Taramalı Elektron Mikroskobu ile Membran Fırfırı Oluşumunu Görselleştirme

Makrokinositoz, membran fırfırları¹ adı verilen dinamik ve aktin güdümlü plazma membran çıkıntılarının oluşumu yoluyla büyük miktarda hücre dışı sıvının ve içeriğinin içselleştirilmesinden sorumlu endositik bir işlemdir. Bu zar fırfırlarının çoğu, hücreye kapanan ve tekrar kaynaşan ve plazma zarından makropinozomlar 1 olarak da bilinen büyük, heterojen hücre içi endozomlar^olarak ayrılan bardaklar oluşturur. Makropinositoz, çok çeşitli hücre tiplerinde makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi büyüme faktörleri tarafından indüklenmesine rağmen, doğuştan gelen immün hücrelerde 2,3,4,5,6,7,8 olarak bilinen ek bir benzersiz^, kalsiyum bağımlı süreç de gözlenmiştir.

Hücrelerin makropinositoz yoluyla hücre dışı materyali içselleştirme yeteneğinin, besin alımından patojen yakalamaya ve antijen sunumuna kadar çeşitli fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir 9,10,11. Bununla birlikte, bu süreç seçici olmadığı ve indüklenebilir olduğu için, bir dizi patolojik duruma da dahil olmuştur. Nitekim, önceki çalışmalar makropinositozun Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, kanser, nefrolitiyazis ve aterosklerozda önemli bir rol oynadığını ileri sürmüştür 12,13,14,15,16. Ayrıca, bazı bakteri ve virüslerin konakçı hücrelere girmek ve enfeksiyonu indüklemek için makropinositozu kullandıkları gösterilmiştir^17,18. İlginçtir ki, makropinositozun uyarılması, çeşitli hastalık koşullarında terapötik ajanların hedefe yönelik olarak verilmesi için de^{kullanılabilir19,20}.

Önceki çalışmalar, makropinositozu inhibe eden farmakolojik ajanların yokluğunda ve varlığında ekstraktüre floresan etiketli sıvı faz belirteçlerini primer primer ve konfokal görüntüleme kullanarak nicelleştirerek makropinositozu araştırmıştır^21,22. Makropinositozu inhibe eden mevcut farmakolojik araçlar, 1) aktin polimerizasyon inhibitörleri (sitokalasin D ve latrunkülinler), 2) PI3K blokerleri (LY-290042 ve wortmannin) ve 3) sodyum hidrojen eşanjörlerinin (NHE) (amilorid ve EIPA) inhibitörleri ^ile sınırlıdır ve bunlardan oluşur ^{5,14,15,23,24,25} . Ancak bu inhibitörlerin endositozdan bağımsız etkileri olduğu için makropinositozun özellikle in vivo²¹ olmak üzere solute alım ve hastalık patogenezine katkısını seçici olarak belirlemek zordur.

Taramalı elektron mikroskobu (SEM), odaklanmış bir elektron demeti kullanarak hücrelerin ultra yüksek çözünürlüklü görüntülerini üreten bir elektron mikroskobu türüdür²⁶. Makropinositoz araştırmalarında, SEM görüntüleme, plazma zarının topografik ve morfolojik özelliklerini görselleştirmek, membran fırfırı oluşumunu ölçmek ve makropinozom içselleştirmeye doğru ilerlemelerini araştırmak için altın standart teknik olarak kabul edilmektedir. Ayrıca, taramalı elektron mikroskobu, makropinositoz blokerlerinin varlığında ve yokluğunda, çözünen alımının nicelleştirilmesi ile birlikte, makropinositotik çözünen içselleştirmeyi in vitro olarak incelemek için güvenilir bir strateji sağlar. Bu yazıda, hücrelerin SEM için nasıl hazırlanacağı, hücre yüzeyinin görselleştirileceği, fırfırlı oluşumunun nasıl ölçüleceği ve fincan kapanışı ve makropinozom içselleştirme yönündeki ilerlemelerinin nasıl inceleneceği konusunda ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

NOT: Aşağıdakiler, SEM mikroskobu kullanılarak RAW 264.7 makrofajlarında membran fırfırı oluşumunu ölçmek için kullanılan genel bir protokoldür. Farklı hücre tipleri için optimizasyon gerekebilir.

