Çok Modlu Faz Değiştirme Porfirin Damlacıklarının Sentezi ve Karakterizasyonu

Özet

Bu protokolde, çok modlu faz değişikliği porfirin damlacıklarını sentezleme ve karakterize etme yöntemleri özetlenmiştir.

Özet

Faz değiştirme damlacıkları, yeterli akustik enerjinin uygulanmasıyla yerinde ekojenik mikrobubbles'a dönüşebilen bir ultrason kontrast ajanları sınıfıdır. Damlacıklar mikrobubble emsallerinden daha küçük ve daha kararlıdır. Bununla birlikte, geleneksel ultrason kontrast ajanları akustik geri bildirim ölçümlerinin ötesinde izlenemez, bu da kontrast maddesi biyo-dağılımını veya birikimini ölçmeyi zorlaştırır. Araştırmacılar biyo-dağılım çıkarmak için floresan veya optik emici eşlik eden tanı parçacıklarına güvenmek zorunda kalabilirler. Bu protokolün amacı, yoğuşma yöntemi kullanarak çok modlu faz değişikliği porfirin damlacıkları oluşturmak için adımları detaylandırmaktır. Porfirinler, lipitlere konjuge edilebilen ve damlacık çok yönlülüğünü genişletmek için damlacıklara dahil edilebilen ve akustik özellikleri korurken daha sağlam biyo-dağılım sağlayan farklı emiş bantlarına sahip floresan moleküllerdir. Mikrobubble ve damlacık boyutu dağılımlarını araştırmak için değişen porfirin-lipit ve baz lipit içerikli yedi formülasyon yapıldı. Porfirin içeren yapılara uygun nitelemeler, analitik çok yönlülüklerini çözüm içinde göstermek için protokolde de açıklanmıştır. Boyutlandırma, yoğunlaşma sonrası ortalama çapların öncül popülasyonlardan 1,72 ila 2,38 kat daha küçük olduğunu göstermiştir. Absorbans karakterizasyonu, bozulmamış numunelerin 671 nm'de emicilik zirvesine sahipken, sağlam montajların 700 nm Q bandı zirvesine sahip olduğunu gösterdi. Floresan karakterizasyonu bozulmamış gösterdi% 30 porfirin-lipid montajları floresan olarak söndürülür (%>97), bozulma üzerine floresan iyileşme elde edilir. Akustik buharlaşma, porfirin damlacıklarının düşük basınçlarda ekojenik olmadığını ve yeterli basınçla ekojenik mikrobubbles'a dönüştürülebileceğini göstermiştir. Bu karakterizasyonlar, porfirin damlacıklarının, in vivo veya ex vivoolarak teslimat veya terapötik uygulamalar için ultrason kontrast maddesi biyo-dağılımını ölçmek için absorbans veya floresan bazlı eşlik eden tanı stratejilerine olan ihtiyacı ortadan kaldırma potansiyelini göstermektedir.

Giriş

Ultrason görüntüleme, akustik dalgaları kullanan invaziv olmayan, iyonlaştırıcı olmayan bir tıbbi görüntüleme şeklidir. Ultrason tarayıcıları daha taşınabilir ve gerçek zamanlı görüntüler sağlayabilirken, ultrason görüntüleme düşük kontrasttan muzdarip olabilir, bu da sonografların benzer ekojenik patolojik özellikleri güvenilir bir şekilde ayırt etmesini zorlaştırır. Bu sınırlamayı önlemek için, vasküler kontrastı iyileştirmek için konaka mikrobubbles enjekte edilebilir. Mikrobubbles, akustik dalgalara karşı oldukça ekojenik olan ve gelişmiş damar kontrastı sağlayabilen mikron boyutlu gaz dolu kontrast ajanlarıdır^1,2. Mikrobubbles kabukları ve gaz çekirdekleri görüntüleme, tromboliz, hücre zarı permeabilizasyonu veya geçici vasküler açıklık²gibi farklı uygulamalar için uyarlanabilir.

Mikrobubbles bir dezavantajı onların kısa dolaşım yarı ömürleridir. Örneğin, klinik olarak mevcut perflutren lipid mikroküreciklerinin sadece yarı ömrü 1,3 dakika 3 '^tür. Uzun görüntüleme seansları için birden fazla mikrobubble enjeksiyonuna ihtiyaç vardır. Mikrobubbles bir başka dezavantajı onların büyük çaplarıdır. Perflutren lipid mikroküreçleri yaklaşık 1 ila 3 μm çapında, vaskültürde dolaşacak kadar küçük olsa da, tümörler gibi ilgi çekici dokulara ekstravazasyon ve pasif olarak birikemeyecek kadar^{büyüktürler 4}. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için bir strateji, gaz çekirdeği mikrobubbles daha küçük, sıvı çekirdekli damlacıklar^5,6yoğuşmaktır. Damlacıklar sıvı hallerinde ekojenik olmasa da, yeterince yüksek pik negatif basınçla ultrasona maruz kaldıklarında buharlaştırılarak kontrast sağlama yeteneklerini geri kazanabilirler. Bu, damlacıkların küçük bir sıvı çekirdeğinin daha elverişli farmakokinetiğinden yararlanmasını sağlarken, insonated ve kimyasal bileşimi değiştirmeden kontrast sağlama yeteneğini korur^4,7.

Decafluorobutane, gaz ve sıvı durumlar arasında faz kayması için ideal bir perflorokarbon bileşiğidir^5,6,7. Decafluorobutane, mikrobubbles'ın sadece sıcaklık azaltma ile damlacıklara yoğunlaşmasına izin verirken, daha az yoğun perflorokarbonlar ek basınç gerektirir⁵. Bu nazik yöntem yoğuşma sırasında kabarcıkların yok edilmesini en aza indirir^7,8,9. Çekirdekleri sıvı olduğu için damlacıklar ekojenik değil ve ultrason için görünmez. Bununla birlikte, yeterli akustik veya termal enerjinin uygulanmasıyla, sıvı çekirdekler tekrar gaz halinde buharlaşarak ekojenik mikrobubbles⁸üretebilir. Bu buharlaşma, mikrobubbles'ın ne zaman ve nerede üretüleceği kontrol edilmesine izin verir.

Damlacıklar pasif birikim, yerinde buharlaşma veya hücre geçirgenliğini iyileştirmek için yararlı olsa da ⁴, damlacıklar (ve parçaları) görüntülenemez veya ex vivoölçülemez. Bu nedenle, floresan^{4,10 , 11,}manyetik parçacıklar¹², optik emici ajanlar¹³gibi ölçülebilir eşlik eden tanı maddesi, ilgi çekici dokulara damlacık teslimatını ölçmek için analog olarak kullanılır. Örneğin, Helfield ve arkadaşları, damlacıklar floresan olarak tespit edilemediğinden fare organlarının histoloji görüntüsünün nicelleştirilmesi için floresan nano boncukların ortak enjeksiyonunu kullandı⁴. Eşlik eden tanı ajanlarının dezavantajı, izlenebilir bileşenin bireysel farmakokinetik profiline bağlı olarak damlacıktan bağımsız olarak hareket etmesidir.

