Yöntem makalesi

Drosophila davranış çalışmaları için uygun fiyatlı ve verimli bir "ev yapımı" platform ve larva mitokondriyal respirometrisi için eşlik eden bir protokol

1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62669

⸱

24 Eylül 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Biomedicina, Universidade do Oeste Paulista

Bu makalede

Özet

"Maker kültürü" zihnine sahip herkesin, Drosophila melanogaster'deki sayısız davranışsal parametrenin nicel analizi için gerekli ekipman parçalarının çoğunu 3D yazdırarak bir flylab oluşturmaya başlaması için protokoller sağlıyoruz. Ayrıca, davranışsal ve mitokondriyal metabolizma verilerini birleştirmek için larvaları kullanan yüksek çözünürlüklü bir respirometri protokolünü de açıklıyoruz.

Özet

Drosophila'nın insan hastalıkları, davranışları ve temel biyolojisi için model bir organizma olarak kullanışlılığı tartışılmaz. Pratik olmasına rağmen, Drosophila araştırması, muhtemelen bir laboratuvar kurmanın ve bu kadar küçük böceklerle ilgili deneyler yapmanın zor olduğu ve pahalı, özel cihazlar gerektirdiği konusunda yanlış bilgilendirilmiş fikir nedeniyle, gelişmekte olan ülkelerde popülerlikten yoksundur. Burada, gerekli ekipman parçalarının çoğunu 3D yazdırarak D. melanogaster'deki sayısız davranışsal parametreyi nicel olarak analiz etmek için uygun fiyatlı bir flylab'ın nasıl oluşturulacağını açıklıyoruz. Genel sinek bakımı için kullanılmak ve yetişkin sinekler ve larvaları kullanarak davranışsal deneyler yapmak için kurum içi flakon rafları, kur yapma alanları, lokomotor tahliller için aparatlar vb. oluşturmak için protokoller sağlıyoruz. Ayrıca, larva örneklerinde mitokondriyal oksijen tüketimini ölçmek için yüksek çözünürlüklü oksigraf gibi daha karmaşık sistemlerin nasıl kullanılacağına dair protokoller sağlıyoruz ve mitokondriyal alternatif oksidazın (AOX) ksenotopik ekspresyonu üzerine larvalardaki davranış değişiklikleri ile ilişkisini gösteriyoruz. AOX, larva aktivitesini ve mitokondriyal sızıntı solunumunu arttırır ve enzim için termojenik bir rol ile tutarlı olan düşük sıcaklıklarda gelişimi hızlandırır. Bu protokollerin, özellikle gelişmekte olan ülkelerden araştırmacılara, davranış ve mitokondriyal metabolizma verilerini kolayca birleştirmek için Drosophila'yı kullanmaları için ilham vereceğini umuyoruz, bu da insan fizyolojisini ve hastalık durumlarını da düzenleyebilecek genler ve / veya çevresel koşullar hakkında bilgi sahibi olabilir.

Giriş

Drosophila melanogaster, 100 yıldan daha uzun bir süre önce potansiyel olarak güçlü bir model organizma olarak bilim camiasına tanıtıldı. Bu potansiyel, genetik, evrim, gelişim biyolojisi, nörobiyoloji ve moleküler ve hücre biyolojisi gibi biyolojik ve biyomedikal bilimlerin çeşitli alanlarında sıkı bir şekilde doğrulanmıştır. Sonuç olarak, kalıtım, mutajenez, doğuştan gelen bağışıklık, sirkadiyen ritimler, koku alma ve gelişimanlayışımıza önemli ölçüde katkıda bulunan on Drosophila araştırmacısına Tıp veya Fizyoloji alanında altı Nobel Ödülü verilmiştir 1. Belki daha da önemlisi, PubMed'de hızlı bir arama, "drosophila modeli" arama terimini kullanarak son 5 yılda yaklaşık 600 yayını ortaya çıkardığından, D. melanogaster bize yeni insan biyolojisi ve hastalıkları modelleri sunmaktan vazgeçmedi (2, Şubat 2021 itibariyle). Drosophila'nın biyomedikal camiasında yaygın bir model organizma olduğu ABD'de, 2015 yılında NIH tarafından verilen tüm R01 araştırma ödüllerinin yaklaşık %2,2'si Drosophila araştırmacılarına tahsis edilmiştir3. Öte yandan Brezilya'da, Sao Paulo eyaletindeki tüm bilimsel alanlarda araştırma için en önemli fon sağlayan kuruluş olan Sao Paulo Araştırma Vakfı'nın (FAPESP) web sitesinde şu anda finanse edilen projeler için yapılan bir araştırma, çalışmanın ana konusu olarak Drosophila ile yalnızca 24 hibe ve burs gösterdi4. Şu anda FAPESP tarafından finanse edilen 13205 projenin tamamı göz önüne alındığında (5, Şubat 2021 itibariyle), bu 24 Drosophila projesi, toplam projelerin %0,2'sinden daha az bir oranı temsil ediyor ve bu, NIH'ninkinden yaklaşık 12 kat daha düşük. Drosophila'yı ekolojik ve/veya evrimsel bir bakış açısıyla incelemeyi amaçlayan finanse edilen projeleri çıkarırsak ve geri kalan projelerin bu organizmayı sağlık ve hastalıktaki insan biyolojik süreçlerini anlamak için bir model olarak kullandığını varsayarsak, bu oran şok edici bir ~%0.1'e düşer.

Aslında, Brezilya / Sao Paulo'daki Drosophila araştırmasının finanse edilen proje sayısında neden o kadar önemli görünmediğinin nedenlerini ortaya çıkarmak için uygun bir soruşturma gereklidir. Drosophila'yı yetiştirmek pahalı değildir 6,7,8 ve omurgalıların aksine nispeten basittir, deney için bir biyoetik komiteden izin alınması gerekmez 9,10. Bununla birlikte, Brezilya'da11 genetik olarak değiştirilmiş sinek hatlarıyla çalışmak için bir onay gereklidir ve bu da genetiği değiştirilmiş organizmaları içeren tüm çalışmalara özgü bir bürokrasi katmanı ekler. Bununla birlikte, bu muhtemelen ilgilenen araştırmacıların bir flylab başlatmasını engellemeyecektir. Modelin gücü ve bir flylab kurma ve anlamlı deneyler yapma ile ilgili beklenen yüksek maliyetler hakkında yanlış bilgilerin bu kararda önemli faktörler olduğunu düşünüyoruz. Çoğu bilim ekipmanı ve malzemesine gelince, genel sinek bakımı ve davranış analizleri yapmak için uygun cihazlar Brezilya'ya Kuzey Amerika, Avrupa ve/veya başka yerlerden ithal edilmelidir, bu da pahalı ve son derece zaman alıcı bir süreçtir12,13.

Son zamanlarda, 3D yazıcıların gelişmekte olan ülkelerdeki Drosophila araştırmacıları da dahil olmak üzere herhangi bir kişi için daha uygun fiyatlı ve erişilebilir hale gelmesiyle, özel cihazların ithal edilmesine bir alternatif ortaya çıktı. 3D baskı teknolojisi, son 10 yılda, yalnızca şirket tarafından üretilen ürünlere güvenmek yerine kendi kendine yeterlilik fikrine dayanan "maker kültürünün" üyeleri tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır14. Böyle bir fikir, dünyanın dört bir yanındaki akademik araştırma laboratuvarlarında her zaman mevcut olmuştur, bu nedenle 3D yazıcıların birçok yerde standart laboratuvar ekipmanı haline gelmesi şaşırtıcı değildir15,16. Birkaç yıldır, diğer cihazların yanı sıra, markalı eşdeğerlerin maliyetinin bir kısmı için 3D baskı sinek şişesi rafları, çiftleşme alanları, tırmanma aparatları üretiyoruz. Ev yapımı laboratuvar ekipmanlarının basılması ve montajının azaltılmış maliyetleri, klasik olarak 100,00 € 'dan daha düşük bir fiyata üretilebilen ve genetik olarak izlenebilir zebra balığı, Drosophila ve nematodların sofistike opto- ve termogenetik stimülasyonunu kullanabilen bir ışık ve floresan mikroskobu görevi gören FlyPi ile temsil edilmektedir15. Burada, bir Drosophila araştırmacısı olmak (veya kendi mevcut flylab'ını genişletmek) isteyen herkes için gerekli materyallerin çoğunu 3D yazdırmak için bir dizi protokol sunuyoruz. Okuyucu, zaman ayırarak ve biraz uzmanlık geliştirerek, kendi araştırma ihtiyaçlarına daha iyi uyarlanmış baskı aparatları için burada sunulan protokolleri optimize edebilecektir.

