Floresan In Situ Hibridizasyon, Lectin Boyama ve Görüntüleme Yoluyla Gut Mikrobiyota-konak Etkileşimlerinin Görselleştirilmesi

Mikrobiyal görselleştirme teknikleri, Antonie Van Leeuwenhoek'in mikroskobunu kullanarak 17. O zamandan beri, bir konak-mikrobiyota1 ile ilişkili yaşayan bakteri, mantar ve virüs konsorsiyumunun mekansal organizasyonunu görselleştirmek için çok sayıda teknik geliştirilmiştir. Bu mikropların lokalizasyonunu kolaylaştırmak, hayvan konaklarında işlevlerini belirlemek için gereklidir. Bakterilerin biyojeografisi, kommensal ve patojenik taksonlarda önemlidir, çünkü belirli yerlere (örneğin epitel), besinsel substratlara ve belirli mikroplara yakınlık, türlerin ve krallıklar arası etkileşimlerin altında kalan metabolitlerin bakteriyel üretimini dikte edebilir.

Ağız boşluğu, bağırsak veya akciğer gibi çeşitli farklı vücut bölgelerindeki bakterileri ve konak dokuları ayıran önemli bir yapı mukus - hem konak epitel hücrelerine mikrobiyal translokasyonu önleyen hem de mikrobiyota için beslenme kaynağı görevi ^görür2,3,4 . Bu bariyerdeki ihlalleri ve değişiklikleri karakterize etmek, tek başına sıralanarak elde edilmeyecek konak-mikrobiyota etkileşimleri hakkında mekanistik içgörüye yol açan önemli bir öneme ^{sahiptir5,6,7}. Örneğin, görüntüleme, antibiyotik maruziyetinin mukus tabakasını ve mikrobiyota organizasyonunu bozabileceğinin keşfedilmesini ^sağladı7,8 ve müshillerin mukusu yetersiz hale getirince bağışıklık parametrelerindeki büyük değişikliklerle ilişkili ^olabilir5.

Bu protokol, Johansson ve ^Hansson9'un çalışmaları üzerine inşa edilen mikrobiyota ve konak dokusunun sabitlenerek, boyanarak ve görüntülenmesi için genel bir çerçeveyi özetlemektedir (Şekil 1). Bu protokol bağırsak bölümleri bağlamında modellenirken, diğer doku tiplerine kolayca uyarlanabilir. Bu protokol, deneysel hayvan veya insan klinik örneklerinin işlenmesini sağlar; her iki tür numunenin işlenmesine ilişkin notlar eklenmiştir. Burada sunulan örnekte, konak epitel ve luminal bakteriler aynı anda 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) boyama, floresan (FITC) konjuge lektin ile mukus, Ulex europaeus aglutinin I (UEA-1) ve FISH kullanılarak belirli bir bakteri takson ile etiketlenmiştir. FISH probları genellikle bir taksonun 16S rRNA genlerine karşı, yüksek kopya transkriptinin bağlanmasından yüksek sinyali sağlamak için tasarlanmıştır.

Bu örnekte, prob Muribaculaceae bakteri ailesinin 16S rRNA'sını hedeflememektedir (Şekil 2). Bununla birlikte, lekeler uygun biyolojik soruyu karşılamak için farklı FISH probları ve / veya lektinlerle kolayca ikame edilir. Önceden doğrulanmış FISH probları, rRNA hedefli oligonükleotid probları için çevrimiçi bir kaynak olan ^{ProbeBase10'da} veya bir ribozomal RNA veritabanı olan ^SILVA11'de bulunabilir. Yeni probların tasarımı için okuyucu HiPR-FISH8 veya Oligominer12 gibi yeni işlem hatlarına başvurabilir. Bu protokolü kullanarak, bağırsak lümeninde bakterilerin yakın paketlenmesi ve sindirim sistemi boyunca bağırsak mukusunun farklı özelliklerini gözlemlemek mümkündür. Burada açıklanan iş akışı, mikrobiyotanın konak ortamının uzamsal bağlamında nicel analizini sağlar.