Neyse ki, mikrobubbles ve damlacıkların kabuğu özelleştirilebilir. Örneğin, Huynh ve arkadaşları porfirin-lipid kabukları ile ultrason kontrast ajanları gösterdi, çok modlu mikrobubbles¹⁴. Porfirinler aromatik makrosilik yapıya sahip organik bileşikler^{sınıfıdır 14,15}. Optik olarak emici, floresandırlar ve radyoterapi, radyonüklid bazlı görüntüleme veya eser metal bazlı niceleme için çok çeşitli metallere şelatlanabilirler¹⁴. Porfirin örneklerinden biri pirofeoforbiddir (Pyro). Pyro'yu lipitlere bağlayarak, Pyro-lipidleri mikrobubbles veya damlacıklara dahil etmek, birden fazla modalite ile görüntülenebilir ve izlenir: akustik, floresan ve emiciliği yoluyla¹⁴. Bu çok modlu kontrast aracısı birikimi izlemek ve ölçmek için kullanılabilir. Bu, nicel bileşen artık kabuk üzerine konjuge olduğundan, daha doğru teslimat nicelleştirmesi¹⁶'yı etkinleştirerek eşlik eden tanılama aracılarına olan ihtiyacı ortadan kaldırabilir.

Burada, çok modlu faz değiştirme porfirin damlacıkları oluşturmak için bir protokol özetlenmiştir. Ultrason kontrastları ajanlar gibi ilgi çekici dokulara ilaç teslimi için bir platform olarak kullanılabilir gibi tümörler^2,4, ultrason ötesinde tespit edilebilirlik genişletmek doğum etkinliği nicellik için yararlı olabilir. Bu damlacıkların amacı, in vivo , yerinde buharlaşma ve akustiktepasif birikim yapabilen ve ikincil sensörlere güvenmeden ex vivo organlardan biyo-dağılımı veya birikimi ölçme potansiyeline sahip izlenebilir ultrason kontrast ajanları sağlamaktır. Porfirin damlacıklarının biyo-dağıtım sensörleri olarak potansiyelini sergilemek için karakterizasyon yöntemleri de özetlenmiştir. Piro-lipid yüklemesinin kabuktaki etkileri (molar oranı ile% 0 ila% 50) da tartışılmaktadır.

Protokol

1. Susuz lipit filmleri

1. Gereken kabuk bileşenlerinin her birinin kütlelerini hesaplayın (bkz. Ek Dosya "Lipid Formül Sayfası").
   NOT: Bu protokol için, kabuk bileşimi: 10 molar % 1,2-distearoyl-sn-glisero-3-fosephoethanolamine-N-[metoksi (polietilen glikol)-5000] amonyum tuzu (DSPE-PEG5K), x molar % pirofotofor 1-stearoyl-2-hydroxy-sn-glisero-3-fosfokolin (Pyro-SPC) ve (90 - x) molar % 1,2-distearoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DSPC) konjuge. Pyro-SPC miktarı 7 kabuk bileşiminde(x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50) değişmektedir. Stok şişesinde DSPE-PEG5K'nin moleküler ağırlığını kontrol edin.
   1. Protokolü en az 1 mL hacimli herhangi bir lipid hacmine ölçeklendirin. Bu protokol için tüm formülasyonlar için mL başına 1 mg toplam lipit konsantrasyonu ile 10 mL toplam lipid hacmi kullanılmıştır. Ekscipient çözelti olacaktır: 10% propilen glikol, 10% gliserol ve% 80 fosfat tampon salin (PBS, 1X, 7.4 pH) (% v / v / v) (bkz. Adım 2.3 ve "Lipid Formül Sayfası").
      NOT: Pyro-lipids sentez protokolü, Zheng ve ark.¹⁵tarafından yapılan çalışmalardan değiştirilen S1'den S1'e Ek Dosya "Diğer Protokoller ve Veriler" Adımlarında özetlenmiştir.
2. Hesaplanan kütlelere dayanarak (bkz. Adım 1.1 ve "Lipid Formül Sayfası"), Pyro olmayan lipitlerin her birini tartın ve vidalı kapaklı yeterince büyük bir borosilikat cam şişeye aktarın.
3. Şişeyi kaplayın, kapağı ve şişeyi etiketleyin ve lipid şişesinin altını ve duvarlarını alüminyum folyo ile örtün. Bu şişe, protokolün geri kalanı için "Lipid Şişesi" olarak adlandırılacaktır. Lipid Şişesi'ni serin, kuru ve karanlık bir alanda saklayın.
4. Formülasyon Pyro-SPC içeriyorsa, 10 mg Pyro-SPC kuru filmi (bkz. "Diğer Protokoller ve Veriler") 1 mL kloroforma çözün. 5 sn için girdap, emiciliği ölçün ve Lipid Şişesi'ne eklemek için uygun hacmi hesaplayın.
   DİkKAT: Kloroform sağlık açısından zararlı, tahriş edici ve toksiktir. Koruyucu bir laboratuvar önlüğü, göz koruması, eldiven giyin ve duman solumaktan kaçının.
   NOT: Pyro-SPC ışığa duyarlı olduğundan, Pyro-SPC'yi kullanırken mümkünse çalışma alanındaki ışıkları azaltın. Pyro-SPC'yi kullanılmadığında kapalı ve kapalı tutun.
   1. Ultraviyole görünür spektrofotometrede, 800 nm ile 300 nm dalga boyu aralığından emilimi 0,5 nm artışlarla ölçecek ve uyumlu bir 1 cm yol uzunluğu cuvettesinde 2000 μL saf metanol ile bir taban çizgisi ölçecek şekilde ayarlayın.
      DİkKAT: Metanol sağlık açısından zararlı, tahriş edici, toksik ve yanıcıdır. Koruyucu bir laboratuvar önlüğü, göz koruması, eldiven giyin ve duman solumaktan kaçının. Kıvılcımlardan ve ısıdan uzak dur.
   2. 2000 μL metanol içine kloroformda Pyro-SPC'nin 2 μL'sini ve 30 sn için girdabı ekleyin. Temiz, uyumlu 1 cm'lik bir cuvette içine aktarın ve emiciliği ölçün. Absorbans, ultraviyole görünür spektrofotometrenin absorbans aralığının 667 nm dışındaysa bu seyreltme faktörünü ayarlayın.
      NOT: Kloroform veya metanol transferi yaptığınızda, daha iyi doğruluk için mekanik pipet yerine temiz bir cam şırınna veya pozitif deplasmanlı pipet kullanın.
   3. Üç taraflı absorbans değerlerini elde etmek için Adım 1.4.2'yi iki kez daha yineleyin.
   4. Absorbans tepe değerlerini 667 nm olarak ortalamalayın ve Lipid Şişesi^14,15için gereken kloroform pyro-SPC hacmini hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
      