Bununla birlikte, bir flylab, özellikle davranışsal analizleri altta yatan metabolik olaylarla ilişkilendirmek niyetindeyse, yalnızca "ucuz" ekipman için bir yer değildir. Drosophila davranış kalıplarının modülasyonunda mitokondrinin rolleriyle de ilgilendik, çünkü bu organeller, ürünleri oksidatif fosforilasyona (OXPHOS) yakınsayan çeşitli metabolik yollar yoluyla çoğu dokuda ATP'nin toplu üretiminden sorumludur. Mitokondriyal metabolizmayı anlamanın bir yolu olarak mitokondriyal oksijen tüketimini analiz etmek, ne yazık ki henüz 3D olarak basılamayan daha karmaşık bir ekipman parçası olan bir oksigraf gerektirir. OXPHOS, hücrede meydana gelen bir dizi ekzergonik redoks reaksiyonuna bağlı olduğu için hemen hemen tüm hücresel süreçleri etkilediğinden,17,18, mitokondriye sağlanan oksitlenebilir substrata dayalı oksijen tüketim oranları, organelin işleyişinin belirli bir davranışın nedeni mi yoksa sonucu mu olduğunu ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Bu nedenle, yayınlanan protokollerin büyük çoğunluğunun yetişkin örneklerini analiz etmeye odaklandığını fark ettiğimizden, burada larva örneklerinde mitokondriyal oksijen tüketimini ölçmek için bir protokol de sunuyoruz. Ciona intestinalis alternatif oksidazın (AOX) transgenik ekspresyonu ile indüklenen mitokondriyal solunumdaki değişikliklerin, soğuk stres altında larva hareketliliğinin artmasına yol açtığını gösteriyoruz. AOX, mitokondriyal membran potansiyeline (ΔΨm) ve ATP üretimine katkıda bulunmadan OXPHOS kompleksleri III ve IV'ün (CIII ve CIV) aktivitesini atlayabilen proton pompalamayan bir terminal oksidaz olduğundan, bu büyük olasılıkla termojenezden kaynaklanmaktadır 19,20,21. Drosophila veya omurgalı da dahil olmak üzere hiçbir böcek doğal olarak AOX21,22,23'e sahip değildir, ancak sayısız model sistem 24,25,26,27,28,29 içindeki ekspresyonu, özellikle CIII ve/veya CIV'in neden olduğu genel mitokondriyal solunum stresi koşulları için terapötik potansiyelini göstermede başarılı olmuştur fazla doldurma. AOX, toksik antimisin A24 ve siyanür24,25 seviyelerine direnç sağlar ve mitokondriyal fonksiyonbozukluğu 24,25,30,31,32 ile ilgili çeşitli fenotipleri azaltır. AOX ekspresyonunun larva davranışını ve mitokondriyal fonksiyonu değiştirmesi, bu enzimin metazoan hücrelerin ve dokuların metabolizması ve fizyolojisindeki rollerinin daha derinlemesine çalışılmasını haklı çıkarmaktadır33,34.

Bu makaleyle, Brezilya gibi gelişmekte olan ülkelerin bilim camiasında, D. melanogaster'in sunduğu mükemmel genetik araç setini, davranışsal analizler için verimli ve uygun fiyatlı ev yapımı cihazlarla birlikte kullanarak, önemli translasyonel etkiye sahip ilginç biyolojik süreçler hakkında nispeten hızlı temel araştırma verileri üretebileceği konusunda farkındalığı artırmaya yardımcı olabileceğimizi umuyoruz. Klinik araştırmalarda gelecekteki terapötik çalışmaları desteklemek. Bu tür toplumsal ideallerin geliştirilmesi, Drosophilistlere, tıp araştırmacılarına ve biyolojik ve biyomedikal bilimlere büyük fayda sağlayacaktır. En önemlisi, kamu finansmanı insan hastalıklarını anlamak ve tedavi etmek için daha translasyonel olarak uygulanabileceğinden, genel olarak topluma fayda sağlayacaktır.

Burada 3D baskı için sağladığımız protokoller, bir flylab için aparatlar,35'te mevcut olan Prusa I3 DIY modeline dayalı olarak RepRap 3D yazıcı ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Baskı için hammadde olarak 1,75 mm beyaz polilaktik asit (PLA) filamenti (SUNLU), model tasarımı için Tinkercad platformu36 ve STL'den G-Code'a dönüştürme için Repetier-Host yazılımı37'yi kullanıyoruz, yazıcıya koordinat sağlamak için gerekli bir adım. Okuyucunun alternatif ekipman, malzeme ve yazılım kullanmak istemesi durumunda protokollerin daha fazla optimizasyonu gereklidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. 3D model tasarımı

NOT: 3D baskı için iş akışının üç temel adımı vardır: (1) 3D modelleme; (2) modeli dilimleme yazılımına aktarmak; ve (3) doğru filamenti seçme, yazıcıyı yapılandırma ve son olarak yazdırma. Küçük bir sinek şişesi rafı / tepsisini modellemek için temel bir protokol aşağıda gösterilmiştir; Bu raf, yaklaşık 2,5 cm çapında ve 9,8 cm yüksekliğinde standart sinek şişeleri ile kullanılmalıdır. Yeni model tasarımları için Tinkercad yazılımının sağladığı araçlar, kişinin kendi ihtiyacına göre farklı şekil, boyut ve kalınlıkta parçalar oluşturarak üç boyutlu yapıların kolayca ele alınmasını sağlar. 3D baskı alanına ilk kez giren Drosophilistler için, aşağıdaki protokolleri tüm ayrıntılarıyla bile takip etmek hala zor olabilir, bu nedenle en iyi sonuçları elde etmek için yazılımla tanışmanızı şiddetle tavsiye ederiz.