Bu protokolde açıklanan tüm hayvan deneyleri ve doku toplama, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi (CCAC) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve British Columbia Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı. Mikropsuz İsviçre Webster fareleri kullanıldı. Tüm hayvanlar 8-10 haftalıktı, her iki cinsiyet de kullanıldı ve tüm fareler kafes başına en az iki fare ile birlikte barındırıldı. Hayvanlar ikincil servikal çıkık veya kardiyak delinme ile karbondioksit kullanılarak ötenaziye tabi edildi.

1. Bir görüntüleme deneyi tasarlamak: dikkat edilmesi gerekenler ve örnek toplama

1. FISH prob tasarımı
   1. Uygun bir FISH probu varsa, etiketli hücrelerde arka plana kıyasla güçlü bir sinyal gösteren önceden yayımlanmış bir tane seçin.
   2. Hedef bakterilerin sabit örneklerine bağlanma ve diğer bakterilere hedef dışı bağlanma verimliliklerini belirlemek için yeni probları in vitro olarak doğrulayın.
   3. Hedef organizmadan 16S dizilerine karşı veya analiz edilecek örneklerden 16S rRNA dizilimine karşı kullanılacak tüm 16S FISH problarını kontrol edin, böylece beklenen pozitif eşleşme oranının mevcut olduğundan ve probların özellikle diğer mikrobiyota üyelerine bağlanmayacağından emin olun.
      1. Probların ve hedeflerinin potansiyel bağlamasını değerlendirmek için Clustal ^Omega13 gibi bir araç kullanarak FISH problarını tam uzunlukta dizilere veya amplicon dizisi varyantlarına göre hizalayın.
      2. Siliko testine ek olarak, saf kültürler üzerinde doğrulanmamış probların FISH boyama doğruluğunu ve seviyesini test ^edin8,14.

NOT: Birden fazla topluluk üyesini lekelerken, kullanılan floroforlar heyecan ve emisyon spektrumlarında örtüşmezse (doğrusal karıştırma yapma yeteneğine sahip bir sistemde görüntüleme olmadıkça) problar kombinatorially (örneğin, aileye özgü bir prob ve cinse özgü bir prob kombinasyonu) kullanılabilir. Ayrıca, özgüllük kontrolleri/karıştırılmış problar dahil edilerek veya floresan olmayan problarla rekabet edilerek özgüllük gösterilebilir.

1. Örnek tipleri ve doku toplama
   1. Keskin ve temiz aletler kullanarak, görüntüleme için gnotobiyotik İsviçre Webster farelerinden bağırsak segmentlerini kesin. Numuneyi mümkün olduğunca rahatsız etmeyi en aza indirin ve görüntüleme alanını etkilememek için bölümleri kenarlarından idare edin. Bozulmayı önlemek için diseksiyondan sonra örneği mümkün olan en kısa sürede düzeltin.
      NOT: Hayvan çalışmaları için sağlam, iltihapsız bağırsak bölümleri tercih edilir; membran, ışık ve mukozal organizasyonun bozulmadan kalmasına yardımcı olacaktır.
   2. Aletleri numuneler ve siteler arasında% 70 etanol ile silerek temizleyin. Mukus ve bağırsak mimarisinin yanı sıra mikrobiyota farklı yerlerde önemli ölçüde değiştiği için tutarlı bağırsak konumlarını örneklemeye özen ederek bağırsak kesit / biyopsi yeri başına en az üç biyolojik çoğalır elde edin.