      burada V, Pyro-SPC'nin gerekli kloroform hacmidir, m Pyro-SPC'nin gerekli kütlesidir (bkz. Adım 1.1 ve "Lipid Formül Sayfası"), M, Pyro-SPC'nin moleküler ağırlığı 1040.317 g·mol^-1, A ortalama emicilik 667 nm, d, kloroform hacimlerde metanol ve Pyro-SPC'ye dayanan seyreltme faktörüdür (Adım 1.4.2), L, 1 cm'de cuvette yol uzunluğudur ve ε 45000 L·mol -1 ·cm^-1'dePyro-SPC'nin 667^nmmolar zayıflama katsayısıdır.
      NOT: Denklemin paydası, bir analitin çözeltideki konsantrasyonu ile uzaktan ölçülen optik absorbansı ilişkilendiren Bira-Lambert Yasası'dır.
   5. Temiz bir cam şırınna (Şekil 1A) kullanarak önceki adımdan Lipid Şişesi'ne kloroform olarak hesaplanan Pyro-SPC hacmini ekleyin ve ardından şişeyi kaplayıp örtün.
      NOT: Şekil 1'de yalnızca 0 Pyro-lipid formülasyonu gösterilir.
   6. Kloroformda kalan herhangi bir Pyro-SPC varsa: Dumanlı bir başlıkta, Pyro-SPC + kloroform şişesini Adım 1.4'ten çözün, şişeyi kısmen yana eğin ve nitrojen gazını pyro-SPC/ kloroform şişesine mümkün olduğunca hafifçe akıtın. Azot gazı akışını kullanarak kloroformu kurutmak ve Pyro-SPC'yi kurudukça şişenin iç duvarına eşit şekilde kaplamak için şişeyi döndürün. Sıçrama olmadığından ve çözeltinin hiçbirinin düşmeyip düşmeyden emin olun.
   7. Pyro-SPC lipid filmi kuru ve şişenin duvarına kaplanmış olarak göründüğünde, azot gazı akışını kapatın. Şişeyi kaplayın, şişe boynunu balmumu filmiyle kapatın ve şişeyi -20 °C'de ve karanlıkta saklayın.
5. % 90 kloroform ve% 10 metanol (% v / v) çözeltisi hazırlayın ve Lipid Şişesine 5 mL ekleyin. Lipid Şişesini kaplayın ve içeriği homojenize etmek için hafifçe döndürün (Şekil 1B).
   NOT: Formülasyon fosfatadik asit lipitler içeriyorsa (örneğin 1,2-distearoyl-sn-glisero-3-fosfat sodyum tuzu (DSPA)), ekleyin: 60% kloroform, % 32 metanol ve% 8 çift deiyonize su (% v / v / v) Lipid Vial için. Lipit içeriğini tamamen çözmek için daha yoğun girdap gerekebilir.
6. Dumanlı bir başlıkta Lipid Şişesi'nin kapağını çözün, Lipid Şişesini kısmen yana yatırın ve lipid şişesine mümkün olduğunca hafifçe azot gazı akışı. Azot gazı akışını kullanarak çözeltiyi kurutmak için Lipid Şişesini döndürün ve lipid filmini kurudukça Lipid Şişesi'nin iç duvarına eşit şekilde kaplayın. Sıçrama olmadığından ve çözeltinin hiçbirinin düşmeyip düşmeyden emin olun.
7. Lipitler kuru ve lipit şişesinin iç duvarlarına kaplanmış olarak göründüğünde (Şekil 1C), azot gazı akışını kapatın, Lipid Şişesi'nin tabanını ve duvarını alüminyum folyo ile örtün ve üst açıklığı havalandırma için bir iğne ile birkaç delik ile dürtülmüş alüminyum folyo ile örtün (Şekil 1D).
8. Kapalı Lipid Şişesini bir vakum kurutucunun içine etiketleyin ve yerleştirin ve lipitlerin en az 24 saat, ancak en fazla 72 saat kurumasını bekleyin.
   NOT: Protokol daha sonra, 24 ila 72 saat sonra sürdürülebilir.

2. Lipid Hidrasyon

1. Bir banyo sonicator'ı suyla doldurun ve 70 ° C'ye ısıtın. Suyu karıştırmaya yardımcı olmak için sonikasyonu açın.
   DİkKAT: Su ve sonicator yüksek sıcaklıklardadır. Suya ve sonicator'a dokunmaktan kaçının. Göz koruması, koruyucu laboratuvar önlüğü ve koruyucu eldiven giyin.
2. Banyo sonicator 70 °C'ye ulaştıktan sonra Lipid Şişesi'ni vakum kurutucudan çıkarın. Mümkünse çalışma alanındaki ışıkları azaltın.
3. 
   
7. 
   
9. 
   
   1. 
      
   3. 
      
10. 
    

4. 
   

3. 1. 
      
   2. 
      
   3. 
      
   5. 
      
   9. 
      
4. 
   
5. 
   
7. 1. 
      
      
14. 
    
15. 
    

1. 
   
3. 2. 
      
4. 
   
   3. 
      
5. 
   
   3. 
      
   5. 
      

7. 
   

Sonuçlar

Önceden yoğunlaştırılmış, boyutlandırılmış mikrobubble örnekleri (n = 3) ve yoğuşma sonrası damlacık örnekleri (n = 3) 10 μm diyafram açıklığına sahip bir Coulter Sayacında (CC) boyutlandırıldı. 10 μm diyaframın bir sınırlaması, ortalama boyut ve konsantrasyonu önyargılı hale getiren 200 nm'den küçük parçacıkları ölçememesidir. Şekil 4, Pyro-lipid içerik formülasyonlarının her biri için boyutlandırma verilerini gösterir. Tablo 1, boyutlandırma verilerine dayalı istatistikleri gösterir. Ön ve son yoğunlaştırılmış ortalama çapların bir oranını kullanarak, sonuçlar% 0 Pyro-lipid formülasyonunun 0.02'± 1.72 ile en küçük ortalama çap kaymasına sahip olduğunu gösterdi. P Pyro-lipid formülasyonu 2.38 ± 0.08 ile en büyük ortalama çapa sahipti. %1 Pyro-lipid damlacık örneği en yüksek gözlenen konsantrasyona sahipti (2.71 ± 0.13) ×^{10 10} /mL iken% 40 Pyro-lipid damlacık örneği 10⁹ /mL'× de (7.36 ± 0.81) en düşük gözlenen konsantrasyona sahipti. Boyutlandırma verileri% 10 Pyro-lipid damlacık örneğinin 261 ± 13 nm ile en küçük tepe dimetere sahip olduğunu, % 50 Pyro-lipid damlacık örneğinin ise 390 ± 55 nm ile en büyük olduğunu gösterdi. Genellikle Pyro-lipid içeriği arttıkça konsantrasyon azaldı ve ortalama çap arttı. Yoğunlaştırılmış numuneler öncü mikrobubble örneğine dayandığından, her iki ultrason kontrast ajanı türü için de eğilim oluşmuştır. Pyro-lipid içeriği arttıkça, bir mikrobubble subpopülasyonu (yaklaşık 2000 μm'de bir tepe boyutu ile) oluşmaya başladı. Bu ikincil tepe% 0 Pyro-lipid mikrobubble örneğinde mevcut değildi ve en belirgin olanı% 40 ve% 50 Pyro-lipid popülasyonlarında mevcuttu.

Şekil 5, 0 Pyro-lipid damlacık örneğinin temsili absorbans ölçümlerini göstermektedir. PBS'deki bozulmamış numunenin zirvesi 700 nm iken Triton'daki bozulan örnek zirveyi 671 nm'ye kaydırdı. Bu, sağlam montajların tek tek, birleştirilmemiş lipit bileşenlerine kıyasla farklı optik özelliklere sahip olduğunu göstermiştir.