1. Hücre hattı ve hücre kültürü

1. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) %10 (hacim/hacim) ısıyla inaktive edilmiş Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 IU/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş RAW 264.7 makrofajlarını nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de ve %5 CO_2'de büyütün. Büyüme medyasını her geçen gün değiştirin.
2. Hücreler% 80 birleştiğinde, steril PBS kullanarak plakayı iki kez yıkayın.
3. 1.000 μL% 0.5 tripsin-EDTA ekleyerek hücreleri ayırın ve hücre kültürü plakasını 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 3-5 dakika boyunca inkübe edin.
4. Hücre ayrışmasını doğrulamak için plakayı bir ışık mikroskobu altında inceleyin. Tripsini etkisiz hale getirmek için %10 FBS içeren 10 mL büyüme ortamı ekleyin.
5. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir konik tüp içinde toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın. Tüm hücre kültürü ortamındaki hücreleri nazikçe askıya alın ve Trypan Blue (% 0.4) boyamasını kullanarak hücre sayısını ve canlılığını belirleyin.
   NOT: Bu deney için önerilen minimum hücre canlılığı %>90'dır.
6. Steril cam kapakları, otoklavlanmış forseps kullanarak 24 delikli bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin. Tohum hücreleri, 1 x 10⁶ hücre / mL yoğunlukta kapaklar üzerine kayar ve plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca inkübe eder.
7. İşlemden önce her bir kuyucuğun ortamını taze 500 μL tam medya ile değiştirin. Makrofajlara araç (DMSO veya EIPA'yı çözmek için kullanılan diğer çözücüler) veya makropinositoz inhibitörü 5-(N-etil-N-izopropil)-Amilorid (EIPA, 25 μM²¹) ile 30 dakika boyunca ön işlem yapın.
8. Membran karışıklığını teşvik etmek için hücreleri makropinositoz aracı ve uyarıcıları ile tedavi edin: forbol 12-miristat 13-asetat (PMA, 1 μM, 30 dakika²¹) ve makrofaj kolonisi uyarıcı faktör (M-CSF, 100 ng / mL, 30 dakika³).
   NOT: Makropinositozun alternatif inhibitörleri [örneğin, latrunkülin A (1 μM, 30 dakika) veya sitokalasin D (1 μM, 30 dakika)] ve uyarıcılar [örneğin, epidermal büyüme faktörü (EGF, 100 ng / mL, 10 dakika) veya trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF, 100 ng / mL, 15 dakika)] makropinositozu karakterize etmek için de kullanılabilir^{16,27, 28,29}. Hücreler, makropinositozun fizyolojik uyarıcıları ile tedaviden önce gece boyunca serum açlığı gerektirebilir. Diğer hücre tiplerinde makropinositozu uyarmak için en etkili konsantrasyonların ve kuluçka sürelerinin belirlenmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir.

2. SEM sabitleme

1. Tedaviden sonra, ortamı kuyulardan aspire edin ve kapakları buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.
2. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hücreleri (0.1 M sodyum kakodilat içinde% 4 paraformaldehit ve% 2 glutaraldehit) sabitleyin, ardından 4 ° C'de fiksatif içinde gece boyunca inkübasyon.
3. Hücre tek tabakasını bozmadan kapak kapaklarını 500 μL aşağıdaki reaktiflerle nazikçe yıkayın ve inkübe edin.
   1. 0.1 M sodyum kakodilatta bir kez yıkayın ve 15 dakika boyunca inkübe edin.
   2. Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla dH₂O ile iki kez yıkayın.
   3. Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla% 25 etanol ile iki kez yıkayın.
   4. Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla% 50 etanol ile iki kez yıkayın.
   5. Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla% 75 etanol ile iki kez yıkayın.
   6. Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla% 80 etanol ile iki kez yıkayın.
   7. Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla% 95 etanol ile iki kez yıkayın.
   8. % 100 etanol ile iki kez yıkayın. Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyon yapın.
      NOT: Reaktiflerin değiştirilmesi/değiştirilmesi, hücrelerin hava ile kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Kapaklar 4 °C'de birkaç gün boyunca% 100 etanol içinde bırakılabilir. Uzun süreli depolama için, ilave %100 etanol ekleyin ve numunenin havayla kurumasını önlemek için kuyuları parafilm ile örtün.