2. Doku örneği fiksasyonu ve infiltrasyon

1. Fiksasyon
   1. Aşağıdaki oranlarla uyumlu bir kapta taze metanonda hazırlayın: % 60 mutlak metanol,% 30 kloroform ve% 10 buzul asetik asit. Bu kimyasalların her birini duman kaputuna dağıtın. Kapağı kırarak havalandırılabilen bir kap seçin. Metakarn polistiren ile uyumlu olmadığı için, kloroform ve buzul asetik asit için cam dereceli silindirler / serolojik pipetler kullanarak polietilen bir kapta hazırlayın.
      NOT: Karıştırma sırasında dumanlar üretilir ve kabın içinde basınç birikmesine neden olabilir. Numuneler aktif olarak eklenmezse, kabın duman davlumbazından çıkarıldıktan sonra nispeten sıkıca kapalı tutulması önerilir. Kloroform toksiktir; cildi soluma, yutma veya emmeyin. Metanol toksiktir ve oldukça yanıcıdır; cildi soluma, yutma veya emmeyin. Buzul asetik asit yanıcıdır ve cilt ve gözler için oldukça aşındırıcıdır.
   2. Dağıttıktan sonra kabı kapatın, karıştırmak için döndürün ve sonra havalandırma; gaz çıkarma durana kadar (ve basınç artık kapağın altında kayda değer bir şekilde birikmeyin) bunu tekrarlayın.
      NOT: Metakarın drenajlara atmayın; kurumsal yönergelere göre tehlikeli kimyasal atıkları toplamak ve bertaraf etmek. Histoloji kasetlerini etiketlemek için bir kalem kullanın, çünkü metakarn çözeltisinde birçok kalem mürekkede çıkacaktır.
   3. Bağırsak bölümlerini, dokunun bir kenarını cımbızla hassas bir şekilde tutarak histoloji kasetlerine yerleştirin. Kaseti kapatın ve taze metakarn çözeltisi ile tamamen batırın. Kasetlerin batırılmasından sonra çözeltinin birkaç saatten eski olmadığından emin olun.
   4. Duman kaputuna erişimi olmayan bir klinik süitte toplanacak klinik örnekler için, histoloji kasetlerinin geçişine izin verecek kapağı kesilmiş bir polietilen saklama kabı kullanın. Zehirli dumanların kaçmasını önlemek için numuneleri geçirmediğinizde bu kapağı kapatın.
      NOT: Tutkalın kabın üzerine dağılmasını önlemek için maskeleme bandı kullanmak önemlidir-bazı bant türleri (örneğin, plastik ambalaj bandı) metakarn dumanlarına iyi dayanamayabilir.
   5. Örnekleri en az 3 saat ve en fazla iki hafta boyunca sabitle.
      NOT: Daha kalın numuneler 3 saatten daha uzun sabitleme süreleri gerektirebilir. Farklı metakarn çözeltilerinde sabitlenmiş kasetler için eşzamanlı parafin infiltrasyon işlemesini etkinleştirmek için sabitleme süresi seçilebilir (örneğin, iki hafta boyunca toplanan ve sabitlenmiş numune gruplarına aynı anda parafin infiltrasyonunu gerçekleştirmek).
2. Parafin sızma ve gömme
   1. Parafin ısıya dayanıklı bir kaba yerleştirin ve gece boyunca 60 °C'de bir fırında eritin. Parafin peletleri erimeden önce daha fazla yer kapladıkça, tüm kasetleri kapsayacak kadar parafin eritilmesini sağlayın.
      NOT: Sıcaklık, eserlere yol verebileceğinden 60 °C'den yüksek olmamalıdır.
   2. Sıvıyı uygun atık hazneye dökerek ve hemen aşağıdaki kimyasallarla değiştirerek dokuyu yıkayın.
      1. Mutlak metanolde 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
      2. Mutlak etanolde 20 dakika kuluçkaya yaslanın.
      3. 15 dakika boyunca ksilenlerde kuluçkaya yaslanın.
      4. Kasetlerin kurumasını önlemek için yıkamaları hızlı bir şekilde değiştirin. Her yıkamanın kabın veya kabın kasetlerini tamamen kapladığından emin olun.
         NOT: Ksilenler yanıcıdır ve solunursa, buharlar merkezi sinir sistemini yüksek konsantrasyonlara maruz kaldıktan sonra potansiyel uzun vadeli nörolojik sonuçlarla depresif hale getirebilir (>200 ppm). Ksilenleri sadece duman kaputunun içinde işle. Ksilenler tehlikeli olduğundan, histolojik kasetleri örtmek için gereken minimum miktarı kullanmaya özenin.
   3. Gömme sırasında, nicel görüntüleme için daha potansiyel örnek alan sağlamak için kesitli çörekler yerine uzunlamasına, enine kesitler sağlamak için cımbız kullanarak bağırsak segmentlerini kasetin uzunluğuna paralel (dikin aksine) yönlendirin (Şekil 1B).
   4. Parafin doku segmentlerini kaybetmeden girmesini sağlamak için kasetleri hafifçe (~1-2 cm veya 0,5 inç) açın. Parmakların aşırı ısınmasını veya hafif yanmasını önlemek için bu adım veya cımbız için çift eldiven kullanın. Kasetleri eritilmiş parafin kabına batırın ve kapatın, kabı tekrar 60 ° C fırına yerleştirin. Kasetlerin parafinle dolu olduğundan ve büyük hava kabarcıklarının kalmadığından emin olun.
   5. 60 °C'de 2 saat kuluçkadan sonra kabı fırından çıkarın. Tokmakları kullanarak, kasetleri dikkatlice çıkarın ve soğutmak için bir alüminyum folyo parçasına ayrı ayrı koyun. Gömme ve bölümleme için hazır olana kadar oda sıcaklığında saklayın.
   6. Parafin bloklarını bir mikrotom ile bölümlendirerek, luminal içeriğin açığa çıkardığı bloğa yeterince derine kesilerek, ışık içeriğine ve mukusa ek olarak villi ve/veya mahzenlerin uzunlamasına bir bölümünü sağlar. Dışkı malzemesi bıçağı dokuya kıyasla hızla köreltirken bıçakları değiştirmeye özen edin. Görüntülerin optimum keskinliği için bölümleri 4 μm kalınlığa kesin. Bölümleri normal kaplamasız slaytlara aktarın.
   7. BALIK boyama için, güçlü bir FISH sinyali elde etmek için bağırsak bölümlerini mümkün olan en kısa sürede (yani kesitlerden sonraki birkaç hafta içinde) lekelendirin. BALIK lekesi atlanırsa, önemli sinyal kaybı olmadan daha az taze (yani aylar önce) numunelerde lektin + DAPI boyama yapılabilir.