Şekil 6A, önceden yoğunlaştırılmış mikrobubble örneğinin temsili floresan ölçümlerini gösterirken, Şekil 6B0 Pyro-lipid ile yoğunlaştırılmış damlacık örneğini göstermektedir. PBS'deki bozulmamış örnek 704 nm'de floresan zirvesine sahipken, bozulan form 674 nm'de bir tepeye sahipti. Eğrinin altındaki bozulmamış alanı eğrinin altındaki sağlam alanla çıkarmak ve eğrinin altındaki bozulan alana bölmek, sırasıyla% 30 Pyro-lipid mikrobubble örneği ve damlacık örneği için% 98.61 ve% 98.07 olarak çalışan söndürme verimliliği sağlar.

Mikrobubbles'a dönüşen damlacıkları göstermek için, seyreltilmiş damlacıklar ultrason sistemi ile 37 °C akış hayaletinde görüntülendi ve buharlaştırıldı. Şekil 7, farklı basınçlarda görüntülenmiş% 30 Pyro-lipid damlacık örneğinin temsili ultrason görüntülerini göstermektedir. Düşük basınçlarda (Şekil 7A), çok az sinyal vardı, sadece agar sentezinden sıkışmış hava kabarcıklarından gelen arka plan sinyali vardı. Bunun nedeni damlacıkların ekojenik olmaması ve ultrason dağıtmamasıdır. Biraz yüksek bir güçte, parlak beneklerin ortaya çıkmasında gösterildiği gibi birkaç mikrobubbles (Şekil 7B) oluşturuldu. Basınç arttıkça, daha fazla mikrobubbles üretildi (Şekil 7C ve 7D). Bu aynı zamanda damlacıkların 37 °C'de kendiliğinden buharlaşmayacağını göstermiştir.

Şekil 1: 0 Pyro-lipid çözeltisini oluşturma adımlarının görüntüleri. A)Lipid tozu artı kloroformda Pyro-SPC. B)Çözünen çözelti eklendi. C) Lipid filmi kurutulur ve şişenin iç duvarına kaplanır. D) Alüminyum folyoya sarılı lipid şişesi (dış folyo yeniden kullanılmak üzere bantlanmış). E)Hidratlı lipit çözeltisi. F) Serum şişesinde lipid çözeltisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: 10 manifold gaz eşanjörü. Protokolde atıfta bulunulen vanalar etiketlenmiştir. Gaz Eşanjörünün nasıl monteılacağına ilişkin yönergeler için "Diğer Protokoller ve Veriler" Ek Dosyasına bakın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: A) Örnek şişelerdeki 7 formülasyonun (%0 ila P Pyro-SPC) lipit çözeltileri. B'den D'ye şekiller% 30 Pyro-lipid damlacıkları yapmak için atılan adımların görüntülerini göstermektedir. B) Örnek bir şişede % 30 Pyro-lipid çözeltisi. C) Ajitasyon sonrası. D) 15 dk boyut seçili. E)Alt bölme kafeunsiz şişeye aktarılır. D) Yoğuşma sonrası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Coulter Counter (CC), farklı Pyro-lipid kabuk içeriğine sahip boyut seçilen mikrobubble ve damlacık örneklerinin boyutlandırma verilerini(n = 3). Düz yeşil çizgiler mikrobubbles ve noktalı siyan çizgileri damlacıkları temsil eder. A) %0 Pyro-SPC. B) %1 Pyro-SPC. C) Pyro-SPC. D) Pyro-SPC. E) 0 Pyro-SPC. F) @ Pyro-SPC. G) P Pyro-SPC. H) Kabuktaki Pyro-SPC içeriğine dayanarak CC'den mikrobubble ve damlacık örneklerinin toplam gözlemlenen konsantrasyonları. Tüm hata çubukları standart sapmayı gösterir. Tüm ölçümler 200 nm ila 6000 nm boyut aralığına sahip 10 μm diyafram kullanılarak gerçekleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: PBS ve %1 Triton olarak seyreltilmiş, yoğunlaştırılmış 0 Pyro-lipid damlacık örneğinin 300 ila 800 nm'si arasında temsili ultraviyole görünür (UV-Vis) spektroskopi absorbans ölçümleri.

Şekil 6: 600 ila 750 nm arasında temsili floresan emisyonu 410 nm'de heyecanlı. A)PBS ve %1 Triton'da boyuta seçilmiş, önceden yoğunlaştırılmış 0 Pyro-lipid mikrobubble örneği. B)PBS'de ve %1 Triton'da 0 Pyro-lipid damlacık örneği sonrası yoğunlaşma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: B modunda klinik öncesi 21 MHz doğrusal dizi dönüştürücü ile çekilen 37 °C agar akış hayaletinin temsili ultrason görüntüleri (bkz. Malzeme Tablosu). Sol sütunda (Şekil A, C, E,& G) PBS denetimleri gösterilir. Sağ sütun (Şekil B, D, F,ve H) 20 μL'lik yoğunlaştırılmış% 30 Pyro-lipid damlacık örneğini 37 ° C PBS'nin 50 mL'sine seyreltilmiş olarak gösterir. Her satır, Sheeran ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmalardan tahmin edilen serbest alan tepe negatif basınçlarını temsil^eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yöntem	Aracı	Pyro Kabuğu %	0	1	10	20	30	40	50
CC	Baloncuk -lar	Conc. [/mL]	(2,76 ± 0,28) × 10^10	(3,04 ± 0,15) × 10^10	(2,02 ± 0,11) × 10^10	(1,91 ± 0,22) × 10^10	(1,47 ± 0,05) × 10^10	(8,47 ± 0,95) × 10^9	(9,89 ± 0,15) × 10^9
CC	Baloncuk -lar	Tepe [nm]	329 ± 6	297 ± 15	305 ± 21	273 ± 14	310 ± 40	266 ± 33	393 ± 89
CC	Baloncuk -lar	Ortalama [nm]	609 ± 2	603 ± 15	635 ± 6	690 ± 8	812 ± 1	935 ± 22	950 ± 55
CC	Baloncuk -lar	Ortanca [nm]	450 ± 6	421 ± 6	414 ± 6	432 ± 5	490 ± 2	596 ± 37	695 ± 41
CC	Damlacık -ları	Conc. [/mL]	(2,18 ± 0,07) × 10^10	(2,71 ± 0,13) × 10^10	(1,75 ± 0,18) × 10^10	(1,72 ± 0,13) × 10^10	(1,09 ± 0,01) × 10^10	(7,36 ± 0,81) × 10^9	(7,38 ± 0,28) × 10^9
CC	Damlacık -ları	Tepe [nm]	292 ± 0	297 ± 17	261 ± 13	280 ± 9	268 ± 17	287 ± 38	390 ± 55
CC	Damlacık -ları	Ortalama [nm]	353 ± 5	350 ± 5	347 ± 1	347 ± 4	397 ± 1	399 ± 6	400 ± 7
CC	Damlacık -ları	Ortanca [nm]	318 ± 4	318 ± 4	310 ± 1	315 ± 2	340 ± 0	367 ± 5	370 ± 9

Tablo 1: Coulter Counter'dan (CC) farklı Pyro-SPC içeriğine sahip mikrobubble ve damlacık örneklerinin veri istatistikleri boyutlandırma (n = 3). Tüm hatalar standart sapmayı gösterir.

