyel olarak eksprese edilen ekzonların bir listesini hem de genel gen seviyesi diferansiyel ekleme aktivitesinin istatistiksel önemine göre sıralanmış bir gen seviyesi sıralaması üretir (Tablo 1-2, 4-5). Diferansiyel kullanım, bir ekzonun diferansiyel log kıvrım değişimini aynı gen içindeki diğer ekzonların ortalama log .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Avustralya Araştırma Konseyi (ARC) Future Fellowship (FT16010043) ve ANU Futures Scheme tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hesaplamalı çalışma |
Kaynaklar
- Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation. Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).
- Wang, Y., et al. Mechanism of alternative splicing and its regulation. Biome....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