3. Kritik nokta kurutma

1. Kapak fişlerini Kritik Nokta Kurutucuya yerleştirin ve% 100 etanol ile örtün. Güç düğmesine basın ve CO₂ tankını açın.
2. Sıcaklık 0 °C'ye düşene kadar Serin düğmesine yaklaşık 30 s basın. Bölme penceresinde bir kabarcık görünene kadar Doldur düğmesine basın.
3. Temizleme egzozundan gelen etanol kokusu kaybolana kadar Temizle düğmesine basın. Sıcaklık 0 °C'ye düşene kadar Serin düğmesine tekrar basın.
4. Doldurmak ve Temizle düğmelerini kapatmak ve CO₂ deposunu kapatmak için düğmesine basın. Kapatmak için Soğut düğmesine basın ve Isı düğmesine basın.
5. Sıcaklığı 42 °C'ye ve basıncı 1.200 psi'ye ayarlayın. Basınç ve sıcaklık dengelendikten sonra, basıncın yavaşça düşmesine izin vermek için Boşaltma düğmesine basın.
6. Oda basıncı 150 psi'ye ulaştığında, Havalandırma düğmesine basın ve basınç 0 psi'ye düşene kadar bekleyin. Kritik nokta kurutucuyu kapatın ve kapak kapaklarını çıkarın.
7. Karbon Yapışkan tırnaklar kullanılarak SEM alüminyum numune montajları üzerine montaj kapakları kayar ve bir püskürtme kaplayıcısında altın/paladyum kullanılarak püskürtme kaplamasına tabi tutulur.
8. Güç düğmesini açın ve vakum 30 mTorr'a ulaşana kadar bekleyin. Gaz anahtarını kapatıp Fine gaz valfini saat yönünün tersine çevirerek nemi ve havayı gidermek için odayı yıkayın.
9. Vakum 200 mTorr'a yükseldiğinde gaz anahtarını kapatın ve vakum 30 mTorr'a ulaşana kadar bekleyin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
10. Zamanlayıcı düğmesine basın ve gösterge 10 mA okuyana kadar Voltaj düğmesini ayarlayın. Kaplamalı kapak kapaklarını odadan çıkarın.
    NOT: Numunenin kritik nokta kurutma ve püskürtme kaplamasını gerçekleştirmek için üreticinin talimatlarına uyun.

4. Görüntüleme ve niceleme

1. Numune kapaklarını taramalı elektron mikroskobunun odasına yerleştirin. Kapıyı kapatın ve Evac düğmesine basın.
2. SEM işletim yazılımını açın. Hızlanan voltajı 15 kv'ye ve çalışma mesafesini 10 mm'ye ayarlayın.
3. Koordinatlar düğmesine basın ve hücreler gözlem ekranının ortasında görünene kadar kontrol cihazının etrafında hareket edin. Büyütmeyi 3.500x olarak ayarlayın ve Fotoğraf düğmesini tıklatarak örneği görüntüleyin.
   NOT: Plazma zarını daha ayrıntılı olarak göstermek için daha yüksek bir büyütme düzeyi (8.500x ila 16.000x) kullanın.
4. Kapak fişlerinde en az 10 rastgele konumdan görüntü çekerek her mikroskobik alanın birden fazla hücre içerdiğinden emin olun. Görüntüleri .tif dosyaları olarak kaydedin.
5. Görüntülerden, plazma zarının çıkıntılı battaniye benzeri kıvrımları olarak tanımlanan, 500 nm'den büyük bir boyuta sahip membran fırfırlarını bulun (Şekil 1). Hücre başına fırfırlı sayısını sayın.
   NOT: C-şekilli fırfırlar, lateral uçlarında kaynaşmayan kavisli membran çıkıntıları olarak tanımlanmıştır [(Şekil 1 (M-BOS tedavisi) ve Şekil 2B]. Kaynaşmış dairesel membran fırfırları, kapanmadan önce, makropinositotik kaplar olarak tanımlandı (Şekil 2C).
6. Membran fırfırlarının sayısını, değerlendirilen mikroskobik alandaki toplam hücre sayısına normalleştirin. Her gruptan örnekler için bu analizi tekrarlayın.