Ek Bilgi - Lipid Formül Sayfası: Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Bilgi - Diğer Protokoller ve Veriler: Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışma

Tüm lipit bileşenlerini bir araya ekledikten sonra (Adım 1.2 ve 1.4.5, Şekil 1A),Pyro-lipid ve Pyro dışı lipid bileşenlerinin tamamen homojenize olmasını sağlamak için kloroform ve metanol çözeltisi (ve DSPA gibi fosfatidik asit lipitleri varsa su) eklenmiştir (Adım 1.5, Şekil 1B). Heterojen lipid bileşimine sahip lipid veziküllerinin oluşumunu önlemek için, çözünmüş lipitler kurutulur ve şişe duvarının iç kısmına ince bir film olarak kaplanır (Şekil 1C). Kaplama (Adım 1.6), kurutulmuş filmin yüzey alanını artırdığı için hidrasyonun (Adım 2.1 ila 2.4) daha kolay olmasını sağlar. Kurutma (Adım 1.6, Şekil 1C)ve vakumlama (Adım 1.8, Şekil 1D),kloroform ve metanollerin mikrobubbles oluşumunu bozabileceğinden tamamen buharlaşmasını sağlamak için yapılmıştır. Protokol, lipid çözelti hacimlerini 1 mL'ye kadar düşürmek için ölçeklendirilebilirken, daha büyük hacimler şişeden şişeye varyasyonu azaltabilir. Bu, pyro-SPC'yi kullanılmadığı süre boyunca düşürme riskine neden olsa da, lipid çözeltisinin depolama durumu (Adım 2.9 ila 2.10) bu riski azaltmak içindi. Gaz eşanjörü ile gaz giderme adımı (Adım 2.9.2, Şekil 1F ve Şekil 2)oksidasyonu önlemek için mümkün olduğunca fazla oksijeni ortadan kaldırmaya yarar. Atmosferik gazlar çözeltide hala çözülürken porfirin-lipit içeren lipit çözeltilerinin depolanması önerilmez (Şekil 1E).

Adım 2.10'da lipid çözeltisi, klinik olarak onaylanmış ultrason kontrast ajanı perflutren lipid mikroküreçlerinin nasıl satıldığına benzer şekilde basınçlı bir kafa boşluğuna sahip bir serum şişesindedir (Şekil 1F'yebenzer). İç çalışma, kapak kauçuk durdurucu gibi yumuşak bir malzemeyse Pyro-lipidlerin varlığı ile mekanik ajitasyon yoluyla kararlı mikrobubbles üretilemediğini göstermiştir. Bu nedenle, lipid çözeltisi kauçuk olmayan fenolik kapaklı bir örnek şişeye aktarılmıştı (Adım 4.1 ila 4.4, Şekil 3A ve 3B). Kafeunsuzorobütan gazı numune şişesine aktığında (Adım 4.1 ila 4.4), daha yoğun decafluorobutane numune şişesi kafa boşluğundaki atmosferik havayı yerinden etmelidir. Şu anda, Pyro-lipidlerin neden kauçuk durdurucularla mikrobubbles oluşturamadığı bilinmemektedir. Pyro-lipid olmadan, stabil mikrobubbles doğrudan kauçuk durduruculu serum şişelerinde yapılabilir^4,7. Bu nedenle, serum şişesini gazdan arındırmak ve yeniden basınçlandırmak için Gaz Eşanjörü'nün kullanılması ve ardından serum şişesinin kendisini Pyro-lipid olmayan formülasyonlar⁴, 5^{,6, 7}için ajite etmesi önerilir (bkz. "Diğer Protokoller ve Veriler"). Serum şişesinde mekanik olarak ajite edebilmenin avantajı, kafa boşluğunun basınçlandırılabilmesi ve serum şişesinin baş aşağı çevrilmesiyle boyut seçimi yapılabilmesidir⁸. Bu protokolde, %0 Pyro-lipid formülasyonu, Pyro-lipid içeren formülasyonlarla tutarlı olması için örnek bir şişeye (Adım 4.1 ila 4.4) aktarıldı. Ek olarak, daha uzun acyl lipid zincir uzunlukları, daha iyi van der Waals etkileşimleri nedeniyle daha kararlı damlacıklara neden olur¹⁹. Lipid kabuğu bileşimi, tüm lipit tipleri için 18-acyl zincir uzunluğu, ticari olarak mevcut olanlara göre seçildi. DSPE-PEG5K, polietilen glikol zincirlerinin varlığı, yapıların itici sterik kuvvetler yoluyla birleşmesini önlediği için tüm formülasyona dahil edildi (Adım^1.1). Lipid hidrasyon sırasında, banyo sonicator banyo 70 °C (Adım 2.1) 18-acyl zincir uzunluğu lipid film¹⁸tamamen dağıtmak için yeterince yüksek olarak ayarlanmıştır. Daha uzun akil zincir uzunlukları için daha yüksek sıcaklıklar gerekecektir.

Daha yüksek Pyro-lipid yüklemesi, en üst düzeye çıkar porfirin yüklemesinden yararlanan belirli uygulamalar için istenebilecek optik emici ve floresan bileşenlerin konsantrasyonunu artıracaktır. Bununla birlikte, Pyro-lipid içeriği arttıkça, gözlemlenebilir damlacık konsantrasyonu azaldı ve çaplar arttı (Şekil 4 ve Tablo 1). Bu, optik floresan ve emiciliği özellikleri ile damlacık konsantrasyonu ve çapı arasındaki bir takası göstermektedir. Küçük sızdıran kaplar aracılığıyla in vivo birikimi için küçük çaplara öncelik vermesi gereken araştırmacılara veya yüksek miktarda damlacık enjekte edilmesi gerekiyorsa, Pyro-lipid yüklemesini artırmak damlacık dimeterinde artışa veya damlacık konsantrasyonunda azalmaya değmeyebilir. Yüksek damlacık konsantrasyonları ve/veya küçük damlacık çapları her şeyden önemliyse, Pyro-lipidler yerine benzer büyüklükteki eşlik eden tanı ajanları düşünülmelidir. % 1 Pyro-lipid damlacıkları konsantrasyonda bir azalmaya veya boyut artışına neden olmazken,% 1 Pyro-lipid yüklemesi doku arka planından floresan olarak makul bir şekilde tespit edilemeyecek kadar düşük olabilir. Bununla birlikte, porfirin moiety esnekliği, düşük konsantrasyonlu uygulamalar için daha uygun alternatif nicelik araçları sağlayacak fonksiyonelleştirme için birden fazla seçenek sunar. Örneğin, Pyro-lipidler positon emisyon tomografi görüntüleme ve gama sayma²⁰için bakır-64 veya kütle spektrometresi kullanarak iz-metal nicelemesi için paladyum veya manyetik rezonans görüntüleme için manganez ile şelatlanabilir¹⁴.

Bazı deneyler sadece küçük bir damlacık çözeltisi hacmi gerektirebilirken, 1.85 mL örnek şişeyi doldurmak için lipid çözeltisinin 1 mL'si gereklidir. Goertz ve ark. elleçleme, kafa boşluğu basıncı, sıvı-gaz oranı ve hatta şişe şekli değişikliklerinin mikrobubble popülasyonlarını etkileyebileceğini göstermiştir¹⁷. Ajitasyon sırasında şişe sıcaklığı ve boyut seçimi de boyut dağılımını etkileyebilir. Bu nedenle, son kullanıcı tarafından optimize edilen yöntemler için damlacık yaparken mümkün olduğunca tutarlı olmak önemlidir. Açılmamış damlacıklar dondurulabilir (-20 °C) ve daha sonra ileride kullanılmak üzere çözülebilir, ancak bu durum boyut popülasyonlarını etkileyecektir.