3. Lekeleme bakterileri ve konak özellikleri

1. Hazırlık
   1. Fırını 60 °C'ye ısıtın. Boş bir Coplin kavanozunu ve kavanozdaki cam slaytları iki kez cam şişedeki ksilenlerle kaplayacak kadar hacim ısıtın, ksilenlerin buharlaşmasını önlemek için kapağın etrafında parafilm yapmaya özen gösterir. Ksilenlerin sıcaklığının 60 ° C'ye ulaşmasını izin verin.
      NOT: Standart bir Coplin kavanozu 8 slayta uyar ve slaytlar kabaca 50 mL sıvı ile kaplanabilir (markaya bağlı olarak 40 ila 60 mL arasında değişebilir). Ksilen ikameleri daha az toksiktir ve diğer gruplar tarafından ağdayı azaltma adımı (adım 3.2) ^8,9 için başarıyla kullanılmıştır.
   2. Ayrı bir fırın varsa, bir hibridizasyon fırınunu 50 °C'ye önceden ısıtın. Aksi takdirde, bu adım 3.2.3 adımından sonra slaytları pişirmek için kullanılan fırınla gerçekleştirilebilir.
   3. FISH hibridizasyon çözümünü hazırlayın: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0.9 M NaCl; 0.01%²⁶ - 0.1%⁹ (w/v) sodyum dodecylsulfate (SDS) çekirdeksiz suda. Gerekirse% 5-50 (v/v) formamid ekleyin. Bu hibridizasyon çözeltisinin de-parafinizasyon sırasında 50 °C'de önceden ısıtın.
      NOT: Formamide, teratojen görevi görür; eldiven ve gözlüklerle formamid kullanın. Küçük dozlarda ve gözlere, cilde veya mukoza zarlarına maruz kalınması üzerine rahatsız edicidir. Büyük miktarlarda, formamid buharı tıbbi müdahale gerektirebilir. Formamid %100 oranında -20 °C dondurucuda saklanabilir.
2. Slaytları boyamaya hazırlama: deparaffinizasyon
   1. Slaytları Coplin kavanozuna yerleştirin, bölümlerin diğer slaytlarla veya kavanozla temas etmemesini sağlayın ve slaytları 60 °C'de 10 dakika pişirin.
   2. Duman kaputunda, Coplin kavanozunu fırından önceden ısıtılmış ksilenlerle doldurun, örneklerin üzerine doğrudan dökmemeye ve dokuları potansiyel olarak yerinden çıkarmamaya dikkat edin. Coplin kavanozu 60 °C fırına geri yerleştirin. Şişeyi kalan ksilenleri duman kaputunda bırakın.
   3. Kullanılmış ksilenleri bertaraf için uygun bir atık kabına dökün, cam slaytlardaki doku bölümlerini rahatsız etmemeye dikkat edin ve slaytların Coplin kavanozundan düşmesini önlemek için bir çift forseps kullanarak. Coplin kavanozunu kalan ksilenlerle doldurun ve duman kaputunda oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yaslayın.
   4. Bölümleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 99,5 etanolde kuluçkaya yatırın. Bu kuluçka adımından sonra, slaytları Coplin kavanozundan çıkarın, slaytların arkasını bir laboratuvar mendili veya kağıt havlu üzerinde silin ve etanol damlacıkları gidene kadar kısa bir süre havayla kurulayın.
      NOT: Slaytların arkasını silmek, kurutma ilerlemesinin daha iyi görselleştirilmesini sağlar.
3. BALIK ile bakteriyel boyama
   1. Her doku bölümünün alanını çevreleyerek sıvı genişleme alanını sınırlamak için bir sıvı engelleyici veya PAP kalemi kullanın. Mireksin bölümün kendisiyle temas etmediğine emin olun. Melezleme çözümü ile kaplanması gereken yüzey alanını en aza indirmek için dokuya temas etmeden her doku bölümüne mümkün olduğunca yakın bir daire oluşturun.
