Method Article

Geliştirici Tabanlı İfade Yapılarının AAV Dağıtımı In Vivo in Mouse Brain

DOI:

10.3791/62650

⸱

March 31st, 2022

 ,  , 
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yeni bir rAAV tabanlı geçici arttırıcı-muhabir analizini açıklamaktadır. Bu tahlil, fare beyninde in vivo olarak arttırıcı güdümlü ifadeyi indüklemek için kullanılabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arttırıcılar, doku ve hücre tipine özgü genlerin spesifik ekspresyon modellerini yönlendiren çeşitli transkripsiyon faktörleri dizisi için bağlayıcı platformlardır. Kodlamayan DNA'yı ve çeşitli kromatin durumlarını değerlendirmenin birçok yolunun, genomdaki arttırıcı dizilerin varlığını tahmin etmede yararlı olduğu kanıtlanmıştır, ancak bu dizilerin aktivitesini doğrulamak ve aktif oldukları organları ve gelişim aşamalarını bulmak emek yoğun bir süreçtir. Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörlerindeki son gelişmeler, transgenlerin fare dokularına yaygın olarak verilmesini sağlamış ve transgenik bir hayvana ihtiyaç duymadan in vivo arttırıcı testi mümkün kılmıştır. Bu protokol, EGFP'yi minimal bir promotörün kontrolü altında ifade eden, kendi başına önemli bir ifadeyi yönlendirmeyen bir muhabir yapısının, fare beynindeki aday geliştirici dizilerinin aktivite kalıplarını incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. AAV paketlenmiş bir muhabir yapısı fare beynine teslim edilir ve 1-4 hafta boyunca inkübe edilir, daha sonra hayvan kurban edilir ve beyin bölümleri mikroskop altında gözlemlenir. EGFP, test edilen arttırıcının gen ekspresyonunu başlatmak için yeterli olduğu hücrelerde ortaya çıkar ve arttırıcının beyinde aktif olduğu yeri ve gelişim aşamasını belirler. Standart klonlama yöntemleri, düşük maliyetli AAV paketlemesi ve genişleyen AAV serotipleri ve in vivo dağıtım yöntemleri ve standart görüntüleme okuması, bunu gen ekspresyonunun beyinde nasıl düzenlendiğinin incelenmesi için erişilebilir bir yaklaşım haline getirmektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arttırıcılar, transkripsiyon faktörü bağlanma bölgeleri olarak hizmet eden genomik cis-düzenleyici elemanlardır ve bir hedef genin ekspresyonunu mekansal olarak zamansal olarak spesifik bir şekilde yönlendirebilir 1,2. Farklı hücre tiplerinde, dokularda ve gelişim aşamalarında farklı şekilde aktiftirler ve hastalık riskine bağlı genomik varyasyonun substratları olabilirler 3,4. Bu nedenle, arttırıcı fonksiyonun dinamiklerini anlama ihtiyacı, genomik içindeki hem translasyonel hem de temel bilim uygulamalarında ilerleme için kritik öneme sahiptir. A....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, UC Davis Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Protokol #22339) ve UC Davis Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (BUA-R1903) tarafından onaylanmıştır. Bu protokol, doğum sonrası 0-1. günde her iki cinsiyetten C57BL / 6J fareleri üzerinde test edilmiştir.

1. Arttırıcı aday dizisini AAV vektör plazmidine klonlayın.

NOT: Temsili protokoller verilmiştir, ancak klonlama stratejisi yüksek derecede esnekliğe sahiptir.