Bir lipid çözeltisini mikrobubbles içine aktive eden ajitasyon prosedürü morfolojik olarak homojen bir popülasyon üretmez (Adım 4.6); bunun yerine, örnek mikrobubbles, multilameller vesicles, lipozomlar ve miseller^18,21^,22ile doldurulur. Mikrobubble boyutları mikron ve nanometre aralığını kapsarken, diğer yapılar büyük ölçüde 800 nm ^23'ünaltındadır. Kullanılan boyutlandırma teknikleri bu çeşitli yapılar arasında ayrım yapmaz ve bu nedenle tedirgin sonrası mikrobubble örnekleri (Adım 4.6, Şekil 3C)ve yoğunlaşmış damlacık örnekleri (Adım 4.14, Şekil 3F)karışım olarak kabul edilmelidir. Ultrasona duyarsız montajlar (multilameller veziklinler, lipozomlar ve micelles) muhtemelen yoğuşma sonrası korunur ve faz değiştirilebilir çekirdekleri olmadığı için boyut değiştirmez. Coulter Sayacı bu farklı supramoleküler montajları ayırt edemediğinden, yoğuşma sonrasında nüfus büyüklüğündeki değişim, nano ölçekli yapıların bir kısmının geri döndürülemez olduğu ve bu büyüklükteki bölgede gözlemlenen nüfusa katkıda bulunduğu varsayımıyla yorumlanmalıdır. Ek olarak, bu yapılar bu örneklerin spektroskopik ve floresan imzalarına katkıda bulunur¹⁴. Misellerin, lipozomların/ vesiklelerin ve damlacıkların floresan ve emici imzaları, floresan söndürme dereceleri de dahil olmak üzere^{benzerdir 14}. Bu nedenle, Şekil 3C ila 3F, Şekil 4 , Şekil 5'tekiPBS seyreltilmiş örnek ve Şekil 6'dakiPBS seyreltilmiş numunede montajların bir karışımının olduğunu göz önünde bulundurmakönemlidir.

Boyut seçimi ve yoğuşma öncesinde (Adım 4.9) sonra, şamandıra kabarcıklarını Feshitan ve ark.²¹ tarafından açıklandığı gibi şamandıra olmayan montajlardan ayırmak için mikrobubble örneğini santrifüj ederek kabarcıksız montajları ortadan kaldırmak mümkündür. Bununla birlikte, bu tür boyut yalıtımlı örneklerin mikrobubble yoğuşması deneyleri, boyut yalıtım prosedürleri kullanılarak seçilen daha büyük öncül mikrobubble popülasyonlarının kullanılmasının daha büyük damlacıklar sağladığını ortaya koydu (spun sonrası kabarcık ve damlacık boyutlandırması için "Diğer Protokoller ve Veriler" Adım S5'e bakın). Bu protokol ile üretilen damlacıkların amaçlanan bir uygulaması mikrobubbles⁴,^8,damlacık popülasyonlarına göre küçük boyutları nedeniyle pasif ekstravazasyon ve birikim platformu olduğundan mümkün olduğunca küçük damlacık popülasyonları istendi. Bu nedenle, bu protokol, son çözümde ultrasona duyarsız miseller, lipozomlar ve vesicles bulunsa bile, santrifüjleme yoluyla boyut izole edilmemiş tedirgin mikrobubble örnekleri kullandı. Bu, biyo-dağılım için nicelleştirme prosedürlerinin enjekte edilen tüm yapılar için sinyal elde edeceği ve sadece damlacıklarla sınırlı olmadığı anlamına gelir. Bununla birlikte, benzer büyüklükteki bu yapılar büyük olasılıkla öncelikle boyuta göre dikte edilen pasif bir mekanizma ile biriktiğinden, bu platformun vivoolarak kullanılması durumunda yapılabilecek ana çıkarımları değiştirmesi gerektiğinden şüphelenilmemektedir . Ultrasonlu ve ultrasonsuz deneysel kollar kullanan testler, sadece çözeltideki perflorokarbon çekirdek montajları ultrasona yanıt vereceği için biyo-dağılımdaki herhangi bir değişiklikden sorumlu olan ultrasona duyarlı damlacıklar olduğundan emin olmak için yapılabilir.

Ajitasyondan sonra, şişe 15 dakika dinlendi ve şişede bir bölüm gözlendi(Şekil 3C'ye karşı 3D). Yüzdürme yoluyla boyut seçimi, aktif bir mikrobubble çözeltisinden daha büyük yapıları / kabarcıkları ortadan kaldırmak için basit bir yöntemdir^8,17. Bu durumda, çapı 5 μm'den büyük olan parçacıklar çoğunlukla boyut seçiminden sonra çıkarılmıştır (Şekil 4). Boyut seçiminin kapsamı, boyut seçimi^17'ninsüresi kontrol edilerek ayarlanabilir. Sheeran ve arkadaşları, boyut seçmemenin, vaskülat^8'itıkayan mikrobubbles üretilebileceği gösterilmiştir.

Perflorokarbonlar biyolojik olarak atıl olma avantajına sahiptir⁷. Decafluorobutane'nin kaynama noktası vücut sıcaklığının üzerinde -1,7 °C iken, damlacıklar 37 °C'ye maruz kaldığında hemen buharlaşmaz (Şekil 7B). Damlacıklar 37 °C'de meta-stabil olduğundan, damlacıkları mikrobubbles^7,9'abuharlaştırmak için ek akustik enerjiye ihtiyaç vardır. Poprosky ve ark. basınçlandırma ile yoğunlaştırılmış porfirin damlacıklarını göstermiştir²². Bu, daha az yoğun perflorokarbonlar kullanırken uygulanabilir ve hatta gerekli bir yöntemdir, ancak yüksek basınçlar süreçte bazı kabarcıkları yok edebilir. Octafluoropropane (C₃F₈₎-36.7 °C kaynama noktasına sahiptir, bu nedenle damlacık yoğuşması için hem soğutma hem de basınçlandırma gerekir. Bununla birlikte, daha hafif perflorokarbon daha az kararlı damlacıklara yol açar. Dodecafluoropentane (C₅F_{12), 28}° C kaynama noktası ile daha kararlı damlacıklara yol açabilir. Bununla birlikte, oda sıcaklığında bir sıvıdır ve buharlaşmak için daha güçlü akustik enerjilere ihtiyaç duyacaktır. Bu nedenle, ultrason kontrast maddesinin içeren gazının seçimi, imalat parametrelerine ek olarak amaçlanan biyolojik uygulamanın koşullarını göz önünde bulundurmalıdır. Bu protokolde yoğuşma için izopropanol banyosu -15 ila -17 °C (Adım 4.7.1 ve Adım 4.13) olarak ayarlanırken, diğer protokoller -10 °C ^5,6kullandı. Yaygın bir kafeunsizorbütan çekirdekte bile, yoğuşma sıcaklığı eksipient bileşime, toplam lipit konsantrasyonuna ve lipid kabuğu bileşimine bağlı olarak değişebilir. Diğer formülasyonları kullanıyorsanız, çözeltinin donmasına neden olmadan uygun damlacık yoğuşmasını sağlamak için optimizasyon gerekebilir.