  1. Tinkercad online'da oturum açın38 (Şekil 1A). Platforma ücretsiz olarak erişmek için kişisel bilgilerle önceden kayıt olunması gerekmektedir.
  2. Yeni bir tasarıma başlamak için Yeni Bir Proje Oluştur'a tıklayın ve pencerenin sağ üst köşesinde Projeyi buna göre yeniden adlandırın. Projenin çalışma düzlemine yönlendirilmek için Enter tuşuna basın (Şekil 1B).
  3. Çalışma düzleminin 200 mm x 200 mm'lik doğru boyutlara sahip olup olmadığını, sağ alt köşedeki Izgarayı Düzenle üzerine farenin sol düğmesiyle tıklayarak doğrulayın ( Şekil 1B'deki kırmızı kare). Açılır pencerede (Şekil 1C), "Birimler"in milimetre olduğundan ve "Ön Ayarlar"ın varsayılan olduğundan emin olun. "Genişlik" ve "Uzunluk" alanlarına 200.00 girin ve değişiklikleri kaydetmek için Izgarayı Güncelle'ye tıklayın.
  4. Yapış Izgarasının 1.0 mm olarak ayarlanıp ayarlanmadığını doğrulayın (Şekil 1B'deki kırmızı kare). Değilse, açılır menüye tıklayın ve 1.0 mm'yi seçin.
  5. Sağdaki Temel Şekiller menüsünün altında ( Şekil 1B'deki mavi kare 2), düz bir kutu seçin ve çalışma düzleminin ortasına sürükleyin.
  6. Kenarlarını ve köşelerini görmek için farenin sol tuşuyla çalışma düzlemindeki kutunun herhangi bir yerine tıklayın. Kutu boyutlarını ( Şekil 1D'deki kırmızı kareler) göstermek için herhangi bir köşeye (daha sonra kırmızıya dönecektir) tıklayın. Her bir boyuta farenin sol tuşuyla tıklayın ve uzunluk (L) için 130 mm, genişlik (W) için 130 mm ve yükseklik (H) için 40 mm yazın. Kutuyu çalışma düzleminin ortasına sürükleyerek yeniden ortalayın.
  7. Aracın üzerine tıklayın Cetvel Ekranın sağ üst köşesinde ( Şekil 1E'de kırmızı kare 1). Üç boyutlu bir Kartezyen koordinat sisteminin başlangıç noktasını (x = 0, y = 0, z = 0) ayarlamak için Şekil 1E'de (kırmızı kare 2) gösterildiği gibi hemen kutunun sol alt köşesine tıklayın. Seçilen tepe noktası ile koordinat başlangıç noktası arasındaki mesafenin şimdi gösterileceğini unutmayın ( Şekil 1F'deki kırmızı kareler), burada "A", "B" ve "C" sırasıyla x, y ve z eksenlerine olan mesafeyi temsil eder (bu durumda sıfır olmalıdır).
  8. Ardından, sağdaki Temel Şekiller menüsünden ( Şekil 1B'deki mavi kare 2) boş bir (delik) kutu seçin ve çalışma düzlemine sürükleyin. Boyutlarını 30 (U) x 30 (G) x 40 (Y) mm olarak ayarlayın ve boş kutunun sağ alt köşesindeki yeşil ok ucunun yanındaki metin kutusuna "2.00" yazarak çalışma düzleminden 1 mm yükseltin ( Şekil 1G'deki kırmızı kare). Kutunun sol alt köşesindeki yeşil okların yanındaki metin kutularına "2.00" yazarak boş kutuyu katı kutunun içine x,y koordinatı başlangıç noktasından 2 mm uzağa yerleştirin ( Şekil 1H'deki kırmızı kareler; Şekil 1G ile karşılaştırın).
  9. Boş kutu seçili durumdayken, "çoğalt" komutunu dağıtmak ve tam olarak aynı boyutlarda yeni bir boş kutu oluşturmak için klavyedeki CtrL+D tuşlarına basın. Y ekseni boyunca yeşil okun yanındaki metin kutusuna "34.00" ve kalan iki yeşil okun yanındaki metin kutularına "2.00" yazarak yeni boş kutuyu katı kutunun içine, ilk boş kutunun yanına yerleştirin ( Şekil 1I'deki kırmızı kareler).
  10. Koordinat başlangıç noktasından doğru mesafeleri ayarlayarak, tüm katı kutu birbirinden 2 mm aralıklı boş kutularla dolana kadar bu adımı tekrarlayın (Şekil 1J).
  11. Farenin sol tuşuyla tıklayarak ve tüm alana sürükleyerek tüm kutuları (katı ve boş olanlar) seçin. "group" komutunu dağıtmak için klavyedeki CtrL + G tuşlarına basın ve sinek şişeleri için 16 boş alana sahip tek bir kutu oluşturun (Şekil 1K). Bu, flakon rafının son tasarımıdır.
  12. Tinkercad penceresinin sağ üst köşesindeki Dışa Aktar'a tıklayın. Görüntülenen pencere kutusunda (Şekil 1L), Dahil Et'in yanındaki Tasarımdaki her şey'i seçin ve . Dosya türü olarak 3D Baskı için altında STL. Tasarım dosyası için uygun bir ad seçin ve bilgisayarda uygun bir yere kaydedin.

2. 3D baskı

NOT: Bu bölümde, Adım 1'de oluşturulan STL dosyasının nasıl kullanılacağına ve 3D yazıcıya yazdırma talimatlarını içeren G-Code dosyasına nasıl dönüştürüleceğine ilişkin talimatlar sunuyoruz. Bu, Repetier-Host yazılımını kullandığımız dilimleme işlemidir.

  1. Ek Dosya 1'i indirin ve bilgisayarda uygun bir yere kaydedin. Bu, aşağıda kullanılacak yazıcı yapılandırmalarını içeren bir .rcp dosyasıdır. .rcp dosya türü hakkında daha fazla bilgi almak için lütfen39'u ziyaret edin.
  2. Bilgisayarda zaten kurulu olması gereken Repetier-Host yazılımını37'deki talimatları izleyerek açın. Protokol 1'de oluşturulan bilgisayarda STL dosyasını açmak için klavyedeki CtrL+O tuşlarına basın.
  3. Açıldıktan sonra, tasarlanan flakon rafına tıklayın ve ekranın sağ tarafındaki düzenleme menüsünü açmak için klavyedeki R tuşuna basın (Şekil 1A'daki kırmızı kare 2). Nesne Yerleştirme sekmesinde, Şekil 2A'da kırmızı kare 2 ile gösterilen Nesneyi Ortala düğmesine tıklayarak nesneyi yazdırma tablosunda ortalayın.
  4. Object Placement (Nesne Yerleşimi) sekmesinin yanındaki Slicer (Şekil 2B'de kırmızı kare 1) sekmesine tıklayın ve ardından aşağıdaki Configuration (Şekil 2B'de kırmızı kare 2) düğmesine tıklayın. Solda, hız, katman kalınlığı ve tutucular gibi yazıcı parametrelerinin tanımlanabileceği yeni bir pencerenin açılacağını unutmayın (aşağıdaki Tartışmada daha fazla ayrıntıya bakın).
  5. İçe Aktar düğmesine tıklayın (Şekil 2E'deki kırmızı kare 3), dosyalardan Ek Dosya 1'i seçin ve Enter'a basın. Bu .rcp dosyasının (adım 2.1'de indirilen), bu flakon rafı için optimize ettiğimiz yazıcının otomatik yapılandırması için parametreler sağladığını unutmayın.
  6. Yazdırma parametrelerini yapılandırmayı tamamlamak için, sağdaki menüde (Şekil 2E'de kırmızı kare 4) Destek Türü için Yok'u seçin, çünkü bu parçanın yazdırılması bükülmeyi veya diğer deformasyonları önlemek için bir destek gerektirmez. Dolgu Yoğunluğu'nda (Şekil 2E'deki kırmızı kare 5), katı bir yapı oluşturmak için %20'yi seçin (aşağıdaki Tartışmada bu parametreler hakkında daha fazla ayrıntıya bakın).
  7. Dilimleme programını çalıştırmak ve yazıcının parçayı yazdırması için gerekli bilgileri içeren G Kodunu oluşturmak için ekranın sağ üst köşesindeki CuraEngine ile Dilimle'ye tıklayın. Sağdaki menüde (Dilimleyici sekmesinin yanında) bulunan Baskı Önizleme sekmesi altında, yazdırma işinin tamamlanması için gereken süre ve malzeme miktarı hakkındaki bilgilerin daha sonra gösterileceğini unutmayın (Şekil 2F'deki kırmızı kare 1).
  8. G-Code dosyasını bir SD karta kaydetmek için SD Yazdırma için Kaydet'e tıklayın ( Şekil 2F'de kırmızı kare 2). G-Code'un, yazıcının düzgün çalışması için tasarlanan parçanın katmanlar halinde dilimlenmiş 3D koordinatlarını içerdiğini unutmayın.
  9. SD kartı RepRap 3D yazıcıya takın ve ardından SD karttan yazdırmayı seçmek için yazıcı ekranında görüntülenen bilgileri izleyin.
  10. Flakon rafının G Kodu dosyasını seçin. Yazıcının otomatik olarak ısınacağını ve tasarlanan parçayı yazdırmaya başlayacağını ve bunun birkaç saat süreceğini unutmayın. Raf (Şekil 3A), yazdırma işi tamamlandıktan hemen sonra kullanıma hazır olmalıdır.

3. Davranışsal analiz cihazları

NOT: Protokol 1 ve 2'de açıklanan adımlar, gerekli laboratuvar ekipmanlarının birkaçını yazdırmak için uygun ayarlamalarla tekrarlanabilir. Bununla birlikte, Tinkercad'in yeni başlayan kullanıcıları için yeni parçalar tasarlamanın zor ve zaman alıcı olabileceğinin farkındayız, bu nedenle tüm modellerin nasıl tasarlanacağına dair adım adım protokoller sağlamak yerine, STL dosyaları olarak oluşturduğumuz birkaç tasarım modelini indirmek için kullanılabilir hale getiriyoruz (bkz. Ek Dosyalar 2-11).