   2. Hibridizasyon çözümünü hazırlayın: önceden ısıtılmış her 50 μL hibridizasyon çözümü için 0,5 μg prob (örneğin, 1 μg/μL probun 0,5 μL'si) ekleyin. Hibridizasyon çözümünü slayttaki bölümlere pipetleyin (bölüme/daire boyutuna bağlı olarak~20 μL/kesit). Kuluçka adımları ve depolama sırasında hibridizasyon çözümünü ve slaytları bu noktadan itibaren ışıktan koruyun.
   3. Kullanılan sıvı hacminin esnek bir plastik kapak kapağı ile kaplama sırasında tüm bölümü kapladığından emin olun. Buharlaşmayı azaltmak için slaydı nemli bir odada kuluçkaya yatırın. Nem sağlamak için fazla hibridizasyon çözeltisi veya fosfat tamponlu salin (PBS) ile ıslatılmış altta mendil veya kağıt havlu içeren pipet ucu kutusu ile nemli bir oda oluşturun. Prob sete bağlı olarak bölümleri 45-50 °C'de >3 saat kuluçkaya yatırın.
   4. FISH yıkama tamponu ısıtın: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4; Kuluçka döneminde 0,9 M NaCl ila 50 °C. Coplin kavanozundaki slaytları kaplayacak kadar yıkama tamponu hazırlayın.
   5. Plastik kapakları çıkarın; Her ikisi de önceden 50 °C'ye kadar ısıtılmış bir Coplin kavanozunda FISH yıkama tamponunda slaytları kuluçkaya yaslayın. Coplin kavanozu 10-20 dakika boyunca 50 °C fırına geri yerleştirin. Kalın numuneler için, tamponu ekleyerek ve dilimin bumasını önlemek için kapakları hafifçe yerinden çıkararak Coplin kavanozundaki kapakları çıkarın.
4. Mukus ve ana bilgisayar özelliklerini boyama
   1. PBS'de genel bir DNA/mukus kontrtain hazırlayın: son 10 μg/mL DAPI + 40 μg/mL mukus lekesi UEA-1. Ek kapak uçları ile dokuya zarar vermemek için bir kapak parçasının yokluğunda lekeleri örtmek için yeterli karşıtlık hazırlayın.
      NOT: Kapak parçasının yokluğunda lekelerin kaplanması, 3,3,2'de kullanılan 20 μL'den daha büyük hacimler gerektirecektir. Ortalama boyutlu bölümler (~10 mm çapında) için, bir noktayı kapsayacak şekilde 200 μL yeterlidir; bu birimi önceden sahte bir slaytta test edin.
   2. FISH yıkama tamponu çıkarın ve Coplin kavanozunda PBS ile değiştirin. Coplin kavanozu PBS ile doldurduktan hemen sonra PBS'yi boşaltın.
   3. Pipet ucu ile dokuya dokunmamak için slaydı kavanozdan çıkarın ve kontrtain bölümün üstündeki pipeti çıkarın. Tüm bölümü bir kabarcıkla kapla. Karanlıkta 45 dakika boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
   4. Lekeleri taze PBS ile 3 kez hızlı bir şekilde yıkayın: slaytları cımbız kullanarak yerinde tutarken, PBS'yi bir lavaboya dökün ve hemen taze PBS ile doldurun.
   5. Slaytların arkasını bir mendile veya kağıt havluya karşı silerek, PBS'nin çoğunun pipet ucuna bağlı bir vakum hattı ile desteklenen bölümlerden buharlaşmasına izin verin. Bir kez daha pipet ucu olan bölüme dokunmaktan kaçının.
   6. Bölümleri bir montaj ortamı (DAPI olmadan) kullanarak monte edin ve cam kapaklarla kaplı oda sıcaklığına ayarlayın, kapak altlıklarının düz olmasını ve montaj ortamında hava kabarcıkları olmamasını sağlayın.
   7. Kapakların kenarlarını şeffaf oje ile boyayarak slayta yapıştırın, slaytın görüntüleme sırasında mikroskop slayt tutucusunda hizada oturmasını sağlamak için slaytın kenarından uzak durmaya özen göstererek.
   8. Floresan tükenmeden önce slaytları 4 °C'de karanlıkta birkaç hafta saklayın.

