Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Özet

Zaman çözümlenmiş tek moleküllü protein kaynaklı floresan geliştirme, proteinlerdeki yerel yapısal değişikliklere duyarlı yararlı bir floresan spektroskopik yakınlık sensörüdür. Burada, daha uzun menzilli FRET cetveli kullanılarak ölçüldüğünde küresel olarak yapılandırılmamış ve kararsız olarak bilinen α-Synuclein'deki kararlı yerel konformasyonları ortaya çıkarmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Özet

Tek biyomoleküllerin ve dinamiklerinin birden fazla konformasyonunu izlemek için spektroskopik cetvellerin kullanılması, yapısal dinamiklerin anlaşılmasında ve biyolojiye katkılarında devrim yaratmasına neden oldu. FRET tabanlı cetvel 3-10 nm aralığındaki boyalar arası mesafeleri raporlarken, protein kaynaklı floresan geliştirme (PIFE) gibi diğer spektroskopik teknikler, daha kısa 0-3 nm aralığında bir boya ile protein yüzeyi arasındaki yakınlığı rapor eder. Tercih yöntemi ne olursa olsun, serbestçe dağılan biyomolekülleri teker teker ölçmedeki kullanımı, deneysel parametrenin histogramlarını alarak, her alt popülasyonun milisaniyeler içinde değişmeden kalan tek bir uyumu veya milisaniyeden çok daha hızlı bir şekilde kesişen birden fazla uyumu ve dolayısıyla ortalama bir alt popülasyonu temsil ettiği ayrı merkezi olarak dağıtılmış biyomolekül alt popülasyonlarını verir. Histogramlarda bildirilen parametrenin inter-boya FRET verimliliği olduğu tek moleküllü FRET'te, tampondaki α-Synuclein monomer gibi özünde düzensiz bir proteinin, daha önce hızla birbirine keneşen birden fazla konfektörden oluşan tek bir ortalama alt popülasyon sergilediği bildirilmiştir. Bu geçmiş bulgular FRET tabanlı cetvelin 3-10 nm aralığına bağlı olsa da, bu proteini, mekâna özgü sCy3 etiketli α-Synuclein proteinlerinin floresan ömrünü tek tek izlediğimiz tek moleküllü PIFE kullanarak test etmeye çalıştık. İlginçtir ki, bu daha kısa menzilli spektroskopik yakınlık sensörunu kullanarak, sCy3 etiketli α-Synuclein, 10-100 ms'de kesişen belirgin şekilde farklı ortalama ömürlere sahip birkaç ömür boyu alt popülasyon sergiler. Bu sonuçlar, α-Synuclein'in küresel olarak düzensiz olabileceğini, ancak yine de istikrarlı yerel yapılara sahip olduğunu göstermektedir. Özetle, bu çalışmada, yerel veya küresel yapısal değişiklikleri aynı anda bir biyomolekülden izleyen farklı spektroskopik yakınlık sensörleri kullanmanın avantajını vurguluyoruz.

Giriş

Son yirmi yılda, tek moleküllü floresan bazlı yöntemler biyomolekülleri ölçmek için güçlü bir araç^halinegelmiştir 1^,2, farklı biyomoleküler parametrelerin nasıl dağılacağını ve bu parametrelerin farklı alt popülasyonları arasında milisaniyenin altında çözünürlük 3 , 4^,5arasında dinamik olarak nasıl bir araya geldiklerini yoklar. Bu tekniklerdeki parametreler, FRET ölçümlerinde enerji transfer verimliliğini ^{içerir 6},⁷, floresan anizotropi^8,

Protokol

1. Plazmid dönüşümü

1. 0,5 L SOC ortamının hazırlanması
   1. 10 g tripton, 2,5 g Maya özü, 0,25 g sodyum klorür (NaCl), 0,1 g potasyum klorür (KCl) ağırlığındadır.
   2. Toplam 0,5 L hacme kadar çift damıtılmış su (DDW) ekleyin.
   3. Sodyum hidroksit (NaOH) ekleyerek pH 7'ye ayarlayın.
   4. 100 mL ve otoklav stok aliquots hazırlayın.
   5. Kullanmadan önce, 100 mL SOC'ye 0,5 mL steril magnezyum klorür (MgCl₂₎ve 1,8 mL steril glikoz ekleyin.
2. Buz üzerinde BL21 (DE3) yetkin Escherichia coli hücrelerini çözün.
3. Yetkin hücreleri hafifçe karıştırın.
4. İki adet 15 mL tüp hazırlayın. B....

Sonuçlar

Bir IDP olarak, başka bir biyomoleküle bağlı olmadığında, α-Syn, birkaç mikrosaniye⁴⁰ ve hatta yüzlerce nanosaniye^41'degeçişlerle birden fazla konformasyon arasında yapısal dinamikler sergiler. α-Syn konfokal noktayı geçtiğinde, konformasyonlar arasında binlerce geçişe maruz kalabilir. Gerçekten de, smFRET kullanıldığında durum böyleydi^39,40. Burada α-Syn'nin yerel konformasyon dinamiklerini araştırmak için smPIFE ö.......

Tartışma

α-Syn'nin yapısal özelliklerini ve düzensiz doğasını incelemek için kapsamlı biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar yapıldı^{33,34,35,36,37,38}. Α-Syn monomerinin bağdan arındırılmış moleküler içi dinamiklerini araştırmak için birçok çalışma serbestçe dağıtıcı smFRET'i kullanmıştır. Bu çalışmalar, α-Syn'nin yüksek dinamik heter.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Üniteleri	Merc	C7715	kesme: 100 kDa
amonyum sülfat	Sigma-Aldrich	A4418
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
sisteamin	Sigma-Aldrich	30070
diyaliz torbaları - MEGA GeBaFlex tüp	Gen Biyo-Uygulama	MEGA320
ditiyotreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Hızlı SeeBand boyama çözeltisi	Gen Biyo-Uygulaması	SB050
Glisin	Sigma-Aldrich	50046
D-Glikoz	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES	Sigma-Aldrich	54457
HiTrap Tuzdan Arındırma 5 mL	Sigma-Aldrich	GE17-1408
6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilik asit (TROLOX)	Sigma-Aldrich	238813
izopropil ve beta;-d-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
LB suyu	Sigma-Aldrich	L3152
Magnezyum klorür	Sigma-Aldrich	63068
MonoQ sütunu	Sigma-Aldrich	54807
protein LoBind tüpü	Sigma-Aldrich	EP0030108094	0.5 mL
Durulama ve mikro;-slayt 18	Ibidi	81816
SDS	Sigma-Aldrich	75746
Sodyum asetat	Sigma-Aldrich	S2889
Sodyum hidroksit	Sigma-Aldrich	S8045
Sodyum fosfat monobazik monohidrat	Sigma-Aldrich	71507
Steril Hücre yayıcılar, Drigalski spatula	mini-plast	815-004-05-001
streptomisin sülfat	Sigma-Aldrich	S9137
sülfo-Cy3  maleimid	abcam	ab146493
Tris (2-karboksietil) fosfin hidroklorür (TCEP)	Sigma-Aldrich	75259
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	93363
Tripton	Sigma-Aldrich	T7293
Maya Özü	Sigma-Aldrich	Y1625