  1. Küçük bir huni modeli için Ek Dosya 2'yi indirin (Şekil 3B), sineklerin kaçmak için bu kapların iç duvarlarına sürünmesini önleyerek yetişkin sinekleri yeni şişelere veya şişelere aktarmaya yardımcı olmak için flylabs'ta rutin olarak kullanılır.
  2. Etilen-vinil asetat köpüğü veya sinekleri taze yapılmış yiyeceklerle yeni kaplara atarken üzerine cam şişelerin veya şişelerin vurulabileceği kalın bir pamuklu paspas tutabilen bir kılavuz çekme matı desteği (Şekil 3C) için Ek Dosya 3'ü indirin.
  3. Stalker adını verdiğimiz bir kamera standı modeli için Ek Dosya 4 ve Ek Dosya 5'i indirin (Şekil 3D).
    NOT: Cihaz, herhangi bir kameranın (profesyonel, web kameraları, cep telefonları vb.), larva veya yetişkin sinekler içeren bir Petri kabının görüntülenebileceği veya video kaydedilebileceği bir tabanın üzerine yerleştirilmesine izin verir. Stalker, Petri kabından her zaman aynı mesafede yatay olarak gerçekleşen hayvan davranışlarının görüntülenmesine izin verir, bu da örneğin kayıtların farklı günlerde yapılması gerekiyorsa veya kameranın kayıtlar arasında başka bir amaç için kullanılması gerekiyorsa deneysel ölçümlere değişkenlik girmesini önler. Cihaz uygun şekilde modülerdir ve tabanı ve üst kısmı Ek Dosya 4'ten ve yanları Ek Dosya 5'ten yazdırdıktan sonra kolayca monte edilebilir. Kalıcı bir işaretleyici kullanılarak vurgulanabilen tabandaki 1cm'lik 2 kareler, tek tek hayvanların kat ettiği mesafeyi izlemeye yardımcı olur. Aparatı (en azından tabanı) beyaz filament kullanarak yazdırın, böylece izleme yazılımının her bir sineği tanımlaması için arka plan ile hayvanlar arasında yeterli kontrast olur.
  4. Bir seferde on ayrı çiftleşme çiftinin video kayıtlarını kolaylaştıracak şekilde düzenlenmiş on kur yapma ve çiftleşme alanına (oda) sahip olan Fly Motel'in (Şekil 3E) yazdırılabilir tasarımı için Ek Dosya 6'yı indirin. Fly Motel'in, davranışsal çalışmalarda kullanımı için ayrıntılı açıklamanın bulunduğu40 yılında yayınlanan cihaza dayandığını unutmayın. 3D baskılı parçalara ek olarak, aparat, monte edilen cihazı stabilize etmek için üst parçayı alt kısma sabitlemek için 12 vida (3 x 8 mm), bir akrilik plaka (60 x 60 x 3 mm) ve bir fermuar gerektirir. Fly Motel'in yapısı daha karmaşık olduğundan, gerekli tüm parçaların ve bir tornavidanın mevcut olduğu göz önüne alındığında, nasıl doğru bir şekilde monte edileceğine dair bir eğitim videosu (Ek Dosya 7) da sağlıyoruz.
  5. Yetişkin sineklerin kullanıldığı hafıza tahlilleri için kullanılan bir T-Labirent modeli için Ek Dosya 8'i indirin (Şekil 3F). T-Labirent'in sineklerin itici koku uyaranlarını fototropik davranışlarıyla ilişkilendirmesini sağlamak için nasıl kullanıldığına dair ayrıntılı bir açıklama orijinal yayın41'de bulunur. Cihaz ayrıca, herhangi bir laboratuvarda yaygın olarak bulunan ve merkezi parçanın her iki tarafındaki 2 cm genişliğindeki dairesel açıklıklara tutturulmuş iki yarı saydam 15 mL konik tüpten yararlanır. T-Maze'in yazdırılmasının bir destek gerektirdiğini unutmayın ( Şekil 2'deki açıklamada daha fazla ayrıntıya bakın). Yukarıdaki 4-2.1 adımlarını izledikten sonra Destek Türü ( Şekil 2E'deki kırmızı kare 2.6) için "Her Yerde"yi seçin.
  6. Hızlı yinelemeli negatif jeotaksi (RING) tahlilleri için aparat versiyonumuzun yazdırılabilir parçalarının tasarımı için Ek Dosya 9 ve Ek Dosya 10'u indirin (Şekil 3G), aynı anda birkaç genotipe veya çevresel koşullara sahip yetişkin sineklerle tırmanma testleri gerçekleştirmek için kullanılır, daha standartlaştırılmış ve daha yüksek verimli bir şekilde sonuçlar üretir42. RING aparatı da modülerdir ve 3D baskılı parçalara ek olarak, çevrimiçi olarak veya bir hırdavatçıdan düşük maliyetle kolayca satın alınabilecek başka parçalar da gerektirir: iki Φ8 x 300 mm doğrultulmuş mil, dört Φ8 mm lineer yatak, lastik bantlar (veya bir ip parçası), taban için 240 x 60 x 20 mm ahşap parçası, ve basılı parçaları ahşap tabana sabitlemek için sekiz ahşap vida (8 mm). Tüm parçalar yazdırıldıktan veya satın alındıktan sonra cihazın nasıl monte edileceğine ilişkin talimatlar için Ek Dosya 11'i indirin. RING cihazının nasıl kullanılacağına dair ayrıntılı bir açıklama orijinal yayında42 bulunmaktadır.

4. Larva hareketlilik testi

NOT: Aslen Nichols ve ark.42'ye dayanan bu protokolü, AOX ekspresyonunun soğuk stres altında Drosophila gelişimi üzerindeki etkilerini incelemek için optimize ettik. Saari ve ark.34'e göre, AOX eksprese eden ve kontrol larvalarının örnekleri olarak sırasıyla kullanılan 3xtubAOX25 ve w1118 hatları, 12 ° C'de standart diyet24'te kültürlendi. Bu protokolü, herhangi bir çevresel ilgi koşulu altında kültürlenen herhangi bir genetik durumdaki larva örneklerinin hareketliliğini analiz etmek için öneriyoruz.

  1. Eşdeğer miktarda agarı deiyonize suda kaynatarak, Φ90 X 15 mm Petri kaplarına dökerek ve oda sıcaklığında katılaşmalarına izin vererek %2'lik agar plakaları hazırlayın. Her biri 20 mL nihai hacme sahip plakalar için 0.4 g agar kullanın.
  2. Bir çift yuvarlak uçlu forseps veya bir fırça kullanarak kültür şişelerinin/şişelerinin yanından dolaşan L3 larvalarını dikkatlice toplayın ve bireyleri vücutlarına bağlı yiyecek parçacıklarını durulamak için 10 saniyeden daha az bir süre deiyonize su içeren Φ90 x 15 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
  3. Tek tek larvaları agarozlu yemeklere aktarın ve hayvanların alışması için 5 dakika bekleyin.
  4. Tek tek larvaları içeren tabakları bir grafik kağıdının (0,2cm2 ızgara) üzerine yerleştirin ve agarın üzerinde hareket ederken hayvanın geçtiği çizgilerin sayısını 1 dakika boyunca sayın. Geçilen her çizgi 2 mm'lik bir mesafeyi temsil eder. Teknik kopyalar elde etmek için prosedürü aynı kişiyle 10-15 kez tekrarlayın.
  5. Aynı hattın biyolojik kopyalarını elde etmek için farklı zamanlarda kültürlenmiş farklı tüplerden/şişelerden en az 8-10 kişi ile adım 4.4'ü tekrarlayın.
  6. 4.4 ve 4.5 numaralı adımları tekrarlayarak diğer uçuş hattı için (veya analiz etmek istediği kadar çok hat için) veri elde edin.
  7. Adım 4.4-4.6'da kullanılan aynı bireysel larvalar, tek bir larva ile agar kaplarını bir stereomikroskop altına yerleştirerek ve vücut duvarının peristaltik kasılmalarının sayısını 1 dakika boyunca sayarak vücut hareketi hakkında ek veriler elde etmek için kullanılabilir. Analiz edilen sinek hatları arasındaki ortalama hareketlilik tahmini için teknik ve biyolojik kopyalar elde edin.
  8. Bu larva hareketlilik parametrelerinin değerlerinin ilgilenilen hatlar arasında farklı olma olasılığını hesaplamak için istatistiksel testi uygulayın. Burada sadece iki satırdan elde edilen verileri karşılaştırdığımız için, bir Öğrenci t testi uygulanabilir.