4. Görüntüleme ve görüntü analizi

1. Lekeleri görselleştirme
   1. Mikrobiyota-konak arayüzünü görüntülemek için dokunun hem doku hem de lümen içeren bir alanını seçin. Mukus kalınlığının nicel görüntülemesi ve luminal biyogeografi için epitel villi ve/veya mahzen dilimlerinin kesitsel değil boyuna olduğu görüş alanlarını seçin. Eserlerin parçalanmaması için mukus ve epitel arasında büyük boşluklar olan alanlardan kaçının.
   2. Fish floresan sinyalinin foto-ağartılmasını önlemek için dapi sinyalini kullanarak dokuyu bulun ve odak düzlemini düzeltin.
   3. Görüntüleme ayarlarını yapın. Bakteriyel DAPI lekesini görselleştirmek için lazer gücünü artırın ve epitel hücrelerinden gelen DAPI sinyalinin aşırı doymamış veya "üflendiği" noktaya kadar kazanın.
      NOT: Aşırı doymamış olmayın, çünkü bu, çekirdekte kurtarılamayan fotobleaching ve görsel eserlere yol açacaktır.
   4. Diğer tüm kanallar için, arka planın üzerinde net bir sinyal sağlayacak minimum lazer gücü kullanın ve aşırı doymamaya dikkat edin.
      NOT: Bu özellikle karo taramaları yaparken önemlidir, çünkü fayanslar arasındaki çakışma görüntülendiğinde fotobleaching sorunlu olacaktır.
   5. Bireysel bakterileri görüntülemek için 40x veya daha yüksek büyütme kullanın.
   6. Görüntüleri alın.
      1. Lümen içindeki mikropların mukus kalınlığı ve mekansal dağılımı hakkında nicel veriler elde etmek için karo taramaları alın. Fayanslar arasında %15 çakışma sağlayın ve <1x yakınlaştırma ile şiddetlenebilecek vinyetdüzensiz aydınlatma olup olmadığını kontrol edin. karo taraması kurarken, bulanıkodak dışı görüntüler analiz edilemediğinden, dokunun tüm karolarda odakta olmadığına çok dikkat edin (Şekil 3B).
      2. Mümkünse, tarama alanını döndürerek belirli bir epitel uzunluğunu görüntülemesi için gereken karo sayısını en aza indirin, böylece epitel ve mukus tabakası bir açıyla değil, karoya paralel olur. Aksi takdirde, benzer bir etki elde etmek için epitelimin görüntüleme alanına paralel veya dik bir bölümünü bulun.