Damlacıklar mikrobubble öncüllerinden daha küçük ve daha kararlı olduğundan⁷, bazı tümör tiplerinin gelişmiş geçirgenlik ve tutma etkisi gibi belirli ilgi çekici dokulara ekstravaze etmek için pasif birikim mekanizmalarından daha iyi yararlanabilirler^4,24. Floresan, optik emici ve akustik algılama yöntemleri ile¹⁴, alımı ölçmek için tek bir formülasyon kullanmak mümkündür. Ek olarak, bu platform damlacıkların akustik buharlaşmasının pasif seviyelerin ötesinde teslim edilen ajan fraksiyonunu iyileştirip iyileştiremeyeceği araştırmak için kullanılabilir¹⁶. Enjeksiyondan sonra ilgi çekici doku ve organlarda ajan biyo-dağılımını ölçmek için, hayvana bilinen miktarda Pyro-lipid damlacık enjekte edilmeli, kontrol setine bağlı olarak ultrason uygulanabilir veya uygulanamayabilir, hayvan önceden belirlenmiş bir zaman noktası feda edilmeli ve organlar çıkarılmalı ve tartılmalıdır. Organlar homojenize edilmeli, filtrelenmeli, dokuyu hücreden çıkarmak için yüzey aktif madde (deterjan) ile seyreltilmeli ve Pyro sinyallerine dayanarak organ kütlesi başına enjekte edilen doz yüzdelerini elde etmek için floresan veya UV-Vis spektroskopisi ile ölçülmelidir. Adım 5.4.5 (Şekil 5) ve Adım 5.5.5 (Şekil 6) için, Triton X-100 yüzey aktif madde (deterjan) 410 nm'de floresan olmadığı ve emici dalga boyları Pyro'nunkiyle örtüşmediği için numuneleri bozmak için kullanılmıştır.

Mikrobubbles UV-Vis absorbansı ile karakterize değildi. UV-Vis spektroskopunun lazer kaynağı dedektörle paralel olduğundan, herhangi bir büyük kabarcık ışığı dedektörden uzağa saçabilir ve daha optik emici görünmelerini sağlayabilir¹⁴. UV-Vis spektrofotometresinin aksine, floresan spektrofotometrenin dedektörü, kaynağın dedektöre müdahale etmesini önlemek için lazer kaynağına diktir/olmalıdır. UV-Vis, bozulmamış ve bozulmuş damlacık örneklerinin emilmesini ölçmek için kullanılmıştır (Adım 5.4, Şekil 5). 300 ila 800 nm, piro-lipid, Soret bandı (340 ila 500 nm) ve Q-bandı (640 ila 730 nm) olmak üzere iki ana absorbans bandı olarak absorbans dalga boyları olarak seçildi, bu aralıkta¹⁴. Bir damlacık (veya diğer supramoleküler yapılar) içine monte edildiğinde, Pyro-lipid'in Q-bant zirvesi kırmızı banttan 671 nm'den 700 nm'ye kaydırılır (Şekil 5). Bu supramoleküler yapı Triton gibi bir yüzey aktif madde tarafından bozulduğunda, tepe tekrar 671 nm^14,15'e kayar. Bu değişime dayanarak, Pyro-lipitlerin birleştirilmiş bir durumda mı yoksa bozulmuş bir durumda mı olduğunu söylemek mümkündür. İki tepenin oranı, zaman içinde montajların çürümesini tahmin etmek için kullanılabilir.

Floresan ölçümleri için (Adım 5.5, Şekil 6),birleştirilmemiş Pyro-lipid 14 için Soret bandı zirvesine karşılık geldiği için⁴¹⁰nm'lik bir heyecan dalga boyu seçildi. PBS'deki bozulmamış montajların zirveleri olarak 600 ila 800 nm arasında bir emisyon dalga boyu aralığı seçildi ve Triton'daki bozulan Pyro lipitleri bu aralıkta yer alıyor. Floresandaki değişim ve artış (Şekil 6) bozulmamış (PBS'de 704 nm) ve bozulan (Triton'da 674 nm) numuneler yapı kaynaklı söndürme nedeniyle meydana geldi. Birleştirilmiş formda, Pyro-lipid molekülleri birbirine yakın bir şekilde paketlendi, böylece üretilen fotonlar yakındaki Pyro-lipid molekülleri tarafından emildi. Bu, bozulmamış ve bozulmuş söndürme verimliliğinde belirgindir. Bu nedenle, söndürmeyi hafifletmek ve biyo-dağıtım niceliği için sinyali en üst düzeye çıkarmak için örnekleri% 1 Triton X-100 gibi yüzey aktif madde (deterjan) olarak seyreltmek gerekir¹⁴.

Basitlik için, aynı doğrusal dizi ultrason dönüştürücüsü hem buharlaştırmak hem de görüntü için kullanılmıştır (Adım 6.5 ve 6.7, Şekil 7). Bu ultrason dönüştürücü (Malzeme Tablosu) damlacıkları buharlaştırmak için gerekli pik negatif basınçlara ulaşabiliyordu⁸. Bir tankın musluktan deiyonize su ile doldurulması, suda çözünen gazlar üretir (Adım 6.1). Buharlaşma ve görüntüleme ile sudaki çözünmüş gazlardan kaynaklanan paraziti en aza indirmek için, sudaki gazların atmosferle dengelenmesi için tankta 24 saat dinlendirildi (Adım 6.1). Alternatif olarak, deiyonize su yeterince güçlü bir vakuma bağlı yeterince büyük, sızdırmaz bir kapla gazdan arındırılabilir. Ultrason görüntüleri, damlacıklar düşük basınçlarda göze çarpmayan / ekojenik olmadığı için mikrobubbles'ın başarıyla yoğunlandığını göstermiştir (Şekil 7B). Damlacıkların gözlemlenebilir, ekojenik mikrobubbles içine buharlaştırdığı sadece daha yüksek çıkış basınçlarındaydı(Şekil 7D, 7F, 7H). Yoğunlaşma sonrası damlacık örneği miseller ve lipozomlar/veziküller içerirken, bu montajlar ekojenik olmayandır ve sadece damlacıklar ekojenik mikrobubbles içine buhar olabilir. Temel görüntüler oluşturmak için hayaletten bir PBS kontrolü aktı(Şekil 7A, 7C, 7E, 7G). PBS'de basınç arttıkça, kontrast oluşturulmedi. Bu, dönüştürücüden gelen yüksek basınçların tek başına su bazlı bir ortamda kendiliğinden kavitasyon üretemediğini ve bu nedenle üretilen diğer tüm kontrastın kullanılan ultrason kontrast maddesine atfedilebileceğini gösterdi. Çıkış basıncı çok yüksekse, üretilen mikrobubbles yok edilebilir. Basıncı kademeli olarak artırarak ve oluşturulan kontrastı gözlemleyerek, en uygun basınç^{bulunabilir 8}. Damlacıkların dolaşım yarı ömrü, damlacıkların belirli zaman aralıkları olan buharlaştırılması ve zamanla oluşan kontrastın gözlemlenmesiyle benzer şekilde belirlenebilir⁷.