5. Larva homojenatları kullanan mitokondriyal respirometri

NOT: Aşağıdaki protokol, AOX eksprese eden hat 3xtubAOX'un larva homojenatlarından ve 12 ° C'de kültürlenmiş kontrol w1118'den mitokondriyal oksijen tüketimini ölçmek için optimize edilmiştir, ancak aynı zamanda herhangi bir genetik ve çevresel koşulun larva örnekleri için kullanılmasını da öneririz. Bu tür deneylerin yürütülmesinin, bu makalede sunduğumuz diğer tüm protokollerin aksine, "ev yapımı" bir flylab için "uygun fiyatlı" bir hedef olarak dahil edilmemesi gerektiğinin farkındayız, çünkü bir laboratuvarın yüksek çözünürlüklü bir oksigraf elde etmesi için önemli bir ilk yatırım yapılması gerekmektedir. Protokol, Oxygraph-2k (O2k) ve Oroboros Instruments'ın DatLab yazılımı ile birlikte kullanılacaktır, bu nedenle okuyucunun alternatif bir ekipman kullanmak istemesi durumunda daha fazla optimizasyon gereklidir.

  1. O2k'yi açın ve oksigrafa bağlı bilgisayarda DatLab yazılımını başlatın. Tahlil odalarının içindeki manyetik çubuklar otomatik olarak karışmaya başlamalıdır. Etanol depolama çözeltisini odalardan çıkarın.
  2. Hazneleri en az 3 kez% 100 etanol ve 3 kez ultra saf su ile yıkayın.
  3. DatLab'da O2k Kontrolü penceresi otomatik olarak açılacaktır. Blok sıcaklığı [°C] alanına 12 °C (veya 2-47 °C aralığında tercih edilen sıcaklığı) girin ve Tamam'a basın.
  4. Ardından ikinci bir pencere olan Denemeyi Düzenle otomatik olarak açılacaktır. Örnek alanlarına, A ve B odalarına nelerin ekleneceğine göre örnek adlarını girin ve Kaydet'e basın.
  5. Her odaya 1800 μL tahlil tamponu (120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM Hepes, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2,% 2 BSA, pH 7.4) ekleyin ve kısmen kapatın, yine de dış hava ile oksijen alışverişine izin verin. Oksijen konsantrasyonunun ve oksijen akışı sinyallerinin en az 10 dakika boyunca minimum dalgalanmalar göstererek stabilize olmasına izin verin. Bu adım, ekipmanın deney günü dış hava ile kalibrasyonunu sağlayacaktır (deneysel kalibrasyonlar hakkında daha fazla ayrıntı için aşağıdaki adım 6.3 ve 6.4'e bakın).
  6. Hava kalibrasyon adımı sırasında, bir çift forseps veya küçük bir boya fırçası kullanarak uygun genotipe sahip 20 dolaşan larvayı kültür tüplerinden/şişelerinden dikkatlice toplayarak numune hazırlamalarını başlatın.
  7. Her larvayı deiyonize su veya 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 ve 2 mM KH2PO4) ile hızlı ama iyice durulayın ve 500 μL buz gibi soğuk izolasyon tamponu (250 mM sükroz, 5 mM Tris HCl, 2 mM EGTA, pH 7.4)
  8. Tüm larvaları 5 vuruşla homojenize edin ve homojenatı buz üzerinde 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne dökün.
  9. Cam homojenizatöre 300 μL izolasyon tamponu ekleyin, kalan larva dokularını 3 vuruşla daha fazla yumuşatın ve homojenatı tekrar buz üzerindeki aynı mikrosantrifüj tüpüne dökün.
  10. Cam homojenizatöre 200 μL izolasyon tamponu ekleyin, kalan larva dokularını 2 vuruşla daha fazla masere edin ve homojenatı tekrar buz üzerindeki aynı mikrosantrifüj tüpüne dökün.
  11. Tüpü iki kez nazikçe ters çevirerek son homojenatı (~1 mL) karıştırın ve ikinci numune işlenene kadar buz üzerinde tutun.
  12. Diğer genotipin larva homojenatını elde etmek için 5.6-5.11 adımlarını tekrarlayın.
  13. Oksigraf odaları A ve B'yi açın ve her bir homojenatın 200 μL'sini, bu noktada tam olarak 12 °C'de olması gereken her odadaki tahlil tamponuna aktarın. Odaları tamamen kapatın ve oksijen konsantrasyonu ve oksijen akısı sinyallerinin yaklaşık 10 dakika stabilize olmasına izin verin.
  14. Her odaya 5 μL 2 μL 2 M piruvat, 2 M prolin (odalardaki nihai konsantrasyon = her biri 5 mM) ve 7,5 μL 0,4 M malat (1,5 mM) çözeltisi ekleyerek oksijen tüketimi ölçümlerini başlatın. Sinyal stabilizasyonu için en az 5 dakika bekleyin. Bu noktada, mitokondrinin trikarboksilik asit (TCA) döngüsü reaksiyonlarını başlatmak için oksitlenebilir substratlarla yükleneceğini unutmayın. Oksijen tüketimi sinyalindeki herhangi bir artış, ayrılma proteinlerinin işlevlerinden (veya diğer ayrılma olaylarından dolayı) kaynaklanabilir ve genel ayrılmamış solunumu hesaplamak için kullanılabilir (adenilat yokluğunda sızıntı solunumu, LN- ayrıntılar için Temsili Sonuçlara bakın).
  15. Her odaya 4 μL 0,5 M ADP (1 mM) çözeltisi ekleyin ve sinyal stabilizasyonu için en az 5 dakika bekleyin. Oksidatif fosforilatif (OXPHOS) solunumu temsil eden oksijen tüketim sinyalinde genellikle hemen bir artış gözlenir. Bu OXPHOS solunumunun büyük çoğunluğu kompleks I (CI) tarafından yönlendirilir.
  16. CIII'yi inhibe etmek için her odaya 2 μL 0.05 M antimisin A (0.05 mM) çözeltisi ekleyin ve sinyal stabilizasyonu için en az 5 dakika bekleyin. w1118 kontrol numunesi için oksijen tüketim sinyalinde piruvat, prolin ve malat ilavesinden önce görülen bazal seviyelere kadar bir azalma gözlenmelidir. AOX eksprese eden larvalardan mitokondriyal solunum, elektronlar artık AOX'e yönlendirilebildiğinden, antimisin-A'ya kısmen dirençli olacaktır. Toplam OXPHOS solunumunun yaklaşık% 40'ı CIII inhibisyonundan sonra kalmalıdır ve bunların tümü yalnızca AOX tarafından desteklenmelidir.
  17. AOX'i inhibe etmek için her odaya 4 μL 0.1 M propil-gallat (0.2 mM) çözeltisi ekleyin ve sinyal stabilizasyonu için en az 15 dakika bekleyin. AOX eksprese eden larva örneklerindeki oksijen tüketim seviyeleri artık piruvat, prolin ve malat ilavesinden önce görülen bazal seviyelere düşmelidir. Bu azalma, gözlenen antimisin-A'ya dirençli solunumun AOX fonksiyonuna bağlı olduğunu kanıtlamaktadır.
  18. CI'yi inhibe etmek için her odaya 1 μL 0.01 M rotenon (0.005 mM) ekleyin ve mitokondriyal solunumdan bağımsız olarak numunenin oksijen tüketim sinyalini elde etmek için sinyal stabilizasyonu için en az 5 dakika bekleyin. Bu sinyal genellikle piruvat, prolin ve malat ilavesinden önce gözlemlenen kadar düşüktür.
  19. Deneyi kaydedin ve DatLab yazılımını kapatın.