Fare bağırsağındaki spesifik bağırsak kommensal bakterilerinin lokalizasyonunu araştırmak için, bireysel bakteriyel izolatlarla kolonize edilmiş mikropsuz İsviçre Webster fareleri kullanılmıştır. Bu deney için etiketlenen bakteri türleri i) Muribaculaceae familyasının insan İzolesi5, Muribaculum intestinale, murine mikrobiyota15'te bol ve yaygın bir bakteri ailesi ve ii) Genetik olarak çekişli ve yaygın bir bağırsak bakterisi olan Bakterioidler tetaiotaomin. İki haftalık dengeden sonra, fareler ötenaziye tabi edildi ve dışkı pelet içeren kolonun bir bölümü yeni hazırlanmış metakarna bölümlere ayırıldı ve sabitlendi. İki günlük fiksasyondan sonra, bölümler metanol, etanol ve ksilenler yoluyla işlenerek susuz bırakıldı, parafinle sızıldı, gömüldü ve daha sonra luminal 4 μm dilimlere bölümlere çıkarıldı. Bu örnekler daha sonra Muribaculum izolesi için özel bir FISH probu (3' Cy3 etiketli) ile boyandı, Oligominer yazılımı12 kullanılarak tasarlandı ve NuPACK ve mathFISH16,17 kullanılarak ikincil ve üçüncül yapı ve minimal spesifik olmayan bağlama için kontrol edildi. Örnekler ayrıca Rhodamine bağlı lektin UEA-1 (mukustaki fukosillenmiş glikanları lekeleyen) ve DAPI ile karşı konuldu. Lekeli bölümler 40x yağ hedefi ve süper çözünürlüklü modül kullanılarak görüntülenmiştir.

Şekil 1: Bağırsaktaki mikrobiyota-konak arabiriminin görselleştirilmesi iş akışı. (A) İşlem hattı için resimli bir iş akışı. (B) İki kesit düzlemi enine bölümler (bu işlem hattı için tercih edilir) veya kesitsel "halkalar" verir. (C) Çok farklı kalınlıklarda dokuların gömülmesi, sadece bir doku veya başka bir doku için en uygun dilimlere neden olabilir. Kısaltmalar: FISH = floresan in situ hibridizasyon; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kolonun görüntülenmesi, muribaculum intestinale'nin gnotobiyotik fare modelinde mukusa göre lokalizasyonunu gösterir. Bölümler DAPI (mavi), Muribaculaceae FISH probu (kırmızı) ve UEA-1 (yeşil) ile boyandı. (A) Muribaculum intestinale ile mono-kolonize fare distal kolonu ve (B) Muribaculum intestinale ve Bacteroides tetaiotaomicron ile iki kolonize fare distal kolonu. Ölçek çubuğu = 20 μm. (C ve D) Cy3-FISH (solda), DAPI (ortada) ve (A) ve (B) ışıklı inset bölümleri için cy3-FISH + DAPI kanallarını birleştirir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (A) ve (C) içinde, tüm bakteri şeklindeki ve bakteri boyutunda DAPI sinyalleri Cy3 (tek ok uçları) ile etiketlenir ve (B) ve (D) içinde, bu Cy3 ve DAPI çift pozitif hücrelere (tek ok uçları) ek olarak, mono ve çift kolonizasyon durumları için beklendiği gibi Cy3 negatif (çift ok uçları) olan DAPI lekeli bakteri hücreleri vardır. Daha uzun filamentli bakteriler hariç, daha büyük (>4 μm uzunluğunda) DAPI pozitif yapılar (kör oklar) bitki malzemesi veya konak hücrelerden çekirdeklerdir. Kısaltmalar: FISH = floresan in situ hibridizasyon; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Yaygın problemler. (A) Sığ kesitler bağırsağın ışık dilimlerini sağlamaz. (Sol) Epitelimin boyuna manzarasının yanı sıra lümenin bir görünümünü sağlayan bir derinlikte bölümlenmiş bir bağırsak segmenti. (Sağ) Çok sığ bir şekilde bölümlenmiş bir bağırsak segmenti, sadece mahzenlerin kesitlerini ve sürekli mukus tabakası veya bakterisini ortaya çıkarır. (B) Düzensiz doku/kapak kılıfı kapsama alanı bulanık ve düzensiz aydınlatılmış karo taramalarına neden olabilir. Odak dışında (sağ üst köşe) konumlarla bir kutucuk taraması kuruldu. (C) Normal arka plan (sol) ve yüksek arka plan (sağ) örneği. Bu örnekte, DAPI sinyali için çekirdeğin dışındaki epitelden gelen sinyali not edin. Tüm ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltma: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların çıkar çatışması yoktur.