Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme
Bu makalede
Özet
Özet
Sakkaroz yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile polizom fraksiyonasyonu, ribozom profilleri oluşturmak, ribozomlar tarafından çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak ve polizomla ilişkili faktörleri analiz etmek için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Otomatik gradyan üreticileri ve gradyan fraksiyonasyon sistemleri bu teknikle yaygın olarak kullanılırken, bu sistemler genellikle pahalıdır ve sınırlı kaynaklara sahip laboratuvarlar için maliyet engelleyici olabilir veya araştırmaları için bu yöntemi nadiren veya ara sıra gerçekleştirme ihtiyaçları nedeniyle masrafı haklı çıkaramazlar. Burada, özel fraksiyonasyon aletleri olmadan çoğu moleküler biyoloji laboratuvarında bulunan standart ekipmanı kullanarak çoğaltılabilir polizom profilleri üretmek için bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, gradyan fraksiyonasyon sistemi olan ve olmayan polizom profillerin karşılaştırılması sağlanmaktadır. Tekrarlanabilir polizom profillerini optimize etme ve üretme stratejileri tartışılmaktadır. Saccharomyces cerevisiae bu protokolde model organizma olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu protokol birçok farklı organizma ve hücre tipi için ribozom profilleri oluşturmak üzere kolayca değiştirilebilir ve uyarlanabilir.
Giriş
Ribozomlar, mRNA'yı proteinlere dönüştürmenin temel işlemini gerçekleştiren mega-Dalton ribonükleoprotein kompleksleridir. Ribozomlar, bir hücre içindeki tüm proteinlerin sentezini gerçekleştirmekten sorumludur. Ökaryotik ribozomlar, sedimantasyon katsayılarına göre küçük ribozomal alt birim (40S) ve büyük ribozomal alt birim (60S) olarak adlandırılan iki alt birimden oluşur. Tamamen monte edilmiş ribozom, 80S monozomu olarak adlandırılır. Polizomlar, tek bir mRNA molekülünü çevirmekle uğraşan ribozom gruplarıdır. Sakkaroz yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile polizom fraksiyonasyonu, ribozom profilleri oluşturmak, ribozomların çevrilmesiyle ilişkili spesifik mRNA'ları ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. %7 -%47 sakkaroz gradyanlarının hazırlanması
NOT: Sakkaroz gradyanının doğrusal aralığı, kullanılan hücre tipine bağlı olarak daha iyi ayırma elde etmek için değiştirilebilir. Bu protokol, S. cerevisiae için polizom profilleri için optimize edilmiştir.
- Sakkaroz gradyan tamponunda %7 ve %47 sakarozlu stok çözeltileri hazırlayın (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 ve 1 mM DTT). Filtre, sakkaroz stok çözeltilerini 0,22 μm'lik bir filtreyle sterilize eder ve 4 °C'de saklar.
- %7 ve %47 sakaroz stok çözeltilerini Tablo 1'de açıklanan şekilde dağıtarak ve karıştırarak %17, %27 ve %37'lik....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 3'te üç temsili polizom profili gösterilmiştir. Tüm profiller aynı maya suşundan gelmektedir. Tipik bir polizom profili, 40S, 60S ve 80S ribozomal alt birimleri ve polizomlar için iyi çözülmüş zirvelere sahip olacaktır. Her ribozomal alt birimin tepesi ve polizom zirvesi her profilde belirgin olacaktır (Şekil 3). Otomatik yoğunluk fraksiyonasyon sisteminden temsili bir profil Şekil 3A'da gösterilmiştir. Bu profili oluşturmak i.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, pahalı otomatik fraksiyonasyon sistemleri kullanılmadan polizom profilleri oluşturmanın bir yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntemin avantajı, polizom profillemeyi otomatik fraksiyonasyon sistemlerine sahip olmayan laboratuvarlar için erişilebilir hale getirmesidir. Bu protokolün en büyük dezavantajları, sıkıcı el fraksiyonasyonu ve özel yoğunluk fraksiyonasyon sistemine kıyasla daha az hassasiyettir.
Bu protokol, ribozomal alt birimleri, monozomları ve polizomları ayırmak için yeterli çözün.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, Dr. Percy Tumbale ve Dr. Melissa Wells'e bu makaleyi eleştirel okumaları için teşekkür eder. Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir; ABD Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü (NIEHS; ZIA ES103247 ila R.E.S).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Otomatik Fraksiyonlayıcı | Brandel | ||
| Clariostar Çok Modlu Plaka Okuyucu | BMG Labtech | ||
| Sikloheksimid | Sigma Aldrich | C7698 | |
| Ditiotreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| Cam Boncuklar, asitle yıkanmış | Sigma Aldrich | G8772 | 425 – 600 μ m |
| Heparin | Sigma Aldrich | H4784 | |
| Magnezyum Klorür, 1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| İğne, 22 G, Metal Hub | Hamilton Company | 7748-08 | özel uzunluk 9 inç, nokta stili 3 |
| Optima XL-100K Ultrasantrifüj | Beckman Coulter | ||
| Polipropilen Santrifüj tüpleri | Beckman Coulter | 331372 | |
| Polipropilen Test Tüpü Peg Raf | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| Potasyum Klorür | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Kübit 4 Florometre | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Kübit RNA HS Test Kiti | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNAse İnhibitörü | Uygulamalı | Biyosistemler N8080119 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 Sallanan Kova Rotor Pkg | Beckman Coulter | 331336 | |
| Şırınga, 3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris, 1 M, pH 7.4 | KD Medikal | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star Mikroplaka, 96 kuyu | Greiner Bio-One |
Kaynaklar
- Choi, A., Barrientos, A. Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes. Methods in Molecular Biology. 2192, Clifton, N.J. 211-226 (2021).
- Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. Isolati....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