6. Mitokondriyal respirometri veri işleme

NOT: Oksijen tüketim değerleri, belirli bir süre içindeki oksijen akışı sinyallerinin ortalaması olarak elde edilir ve numunedeki mg toplam protein başına saniyede tüketilen pmol O2 olarak ifade edilir. Değerler ilk olarak, deney sıcaklığına (hava doygunluğu olarak adlandırılır) ve daha önce her bir odada Na2S2O4 ilavesiyle belirlenen minimum oksijen konsantrasyonuna dayalı olarak, deney gününde tahlil tamponunda bulunan maksimum oksijen konsantrasyonuna karşı referans alınır (bkz. 43 üreticinin sıfır oksijen kalibrasyonu elde etme yönergeleri için). Değerler ayrıca, her bir odanın tahlil tamponuna eklenen larva homojenatlarındaki toplam protein miktarı ile de normalleştirilir.

  1. Bradford yöntemini44 kullanarak her numunenin toplam protein konsantrasyonunu belirleyin. Kaydedilen deneyi DatLab yazılımında yeniden açın, üst menüde Deney'e ve ardından Düzenle'ye basın. Açılan pencerede, Birim bölümünde mg'ı seçin ve Miktar bölümünde, her odaya eklenen numunenin 200 μL'sinde bulunan protein miktarını girin. Konsantrasyon, 2 mL'lik toplam oda hacmi dikkate alınarak yazılım tarafından otomatik olarak hesaplanacaktır. Kaydet düğmesine basın.
  2. Üst menüde Grafik'e ve ardından Grafikleri seç'e basın. Açılan pencerede, her iki grafik için de kütle başına akı'yı seçin (sırasıyla A ve B odalarına atıfta bulunan 1 ve 2). Tamam'a basın. Deneysel sonuç şimdi numunelerin protein konsantrasyonu (pmol O2 / s / mg toplam protein) ile normalleştirilmiştir.
  3. Ana deney sonuç sayfasının her grafiğinin (1 ve 2) sağ üst köşesinde, O2 Konsantrasyonu'na tıklayın. X ekseni boyunca, numunelerin odalara eklenmesinden önce, oksijen konsantrasyonunun ve akı sinyallerinin çok kararlı olduğu bir zaman aralığı belirleyin.
    1. Bilgisayarın klavyesindeki Shift tuşunu basılı tutun, seçilen ilk zamana farenin sol tuşuyla tıklayın, istediğiniz bölgeyi seçmek için imleci zaman ekseni boyunca sürükleyin ve fare düğmesini bırakın. Bu yordamı grafiklerin her biri için ayrı ayrı yapın.
    2. Grafiklerin altındaki seçili alanların mavi çubuklarına çift tıklayın ve bunların oksijen hava doygunluğunu hesaplamak için kullanılan seçili bölgeler olduğunu belirtmek için "hava" yazın.
  4. Üst menü çubuğundaki Kalibrasyon'a tıklayın ve A odasını kalibre etmek için A: Oksijen, O2'yi seçin. Açılan pencerede, O2 Calib'in seçili olduğunu doğrulayın (sarı renk).
    1. Sıfır kalibrasyon için, Dosyadan kopyala'ya tıklayın ve daha önce gerçekleştirilen sıfır oksijen kalibrasyonunu içeren dosyayı seçin (üreticinin yönergeleri için 43'e bakın).
    2. Hava kalibrasyonu için, İşareti Seç sütununda havayı seçin. Ayarla'ya tıklayın ve panoya kopyalayın.
  5. Üst menü çubuğundaki Kalibrasyon'a tıklayın, B: Oksijen, O2'yi seçin ve B odasını kalibre etmek için 6.4 adımını tekrarlayın.
  6. Ana deney sonuç sayfasının her grafiğinin (1 ve 2) sağ üst köşesinde, kütle başına O2 akısına tıklayın. Klavyedeki Shift tuşunu basılı tutarak, farenin sol tuşuyla tıklayarak ve imleci zaman ekseni boyunca sürükleyerek oksijen tüketimi sinyalinin istenen kararlı bölgelerini seçin. Pirüvat/prolin/malat ve ADP ilaveleri arasında seçilen stabil bölgeler LN'yi temsil eder; ADP ve antimisin A, OXPHOS arasında; antimisin A ve propil gallat arasında (CIII inhibisyonu üzerine), antimisin A'ya dirençli solunum; propil gallat ve rotenon arasında (CIII + AOX inhibisyonu üzerine), rezidüel solunum; rotenondan sonra (CI + CIII + AOX inhibisyonu üzerine), rezidüel mitokondriyal olmayan solunum. Grafiklerin altındaki seçili alanların kırmızı çubuklarına çift tıklayın ve uygun etiketleri girin.
  7. Üst menü çubuğundaki İşaretler'e ve ardından İstatistikler'e tıklayın. Açılan pencerenin Göster sekmesinde, kütle başına O2 akı dışındaki tüm seçeneklerin işaretini kaldırın. Aynı pencerenin Seç sekmesinde, ilk numunenin solunum verilerini elde etmek için A odasını seçin. Panoya kopyala'ya tıklayın ve verileri bir elektronik tabloya yapıştırın. B odasındaki ikinci numune için verileri elde etmek için prosedürü tekrarlayın.
  8. Bir elektronik tabloda, tüm solunum değerlerini artık mitokondriyal olmayan solunumla (rotenon ilavesinden sonraki veriler) çıkarın. Birden çok deneysel yinelemeden ortalamaları hesaplayın ve verileri tercih edilen şekilde çizin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Protokol 1 ve 2'deki adımları izleyerek, basit bir sinek şişesi rafı tasarlayabilmeli ve 3D yazıcı için koordinatlar oluşturmak üzere model STL dosyasını dilimleme programından geçirebilmelidir. Şekil 3A, tasarımının yanında modelin basılı bir birimini göstermektedir. Ayrıca, 1. adımın, laboratuvar için kullanışlı cihazlar oluşturmak için Tinkercad platformunda bulunan temel şekilleri kullanması için temel becerileri sağlayabileceğini umuyoruz. Bununla birlikte, bu becerilerin geliştirilmesi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada sağlanan 3D baskı protokolleri ve STL dosyaları, yeni bir flylab'ın kurulumunu kolaylaştırmayı veya "ev yapımı" ekipman kullanarak mevcut bir Drosophila davranış tesisindeki aparatların repertuarını artırmayı amaçlamaktadır. 3D baskı stratejisi, Drosophila'yı insan biyolojisini incelemek için model organizma olarak kullanan araştırmaların yeterince temsil edilmediği ve özel ekipmanın maliyetli olduğu Brezilya gibi gelişmekte olan ülkelerde özellikle yararlı olabi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Makalenin İngilizce editörlüğü için Emily A. McKinney'e teşekkür ederiz. GSG, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, hibe numarası 141001/2019-4) tarafından bir burs ile desteklenmiştir. M.T.O., Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo'dan (FAPESP, hibe numaraları 2014/02253-6 ve 2017/04372-0) ve CNPq'dan (hibe numaraları 424562/2018-9 ve 306974/2017-7) fon sağlamak ister. C.A.C.-L. Universidade do Oeste Paulista'nın iç mali desteğini kabul etmek ister. Genetiği değiştirilmiş Drosophila hatları ile yapılan çalışmalar, 001/2014 ve 006/2014 protokolleri uyarınca Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal Yerel Biyogüvenlik Komitesi (CIBio) tarafından ve 36343/2017/SEI-MCTIC, 01200.706019/2016-45 ve 5488/2017 protokolleri uyarınca Ulusal Biyogüvenlik Teknik Komitesi (CTNBio) tarafından yetkilendirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3D Yazıcı RapRepPrusa I3 DIY moduna dayalı popüler bir 3D yazıcı,