Özetle yoğuşma yöntemi ile farklı Pyro-lipid içeriğine sahip çok modlu faz değiştirme damlacıkları oluşturulmuştur. Boyutlandırma, Pyro-lipid yüklemesi ile mikrobubble/damlacık konsantrasyonu arasında bir takas olduğunu gösterdi. Nitelemeler, hem emicilik hem de floresanlarda bozulmamış ve bozulmuş formlarda farklılıklar olduğunu göstermiştir. Ultrason görüntüleme damlacıkların 37 °C'de ekojenik olmadığını ve yeterli basınçta ekojenik mikrobubbles içine buharlaştırılabilir olduğunu gösterdi. Nitelemeler ayrıca Pyro-lipid damlacıklarının damlacık biyo-dağılımı veya biriktirme testleri için eşlik eden tanı maddelerinin yerini alma potansiyelini göstermiştir. Gelecekteki çalışmalar, çıplak farelerde çözelti içi buharlaşma eşiklerini, çözelti içi stabiliteyi ve in vivo dolaşım sürelerini araştıracaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi (polietilen glikol)-5000] (amonyum tuzu)	Avanti Polar Lipidler	880220	"DSPE-PEG5K" olarak da bilinir1-stearoil-2-hidroksi-sn-glisero-3-fosfokolin
	Avanti Polar Lipidler		855775 "DSPC" olarak da bilinir
Alüminyum Folyo	Herhangi bir marka
Alüminyum Contalar, Yırtma	VWR	16171-840	Standart Alüminyum, 13 mm dış çap
Banyo Sonikatörü	Herhangi bir marka		70 dereceye kadar sonikasyon ve ısıtma yeteneğine sahiptir; C,
Bio-Stor Vidalı Kapaklı Şişeler	Ulusal Bilimsel	BS20NABP	Plastik, 2 mL Etekli, O-ringli
Borosilikat cam şeffaf serum şişeleri	VWR	16171-285	3 mL, 7 mm iç ağız çapı, 13 mm dış ağız çapı
Fenolik Vidalı Kapaklı Borosilikat Cam Numune Şişesi	VWR	66011-020	1,85 mL, Kısa Form Stili, 12 mm dış çap, 35 mm yükseklik, 8-425 kapak boyutu
Vidalı kapaklı Borosilikat Cam Flakon	Herhangi bir marka		Boyutlar istenen hacimlere bağlı olacaktır
Kloroform	Herhangi bir marka
Coulter Counter Elctrolyte Diluent	Herhangi bir marka		Coulter Counter ile uyumlu
Decafluorobutane (C4F10)	FluoroMed	355-25-9
Deiyonize Su	Her marka
Kuru Buz (Karbondioksit)	Her marka
Dinamik Işık Saçılımı (DLS) Partikül Analiz Cihazı	Herhangi bir marka		Sıcaklık kontrolü yapabilen
E-Z Crimper, 13 mm	Wheaton	W225302	13 mm Standart Alüminyum Contalar
E-Z Decapper, 13 mm	Wheaton	W225352	13 mm Standart Alüminyum Contalar
Floresan Spektrofotometre	Herhangi bir marka		400 ila 600 uyarma ve 300 ila 800 nm emisyon algılama yeteneğine sahip, lazer kaynağına
dik dedektörFloresan Spektrofotometre Uyumlu Küvet	Herhangi bir marka		En az 2 mL tutabilir, 300 ila 800 nm kapasiteli, dört tarafı da optik pencereler
İçi Yapılan		Gaz Eşanjörü	Montaj talimatları için Ek Bilgiler - "Diğer Protokoller ve Veriler"e bakın.
Cam şırıngalar	Herhangi bir marka		Boyutlar istenen hacimlere bağlı olacaktır
GLWR Özel Diyafram Tüpü 10 um	Beckman Coulter	B42812	10 & mikro; m diyafram, Beckman Coulter MultiSizer 4e
Glycerol	Herhangi bir marka
Kapaklı yalıtımlı Styrofaom kaplar	Herhangi bir marka
İzopropanol	Herhangi marka
Liyofilizasyon Tarzı Kauçuk Tıpalar	VWR	71000-060	7 mm iç ağız çapı, 13 mm dış ağız çapı, 2 ayaklı, Klorobütil
Membran Diyafram Vakum Pompası	Sartorius Stedim	16694-1-60-06	Ayarlanabilir basınçlı
Metal Maşa	Herhangi bir marka
Metanol	Herhangi bir marka
MS250 21 MHz Doğrusal Dizi Ultrason Dönüştürücü	VisualSonics		21 MHz, B-modu ve doğrusal olmayan görüntüleme yeteneğine sahiptir.
MultiSizer 4e	Beckman Coulter		0,2 & mikrodan boyutlandırma kabiliyeti; m ila 6 ve mikro; m
Nalgene Hızlı Akışlı Steril Tek Kullanımlık Vakum Filtre Üniteleri	Thermo Scientific	567-0010	Polietersülfon (PES) membran, 0.1μ m gözenek boyutu, 1000 mL hacim. Isoton II steril olmadığından, Filtre ünitelerini birden çok kez kullanabilir
İğneler, Konvansiyonel	BD	305176	20 gauge, 1.5 inç uzunluk
Azot Gazı	Herhangi bir marka		Akışı yönlendirmek için regülatör valfleri ve tüpleri olduğundan emin olun. Kurulum, markaya ve kaynağa bağlı olacaktır.
Parafilm	Protokolünde "wax film" olarak adlandırılan	herhangi bir marka
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)	Herhangi bir marka		1X, 7.4 pH
Pipet	Herhangi bir marka		Boyutlar istenen hacimlere bağlı olacaktır
Pipet Uçları	Herhangi bir marka		Boyutlar istenen hacimlere bağlı olacaktır
Plastik Şırıngalar	Herhangi bir marka		1 mL, 3 mL ve 30 mL. Luer Lock bağlantıları ile
Polietersülfon (PES) Membran	Filtre Herhangi bir marka		0.2 ve mikro; m gözenek boyutu
Propilen Glikol	Herhangi bir marka
Pirofeoforbit konjuge 1-stearoil-2-hidroksi-sn-glisero-3-fosfokolin	Şirket içi		"Pyro-SPC" olarak da bilinir. Sentez için "Ek Bilgiler - Diğer Protokoller ve Veriler" bölümüne bakın.
Termometre	Herhangi bir marka		(-20 ila 100 & C)
Triton X-100	"2- [4- (2,4,4-trimetilpentan-2-il) fenoksi]etanol" olarak da bilinen	herhangi bir
Ultrasaf Su	Herhangi bir marka		Tip 1 Saflık
Ultraviyole– Görünür (UV-Vis) Spektrofotometre	Herhangi bir marka		300 ila 800 nm arasında absorbans yapabilen, en az 0,5 nm çözünürlük
Ultraviyole– Görünür (UV-Vis) Spektrofotometre Uyumlu Küvet, 1 cm Yol Uzunluğu	Herhangi bir marka		En az 2 mL tutabilir, 300 ila 800 nm kapasiteli
Vakumlu Kurutucu	Herhangi bir marka
Vevo 2100 Ultrason Görüntüleme Platformu	VisualSonics		Klinik öncesi ultrason görüntüleme sistemi
Vialmix	Bristol-Myers-Squibb		Protokolde "mekanik karıştırıcı" olarak adlandırılmıştır. 45 saniye boyunca çalkalar.
Vorteks Mikser	Herhangi bir marka