Taramalı Elektron Mikroskobu ile Membran Fırfırı Oluşumunu Görselleştirme

Summary

Makropinositoz, membran fırfırları olarak da bilinen F-aktin bakımından zengin tabaka benzeri membran projeksiyonlarının oluşumu ile başlatılan oldukça korunmuş bir endositik işlemdir. Makropinositotik solut içselleştirme oranının artması çeşitli patolojik durumlarda rol oynamıştır. Bu protokol, taramalı elektron mikroskobu kullanarak membran fırfırı oluşumunu in vitro olarak ölçmek için bir yöntem sunar.

Abstract

Membran karıştırma, yeni polimerize aktin filamentlerinin bir ağını içeren hareketli plazma membran çıkıntılarının oluşumudur. Membran fırfırları kendiliğinden veya büyüme faktörlerine, inflamatuar sitokinlere ve forbol esterlerine yanıt olarak oluşabilir. Membran çıkıntılarının bazıları, distal kenarlarında kaynaşan dairesel membran fırfırları halinde yeniden organize olabilir ve makropinozomlar adı verilen büyük, heterojen vakuoller olarak sitoplazmaya kapanan ve ayrılan kaplar oluşturabilir. İşlem sırasında, fırfırlar hücre dışı sıvıyı ve makropinozomlar içinde içselleşen çözünürleri yakalar. Yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobu (SEM), hücre yüzeyindeki membran fırfırı oluşumunu, dairesel çıkıntıları ve kapalı makropinositik kapları görselleştirmek ve ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Aşağıdaki protokol, hücre kültürü koşullarını, membran fırfırı oluşumunun in vitro olarak uyarılmasını ve SEM kullanarak görüntüleme için hücrelerin nasıl düzeltileceğini, dehidre edileceğini ve hazırlanacağını açıklamaktadır. membran karıştırmanın miktarı, veri normalizasyonu ve membran fırfırı oluşumunun uyarıcıları ve inhibitörleri de açıklanmaktadır. Bu yöntem, makropinositozun fizyolojik ve patolojik süreçlerdeki rolü hakkındaki temel soruları cevaplamaya, membran fırfırı oluşumunu düzenleyen yeni hedefleri araştırmaya ve henüz tanımlanmamış fizyolojik stimülatörlerin yanı sıra makropinositozun yeni farmakolojik inhibitörlerini tanımlamaya yardımcı olabilir.

Introduction

Makrokinositoz, membran fırfırları¹ adı verilen dinamik ve aktin güdümlü plazma membran çıkıntılarının oluşumu yoluyla büyük miktarda hücre dışı sıvının ve içeriğinin içselleştirilmesinden sorumlu endositik bir işlemdir. Bu zar fırfırlarının çoğu, hücreye kapanan ve tekrar kaynaşan ve plazma zarından makropinozomlar 1 olarak da bilinen büyük, heterojen hücre içi endozomlar^olarak ayrılan bardaklar oluşturur. Makropinositoz, çok çeşitli hücre tiplerinde makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi büyüme faktörleri tarafından indüklenmesine rağmen, doğuştan gelen immün hücrelerde

Protocol

NOT: Aşağıdakiler, SEM mikroskobu kullanılarak RAW 264.7 makrofajlarında membran fırfırı oluşumunu ölçmek için kullanılan genel bir protokoldür. Farklı hücre tipleri için optimizasyon gerekebilir.

1. Hücre hattı ve hücre kültürü

1. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) %10 (hacim/hacim) ısıyla inaktive edilmiş Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 IU/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş RAW 264.7 makrofajlarını nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de ve %5 CO_2'de büyütün. Büyüme medyasını her geçen gün değiştirin.
2. Hücreler% 80 birleştiğinde, steril PBS kullanarak plakayı iki kez yıkayın.
....

Results

Burada, sunulan teknikten elde edilen sonuçları açıklıyoruz. Şekil 1'de gösterilen temsili SEM görüntüleri, PMA ve M-CSF ile tedaviyi takiben RAW 264.7 makrofajlarında membran fırfırı oluşumunu göstermektedir. Görüntüler ilk önce nicelleştirme amacıyla 3.500x'lik bir büyütmede ve daha sonra plazma zarını daha ayrıntılı olarak göstermek için daha yüksek büyütme seviyelerinde (8.500x ila 16.000x) yakalandı. Makrofajların makropinositoz inhibitörü EIPA ile ön tedavisi membran fırfırı oluşumunu .......

Discussion

Mevcut SEM görüntüleme protokolü, in vitro hücre yüzeyindeki membran fırfırı oluşumunu, dairesel çıkıntıları ve makropinositik kapları görselleştirmek ve ölçmek için bir araç sağlar. Mevcut protokol makrofajlara odaklanmasına rağmen, çalışmalar membran fırfırı oluşumunun dendritik hücreler, fibroblastlar, nöronlar ve kanser hücreleri ^{11,12,14,21,30} dahil olmak üzere diğer çe.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
% 0.5 Tripsin-EDTA	Gibco	15400-054
%2 Glutaraldehit	Elektron Mikroskobu Bilimleri	16320
%4 Paraformaldehit	Santa Cruz Biyoteknoloji	281692
5- (N-etil-N-izopropil) -Amilorid	Sigma Yaşam Bilimleri	A3085
Accuri C6 Akış Sitometresi
Karbon Yapıştırıcı Sekmeleri	Elektron Mikroskobu Bilimleri	77825-09
Dimetil Sülfoksit	Corning	25-950-CQC
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı	Cytiva Yaşam Bilimleri	SH30022.01
Falcon 24 kuyulu Şeffaf Düz Tabanlı TC ile muamele edilmiş Çok Kuyulu Hücre Kültürü Plakası	Falcon	353047
Fetal Sığır Serumu	İkizler Biyo	900-108
FitC-dextran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i CO2 inkübatörü	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 Püskürtme Kaplayıcı	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR taramalı elektron mikroskobu
Mikroskop Kapağı Cam	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Kalem Strep	Gibco	15140-122
phorbol 12-miristat 13-asetat	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 makrofaj	ATCC	ATCC TIB-71
Rekombinant İnsan M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Kritik Nokta Kurutucu	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Alüminyum Numune Bağlantıları	Elektron Mikroskobu Bilimleri	75220
Sodyum Kakodilat Elektron	Mikroskobu Bilimleri	12300
Texas red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Tripan Mavi Çözelti	Thermo Fisher Scientific	15250061
Zeiss LSM 780 konfokal mikroskop