https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisited/ 3xtubAOX sinek hattındaHowy Jacobs&akut; s laboratuarı, Tampere ÜniversitesiDrosophila hattı, yapısal &alfa;-tubulin promotörü kontrolü altında C. intestinalis'ten AOX genini ifade eder. Bu yapının 5 ve 6 kopyası, sırasıyla homo/hemizigozitede erkek ve dişilerde, X, 2 ve 3.
Akrilik plaka60 x 60 x 3 mm
ADPSigma-AldrichA2754Adenozin 5&asal;-difosfat sodyum sal (CAS numarası 20398-34-9); ≥ 95%; molekül ağırlığı = 427.20 g/mol; 50 mg / ml'de suda çözünürlük
Antimisin-ASigma-AldrichA8674Streptomyces sp.'den Antimisin A (CAS numarası 1397-94-0); moleküler ağırlık ~ 548.63 g/mol; 50 mg / mL'de% 95 etanol içinde çözünürlük
AgarKasvK25-611001Bakteriyolojik kullanım için; toz; katılaştırıcı ajan (12-20 g/L)
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-AldrichA7030Isı şoku fraksiyonu, proteaz içermez, yağ asidi içermez, esasen globulin içermez (CAS numarası 9048-46-8); pH 7; ≥ 98%; suda çözünürlük 40g / ml
Deiyonize su
EGTASigma-AldrichE4378Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ', N'-tetraasetik asit (CAS numarası 67-42-5); ≥ 97%; moleküler ağırlık = 380,35 g/mol
Etanol %
Etilen-vinil asetat köpükKalın pamuk parçalarıyla değiştirilebilir
Grafik kağıdı0,2 cm2 ızgara
HepesSigma-AldrichH40344- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (CAS numarası 7365-45-9), BiyoPerformans Sertifikalı; ≥ %99,5 (titrasyon), hücre kültürü test edilmiş; Molekül ağırlığı =238,30 g/mol
HomojenizatörSartoriusEl camı homojenizatör (S), 1 mL; borosilikat camdan yapılmış bir silindir ve piston S'den oluşur; genellikle basit numune hazırlama için kullanılır, örneğin doku numunelerinin ezilmesi.
KClAmresco0395-2Potasyum klorür (CAS numarası 7447-40-7); ≥ 99,0%; moleküler ağırlık = 74.55g/mol
KH2PO4Sigma-AldrichP5379Potasyum fosfat monobazik (CAS numarası 7778-77-0); ReagentPlus; Molekül ağırlığı = 136.09g/mol
Lineer rulmanlar (LM8UU)8 mm, herhangi bir marka
MalateSigma-AldrichM1000L-(-)-Malik asit (CAS numarası 97-67-6); ≥ 95-100%; moleküler ağırlık = 134.09 g/mol), suda çözünürlük: 100 mg/mL. Bir çözeltinin pH'ı yaklaşık 7.0'a ayarlanır.
MgCl2Amresco0288-1KGMagnezyum klorür, hekzahidrat (CAS numarası 7791-18-6); % 99 -% 102; moleküler ağırlık = 203.3 g / mol
Mikrosantrifüj tüpleri1.5 mL; Her 100 mikroda bir mezun oldu; L, otoklavlanabilir
Na2HPO4Amresco0348-1KGSodyum fosfat, dibazik, heptahidrat (CAS numarası 7782-85-6); % 98-102; moleküler ağırlık = 268.07 g / mol
NaClHoneywell31434-1KGSodyum klorür (CAS numarası 7647-14-5); ≥ 99,5%; Molekül ağırlığı 58,44g/mol. Sadece laboratuvar kullanımı içindir.
Oxigraph-O2kOroboros10000-02Serisi D-G; O2k-Core: Paslanmaz çelik gövdeli O2k Ana Ünite, O2k-Montaj Kiti, iki OroboPOS (polarografik oksijen sensörü) ve OroboPOS Servis Kiti, DatLab yazılımı, ISS-Entegre Aspirasyon Sistemi ve O2k-Titrasyon Setini içerir.
Kalıcı işaretleyiciTercihen siyah
Petri kapları90 X 15 mm tabaklar; bakteriyolojik kültür için yaygın olarak kullanılır
PLA 3D Baskı FilamentiQuantum3D Baskıhttp://quantum3dprinting.com/Yüksek kaliteli polilatik asit filament (PLA), şiddetle tavsiye edilir, (1.0 kg Rulo), herhangi bir marka
ProlineSigma-AldrichP0380L-Prolin (CAS numarası 147-85-3); toz; 99%; Molekül ağırlığı = 115,13 g/mol
Propil gallatSigma-AldrichP3130Propil gallat (CAS numarası 121-79-9); toz; ≥ 98%; Molekül ağırlığı = 212.2 0g/mol; etanolde 50 mg / ml
çözünürlük PirüvatSigma-AldrichP2256Sodyum piruvat (CAS numarası 113-24-6), ≥ 99%; molekül ağırlığı = 110.04 g/mol; 100 mg / mL'de suda çözünürlük
Doğrultulmuş şaftlar8 x 300 mm, herhangi bir marka
RotenoneSigma-AldrichR8875Rotetone (CAS numarası 83-79-4); ≥ %95, molekül ağırlığı 394,42 g/mol
Lastik bantlarBir ip parçasıyla değiştirilebilir
TornavidaBazı 3D baskılı cihazları monte etmek için
ScreewsM3 x 8 mm
SD KartEn az 32Mb boyutunda; genellikle 3D yazıcılarla sağlanır
Yazılım Repetier Ana BilgisayarıHot-World GmbH & Co. KGhttps://www.repetier.com/Mükemmel dilimleme yazılımı, ücretsiz olarak kullanılabilir
Yazılım TinkercadAutodeskhttps://www.tinkercad.com3D model tasarım yazılımı, ücretsiz olarak kullanılabilir
StereomikroskopLeicaM-80Stereomikroskop, zoom 7.5-60X + Leica cls 150 led ışık kaynağı
SükrozMerck107.651.000Mikrobiyoloji kullanımı için sükroz (CAS numarası 57-50-1);
TrisAmersham Biyolojik Bilimler17-1321-01Tris (hidroksimetil)-aminometan (CAS numarası 77-86-1); %99,8-100,1; molekül ağırlığı 121,14 g/mol
Cımbız/forsepsStarkST08710Histolojik cımbız, düz, yuvarlak uç, 12 cm, AISI-410 paslanmaz çelik
w1118 sinek hattıHowy Jacobs&akut; s lab, Tampere Üniversitesi3XtubAOX
Ahşap plaka240 x 60 x 20 mm
Fermuarlı2 x 210 mm, herhangi bir marka
bulunan talimatlar 99,5 için genetik arka plan kontrolü olarak kullanılan Drosophila hattı tayt