Burada, sunulan teknikten elde edilen sonuçları açıklıyoruz. Şekil 1'de gösterilen temsili SEM görüntüleri, PMA ve M-CSF ile tedaviyi takiben RAW 264.7 makrofajlarında membran fırfırı oluşumunu göstermektedir. Görüntüler ilk önce nicelleştirme amacıyla 3.500x'lik bir büyütmede ve daha sonra plazma zarını daha ayrıntılı olarak göstermek için daha yüksek büyütme seviyelerinde (8.500x ila 16.000x) yakalandı. Makrofajların makropinositoz inhibitörü EIPA ile ön tedavisi membran fırfırı oluşumunu zayıflattı (Şekil 1). Makronositozla ilişkili plazma membran aktiviteleri ardışık beş adıma ayrılabilir: 1) membran fırfırlamasının başlatılması, 2) daireselleşme, 3) fincan oluşumu, 4) fincan kapatılması ve 5) makropinozom oluşumu yoluyla hücre dışı sıvının ve ilişkili çözünenlerin içselleştirilmesi. Şekil 2, M-CSF stimülasyonunu takiben bu morfolojik olarak farklı plazma membran aktivitelerinin temsili görüntülerini göstermektedir. Büyük tabaka benzeri fırfırlar (Şekil 2A), dairesel C şeklindeki fırfırlar (Şekil 2B) ve makropinositik kaplar (Şekil 2C) 6.000x ila 7.000x büyütmede yakalandı. Taramalı elektron mikroskobu, hücre yüzeyinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlamak için kullanılabilir, ancak içselleştirilmiş makropinozomları görselleştirmek için kullanılamaz. PMA ve M-CSF tedavisini takiben membran fırfırlarının miktarının belirlenmesi Şekil 3'te gösterilmiştir. Makropinozom oluşumu, Şekil 4'te gösterildiği gibi konfokal mikroskopi de dahil olmak üzere alternatif görüntüleme teknikleri ile doğrulanabilir. Son olarak, membran karıştırmanın SEM miktarı, makropinositozun uyarılmasını doğrulamak için bir floresan sıvı faz belirtecinin (örneğin, FITC- veya Texas kırmızı-dekstran) akış sitometrisi nicelleştirmesi ile tamamlanmalıdır (Şekil 5).

Resim 1: RAW 264.7 makrofajlarının elektron mikroskobu görüntülerinin taranması. RAW 264.7 makrofajları 30 dakika boyunca araç (DMSO kontrolü) veya EIPA (25 μM) ile ön işlemden geçirildi ve membran karıştırmasını uyarmak için PMA (1 μM, 30 dakika) veya M-CSF (100 ng / mL, 30 dakika) ile inkübe edildi. Sağdaki görüntüler hücre yüzeyinin daha yüksek büyütülmesini göstermektedir. Kırmızı oklar: membran fırfırlar. Yeşil ok: c şeklindeki fırfır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Taramalı elektron mikroskobu ile yakalanan makropinositozun morfolojik evreleri. RAW 264.7 makrofajlar 30 dakika boyunca M-CSF (100 ng / mL) ile tedavi edildi ve SEM görüntüleme için hücreler işlendi. (A ) tabaka benzeri membran çıkıntısı, ( B ) C şekilli membran fırfırı ve (C) makropinositik kap. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Membran fırfırı oluşumunun miktarının belirlenmesi. RAW 264.7 makrofajları 30 dakika boyunca araç (DMSO kontrolü) veya EIPA (25 μM) ile ön işlemden geçirildi ve membran karıştırmasını uyarmak için PMA (1 μM, 30 dakika) veya M-CSF (100 ng / mL, 30 dakika) ile inkübe edildi. Çubuk grafik, toplam hücre sayısına normalleştirilmiş membran fırfırlarının sayısını gösterir (n = 3). Veriler SEM'± ortalamasını temsil etmektedir. *p < araca karşı 0,05, PMA veya M-CSF tedavisine karşı 0,05 < #p. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 4: Makropinozom oluşumu. Hücreler 30 dakika boyunca PMA ile ön işlemden geçirildi ve 10 dakika boyunca Texas kırmızı-dekstran (25 μg / mL, kırmızı) ve FM4-64 (5 μg / mL, yeşil) ile inkübe edildi. Görüntüleme konfokal mikroskop kullanılarak yapıldı. Mavi oklar: zar karıştırma, sarı oklar: Teksas kırmızı-dekstran içeren makropinozom, yeşil oklar: makropinozomlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Makropinositozun miktarı. RAW 264.7 makrofajları 30 dakika boyunca araç (DMSO kontrolü) veya EIPA (25 μM) ile ön işlemden geçirildi ve 2 saat boyunca PMA (1 μM) ve FITC-dextran (100 μg / mL; 70.000 MW) ile inkübe edildi. Çubuk grafik, araç tedavisine normalleştirilmiş ortalama floresan yoğunluğu (MFI) katlama değişimini gösterir (n = 3, üçlü olarak gerçekleştirilir). Veriler SEM'± ortalamasını temsil etmektedir. *p < araca karşı 0,05, #p < 0,05 ile PMA. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.