  1. Bir reporter yapısı seçin veya tasarlayın. Burada, geliştirici adayı, Hsp68 minimal promotörünün kontrolü altında ifade edilen EGFP muhabir geninin 3' çevrilmemiş ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemler kullanılarak, CACNA1C 19,49,50 geninin psikiyatrik riskle ilişkili üçüncü intronunda 915 bp dizisi, doğum sonrası fare beyninde arttırıcı aktivite açısından test edildi. Bu sekans, psikiyatrik ve nörolojik risk SNP'leri12'ye odaklanan 345 aday arttırıcı sekanstan oluşan bir MPRA'da keşfedilmiştir ve karakterizasyon deneyleri burada genel bir örnek olarak açıklanmıştır. C57BL/6 farele.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, doğum sonrası fare beyninde arttırıcı güdümlü transgenlerin konuşlandırılması için rAAV tabanlı bir yöntemi açıklar. Bu genelleştirilmiş protokolde, bir aday arttırıcı, bir minimal destekleyici, bir muhabir geni ve isteğe bağlı bir barkod dizisi bir AAV plazmid omurgasına klonlanır. Bu deneyler tek bir aday arttırıcı dizisi ile veya paralel olarak birçok dizi ile yapılabilir. Plazmid bir rAAV içine paketlenir ve doğum sonrası fare beynine verilir. Virüs transdüksiyonuna izin vermek için bir süre sonra, beyin.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UC Davis DNA Technologies Core'da dizileme yapıldı. UC Davis'teki Lin Tian laboratuvarına, rAAV ambalajı konusunda eğitim aldıkları ve bize AAV yardımcısı ve rep / cap plazmidlerini cömertçe hediye ettikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH/NIGMS R35GM119831 tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x Sitrat TamponuSigma-AldrichC9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3'EntegreDNA TeknolojileriN/A:Dönüşümden sonra klonları doğrulamak için özel olarak tasarlanmış İleri astar. Bu primerler kullanılan vektöre özgüdür ve deneylerimizde kullanılan belirli vektör için tasarlanmıştır.
5'-gatggctggcaactagaagg-3'EntegreDNA TeknolojileriN/A:Dönüşümden sonra klonları doğrulamak için özel olarak tasarlanmış Ters astar. Bu primerler kullanılan vektöre özgüdür ve deneylerimizde kullanılan belirli vektör için tasarlanmıştır.
AgaroseVWRVWRVN605-500G
Aspiratör tüpü tertibatlarıkaplarının ağızdan iletimi içinSigma-AldrichA5177-5EA
Thermo Fisher Scientific08-757-100D
KarbenikilinSigma-AldrichC1389-5G
Tavuk IgY anti-GFPThermo Fisher ScientificA10262
Konfokal mikroskopZeissLSM900Görüntüler LSM800 modelinde çekildi, ancak Zeiss son yıllarda LSM800'ün yerini almak üzere LSM900 modelini piyasaya sürdü.
Konik santrifüj tüpleri 15 mLThermo Fisher Scientific12-565-269
CryomoldsThermo Fisher ScientificNC9806558Bu kalıplar P28 fare beyni için uygundur. Diğer boyutlar daha büyük veya daha küçük dokular için daha uygun olabilir.
DAPISigma-AldrichD9542-10MG
Diseksiyon makası, 4.5"VWR82027-578
Eşek anti-tavuk AlexaFlour-488Jackson ImmunoResearch703-545-155
Dulbecco'nun PBS 1xThermo Fisher ScientificMT21031CV
Eppendorf Mikrosantrifüj tüpleri 2.0 mLThermo Fisher Scientific
Falcon yuvarlak tabanlı tüpler 14 mLThermo Fisher Scientific352059
Hızlı Yeşil boyaGraingerF0099-1G
İnce detay boya fırçası setiArtbrush TowerB014GWCLFO
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
Cam kılcal borularDrummond Scientific Company5-000-2005
HiSpeed Plazmid Maxi KitiQIAGEN12663Ticari plazmid maxi hazırlık kiti
HyClone HyPure Moleküler Biyoloji Sınıfı SuVWRSH30538.03
IV kelebek infüzyon seti, 12" boru ve 25G iğne ileThermo Fisher Scientific26708
KimwipesKimberly Clark34155Tüy bırakmayan mendil
LB AgarThermo Fisher ScientificBP1425-500LB agar seçici ortam için ön karışım
McPherson Vannas iris makasIntegra LifeSciences360-215
Mineral yağSigma Life Science69794-500ML
NEB Kararlı Yetkin E. coliNEBC3040I
NucleoSpin Jel ve PCR TemizlemeTakara740609.5Enzimatik reaksiyon kiti temizleme ve jel ekstraksiyonu
OCT ortamıVWR25608-930
Orbital çalkalayıcıCole Parmer60-100
ParaformaldehitSigma-Aldrich158127-500G
PCR şerit tüpleri 0.2 mLVWR490003-692
Peristaltik pompaGilsonF155005
Fosfat tamponlu salin (PBS) 10xThermo Fisher Scientific70011044
Phusion Hot Start II Yüksek Sadakatli DNA PolimerazThermo FisherScientific F549L
SütTozu Sunny Select
ProLong Altın Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36934
QIAquick PCR Arıtma KitiQIAGEN28106
rCutSmart TamponNEBB6004SPacI, AscI ve XmaI ile kısıtlama sindirimi için tampon
Restriksiyon enzimi: AscINEBR0558L
Restriksiyon enzimi: PacINEBR0547L
Restriksiyon enzimi: XmaINEBR0180L
SOC büyüme ortamıNEBB0920SDönüşümden sonra geri kazanım ortamı
Sükroz ( RNase / DNaz içermez)Millipore Sigma033522.5KG
TAE tamponuApex20-194
Transfer borusuGilsonF1179941Peristaltik pompa için
Triton X100Sigma-AldrichX100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Saflaştırma SistemiThermo Fisher ScientificA1460Plazmid mini hazırlık kiti
rAAV Bakteriyolojik petri 22431048

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AAV DeliveryEnhancer TestingMouse BrainReporter ConstructEGFP ExpressionIn Vivo ExpressionGibson CloningBrain InjectionFluorescence ImagingSingle Cell RNA Sequencing

Related Articles