Kaynaklar

  1. nobelprize.org. , Available from: http://www.nobelprize.org/prizes/medicine/ (2021).
  2. Drosophila Model Filter. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=%22drosophilia+model%22&filter=datesearch.y_5 (2021).
  3. A Look at Trends in NIHS Model Organism Research Support. , Available from: https://nexus.od.nih.gov/all/2016/07/14/a-look-at-trends-in-nihs-model-organism-research-support/ (2021).
  4. Drosophila. , Available from: https://bv.fapesp.br/pt/metapesquisa/?q=drosophila (2021).
  5. Metapesquisa. , Available from: https://bv.fapesp.br/pt/metapesquisa/ (2021).
  6. Jennings, B. H. Drosophila-a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
  7. Brandt, A., Vilcinskas, A. The Fruit Fly Drosophila melanogaster as a Model for Aging Research. Yellow Biotechnology I. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 135, 63-77 (2013).
  8. Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (149), e59613(2019).
  9. Cheluvappa, R., Scowen, P., Eri, R. Ethics of animal research in human disease remediation, its institutional teaching; and alternatives to animal experimentation. Pharmacology Research and Perspectives. 5 (4), (2017).
  10. Plan Alto.gov. , Available from: http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2007-2010/2008/lei/|11794.htm (2021).
  11. Plan Alto.gov. , Available from: https://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2004-2006/2005/decreto/d5591.htm (2021).
  12. Revistapesquisa.fapesp.br. , Available from: https://revistapesquisa.fapesp.br/en/supply-side-research-constraints/ (2021).
  13. ABC.org.br. , Available from: http://www.abc.org.br/2014/05/08/em-depoimento-a-cell-dario-zamboni-fala-dos-desafios-de-produzir-boa-ciencia-no-brasil/ (2021).
  14. Nascimento, S., Pólvora, A. Maker Cultures and the Prospects for Technological Action. Science and Engineering Ethics. 24 (3), 927-946 (2018).
  15. Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), (2017).
  16. Baden, T., Chagas, A. M., Gage, G., Marzullo, T., Prieto-Godino, L. L., Euler, T. Open Labware: 3-D Printing Your Own Lab Equipment. PLOS Biology. 13 (3), 1002086(2015).
  17. Zhou, B., Tian, R. Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure. Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 3716-3726 (2018).
  18. Hock, D. H., Robinson, D. R. L., Stroud, D. A. Blackout in the powerhouse: Clinical phenotypes associated with defects in the assembly of OXPHOS complexes and the mitoribosome. Biochemical Journal. 477 (21), 4085-4132 (2020).
  19. Juszczuk, I. M., Rychter, A. M. Alternative oxidase in higher plants. Acta Biochimica Polonica. 50 (4), 1257-1271 (2003).
  20. McDonald, A. E. Alternative oxidase: An inter-kingdom perspective on the function and regulation of this broadly distributed "cyanide-resistant" terminal oxidase. Functional Plant Biology. 35 (7), 535-552 (2008).
  21. McDonald, A. E., Vanlerberghe, G. C., Staples, J. F. Alternative oxidase in animals: Unique characteristics and taxonomic distribution. Journal of Experimental Biology. 212, 2627-2634 (2009).
  22. McDonald, A., Vanlerberghe, G. Branched Mitochondrial Electron Transport in the Animalia: Presence of Alternative Oxidase in Several Animal Phyla. IUBMB Life (International Union of Biochemistry and Molecular Biology: Life. 56 (6), 333-341 (2004).
  23. McDonald, A. E., Costa, J. H., Nobre, T., De Melo, D. F., Arnholdt-Schmitt, B. Evolution of AOX genes across kingdoms and the challenge of classification. Alternative Respiratory Pathways in Higher Plants. , 267-272 (2015).
  24. Fernandez-Ayala, D. J. M., et al. Expression of the Ciona intestinalis Alternative Oxidase (AOX) in Drosophila Complements Defects in Mitochondrial Oxidative Phosphorylation. Cell Metabolism. 9 (5), 449-460 (2009).
  25. Kemppainen, K. K., et al. Expression of alternative oxidase in Drosophila ameliorates diverse phenotypes due to cytochrome oxidase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (8), 2078-2093 (2014).
  26. Andjeiković, A., Kemppainen, K. K., Jacobs, H. T. Ligand-bound geneswitch causes developmental aberrations in drosophila that are alleviated by the alternative oxidase. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (9), 2839-2846 (2016).
  27. Hakkaart, G. A. J., Dassa, E. P. E. P., Jacobs, H. T., Rustin, P. Allotopic expression of a mitochondrial alternative oxidase confers cyanide resistance to human cell respiration. EMBO Reports. 7 (3), 341-345 (2006).
  28. Dassa, E. P., et al. Expression of the alternative oxidase complements cytochrome c oxidase deficiency in human cells. EMBO Molecular Medicine. 1 (1), 30-36 (2009).
  29. Szibor, M., et al. Broad AOX expression in a genetically tractable mouse model does not disturb normal physiology. DMM Disease Models and Mechanisms. 10 (2), 163-171 (2017).
  30. El-Khoury, R., Kaulio, E., Lassila, K. A., Crowther, D. C., Jacobs, H. T., Rustin, P. Expression of the alternative oxidase mitigates beta-amyloid production and toxicity in model systems. Free Radical Biology and Medicine. 96, 57-66 (2016).
  31. Mills, E. L., et al. Succinate Dehydrogenase Supports Metabolic Repurposing of Mitochondria to Drive Inflammatory Macrophages. Cell. 167 (2), 457-470 (2016).
  32. Giordano, L., et al. Alternative Oxidase Attenuates Cigarette Smoke-induced Lung Dysfunction and Tissue Damage. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 60 (5), 515-522 (2019).
  33. Camargo, A. F., et al. Xenotopic expression of alternative electron transport enzymes in animal mitochondria and their impact in health and disease. Cell biology International. 42 (6), 664-669 (2018).
  34. Saari, S., et al. Alternative respiratory chain enzymes: Therapeutic potential and possible pitfalls. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (4), 854-866 (2019).
  35. Instructables.com. , Available from: https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisted/ (2021).
  36. Tindercad.com. , Available from: https://www.tinkercad.com/ (2021).
  37. Repetier.com. , Available from: https://www.repetier.com/ (2021).
  38. Tinkercad.com. , Available from: https://www.tinkercad.com/login (2021).
  39. Knowledge.autodesk.com. , Available from: https://knowledge.autodesk.com/support/revit-products/learn_explore/caas/CloudHelp/cloudhelp/2016/ENU/Revit-Model/files/GUID-B89AD692-C705-458F-A638-EE7DD83D694C-htm.html (2021).
  40. Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. Journal of Visualized Experiments. (124), e55808(2017).
  41. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  42. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments JoVE. (61), e3795(2012).
  43. Oroboros. , Available from: https://www.oroboros.at/">"https://www.oroboros.at/">https://www.oroboros.at/ (2021).
  44. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  45. Tinkercad. , Available from: https://tinkercad.zendesk.com/hc/en-us/categories/200357447-FAQ">"https://tinkercad.zendesk.com/hc/en-us/categories/200357447-FAQ">https://tinkercad.zendesk.com/hc/en-us/categories/200357447-FAQ (2021).
  46. Morton, J. D., Barnes, M. F., Zyskowski, R. F. Respiratory control ratio: A computer simulation of oxidative phosphorylation. Biochemical Education. 24 (2), 110-111 (1996).
  47. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. The Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 383-393 (1955).
  48. Geissmann, Q., Garcia Rodriguez, L., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. F. Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics. PLOS Biology. 15 (10), 2003026(2017).
  49. Github.com. , Available from: https://github.com/amchagas/Flypi">"https://github.com/amchagas/Flypi">https://github.com/amchagas/Flypi (2021).
  50. Gilestrolab.github.io. , Available from: https://gilestrolab.github.io/ethoscope/">"https://gilestrolab.github.io/ethoscope/">https://gilestrolab.github.io/ethoscope/ (2021).
  51. Imagej.nih.gov. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/">"https://imagej.nih.gov/ij/">https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  52. Open-Neuroscience.com. , Available from: https://open-neuroscience.com/">"https://open-neuroscience.com/">https://open-neuroscience.com/ (2021).
  53. Appropedia.org. , Available from: https://www.appropedia.org/3D_printable_science_equipment">"https://www.appropedia.org/3D_printable_science_equipment">https://www.appropedia.org/3D_printable_science_equipment (2021).
  54. McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
  55. Schou, M. F., Kristensen, T. N., Pedersen, A., Karlsson, B., Loeschcke, V., Malmendal, A. Metabolic and functional characterization of effects of developmental temperature in Drosophila melanogaster. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 312 (2), 211-222 (2017).
  56. Meeuse, B. J. D. Thermogenic Respiration in Aroids. Annual Review of Plant Physiology. , (1975).
  57. Watling, J. R., Robinson, S. A., Seymour, R. S. Contribution of the alternative pathway to respiration during thermogenesis in flowers of the sacred lotus. Plant Physiology. , (2006).
  58. Inaba, Y. I., et al. Alternative oxidase capacity of mitochondria in microsporophylls may function in cycad thermogenesis. Plant Physiology. 180 (2), 743-756 (2019).
  59. Sanz, A., Stefanatos, R., McIlroy, G. Production of reactive oxygen species by the mitochondrial electron transport chain in Drosophila melanogaster. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 42 (2), 135-142 (2010).
  60. Miwa, S., St-Pierre, J., Partridge, L., Brand, M. D. Superoxide and hydrogen peroxide production by Drosophila mitochondria. Free Radical Biology and Medicine. 35 (8), 938-948 (2003).
  61. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control An Introduction to OXPHOS Analysis. Bioenergetics Communications. 2, Bionergetics Communications. Innsbruck, Austria. (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sinek Laboratuvar Kurulumu3D Yaz c EkipmanlarMitokondriyal Oksijen T ketimiLokomotor AnalizlerKur ArenalarAlternatif Oksidaz EkspresyonuDavran sal AnalizlerModel Organizma Ara t rmalar
Video yakında

İlgili makaleler