Makropinositoz, membran fırfırları olarak da bilinen F-aktin bakımından zengin tabaka benzeri membran projeksiyonlarının oluşumu ile başlatılan oldukça korunmuş bir endositik işlemdir. Makropinositotik solut içselleştirme oranının artması çeşitli patolojik durumlarda rol oynamıştır. Bu protokol, taramalı elektron mikroskobu kullanarak membran fırfırı oluşumunu in vitro olarak ölçmek için bir yöntem sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Taramalı Elektron Mikroskobu ile Membran Fırfırı Oluşumunu Görselleştirme
Bu makalede
Özet
Özet
Membran karıştırma, yeni polimerize aktin filamentlerinin bir ağını içeren hareketli plazma membran çıkıntılarının oluşumudur. Membran fırfırları kendiliğinden veya büyüme faktörlerine, inflamatuar sitokinlere ve forbol esterlerine yanıt olarak oluşabilir. Membran çıkıntılarının bazıları, distal kenarlarında kaynaşan dairesel membran fırfırları halinde yeniden organize olabilir ve makropinozomlar adı verilen büyük, heterojen vakuoller olarak sitoplazmaya kapanan ve ayrılan kaplar oluşturabilir. İşlem sırasında, fırfırlar hücre dışı sıvıyı ve makropinozomlar içinde içselleşen çözünürleri yakalar. Yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobu (SEM), hücre yüzeyindeki membran fırfırı oluşumunu, dairesel çıkıntıları ve kapalı makropinositik kapları görselleştirmek ve ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Aşağıdaki protokol, hücre kültürü koşullarını, membran fırfırı oluşumunun in vitro olarak uyarılmasını ve SEM kullanarak görüntüleme için hücrelerin nasıl düzeltileceğini, dehidre edileceğini ve hazırlanacağını açıklamaktadır. membran karıştırmanın miktarı, veri normalizasyonu ve membran fırfırı oluşumunun uyarıcıları ve inhibitörleri de açıklanmaktadır. Bu yöntem, makropinositozun fizyolojik ve patolojik süreçlerdeki rolü hakkındaki temel soruları cevaplamaya, membran fırfırı oluşumunu düzenleyen yeni hedefleri araştırmaya ve henüz tanımlanmamış fizyolojik stimülatörlerin yanı sıra makropinositozun yeni farmakolojik inhibitörlerini tanımlamaya yardımcı olabilir.
Giriş
Makrokinositoz, membran fırfırları1 adı verilen dinamik ve aktin güdümlü plazma membran çıkıntılarının oluşumu yoluyla büyük miktarda hücre dışı sıvının ve içeriğinin içselleştirilmesinden sorumlu endositik bir işlemdir. Bu zar fırfırlarının çoğu, hücreye kapanan ve tekrar kaynaşan ve plazma zarından makropinozomlar 1 olarak da bilinen büyük, heterojen hücre içi endozomlarolarak ayrılan bardaklar oluşturur. Makropinositoz, çok çeşitli hücre tiplerinde makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi büyüme faktörleri tarafından indüklenmesine rağmen, doğuştan gelen immün hücrelerde
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Aşağıdakiler, SEM mikroskobu kullanılarak RAW 264.7 makrofajlarında membran fırfırı oluşumunu ölçmek için kullanılan genel bir protokoldür. Farklı hücre tipleri için optimizasyon gerekebilir.
1. Hücre hattı ve hücre kültürü
- Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) %10 (hacim/hacim) ısıyla inaktive edilmiş Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 IU/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş RAW 264.7 makrofajlarını nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de ve %5 CO2'de büyütün. Büyüme medyasını her geçen gün değiştirin.
- Hücreler% 80 birleştiğinde, steril PBS kullanarak plakayı iki kez yıkayın. ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada, sunulan teknikten elde edilen sonuçları açıklıyoruz. Şekil 1'de gösterilen temsili SEM görüntüleri, PMA ve M-CSF ile tedaviyi takiben RAW 264.7 makrofajlarında membran fırfırı oluşumunu göstermektedir. Görüntüler ilk önce nicelleştirme amacıyla 3.500x'lik bir büyütmede ve daha sonra plazma zarını daha ayrıntılı olarak göstermek için daha yüksek büyütme seviyelerinde (8.500x ila 16.000x) yakalandı. Makrofajların makropinositoz inhibitörü EIPA ile ön tedavisi membran fırfırı oluşumunu .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mevcut SEM görüntüleme protokolü, in vitro hücre yüzeyindeki membran fırfırı oluşumunu, dairesel çıkıntıları ve makropinositik kapları görselleştirmek ve ölçmek için bir araç sağlar. Mevcut protokol makrofajlara odaklanmasına rağmen, çalışmalar membran fırfırı oluşumunun dendritik hücreler, fibroblastlar, nöronlar ve kanser hücreleri 11,12,14,21,30 dahil olmak üzere diğer çe.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar, SEM örnek hazırlığındaki yardımları için Libby Perry'ye (Augusta Üniversitesi) teşekkür eder. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri [R01HL139562 (G.C.) ve K99HL146954 (BS)] ve Amerikan Kalp Derneği [17POST33661254 (BS)] tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.5 Tripsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| %2 Glutaraldehit | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 16320 | |
| %4 Paraformaldehit | Santa Cruz Biyoteknoloji | 281692 | |
| 5- (N-etil-N-izopropil) -Amilorid | Sigma Yaşam Bilimleri | A3085 | |
| Accuri C6 Akış Sitometresi | |||
| Karbon Yapıştırıcı Sekmeleri | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 77825-09 | |
| Dimetil Sülfoksit | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı | Cytiva Yaşam Bilimleri | SH30022.01 | |
| Falcon 24 kuyulu Şeffaf Düz Tabanlı TC ile muamele edilmiş Çok Kuyulu Hücre Kültürü Plakası | Falcon | 353047 | |
| Fetal Sığır Serumu | İkizler Biyo | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 inkübatörü | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Püskürtme Kaplayıcı | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR taramalı elektron mikroskobu | |||
| Mikroskop Kapağı Cam | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Kalem Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-miristat 13-asetat | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 makrofaj | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Rekombinant İnsan M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Kritik Nokta Kurutucu | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Alüminyum Numune Bağlantıları | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 75220 | |
| Sodyum Kakodilat Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Tripan Mavi Çözelti | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 konfokal mikroskop |
Kaynaklar
- Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
- Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
