Bu protokol, doğum sonrası yaşlarda yenidoğan sıçanlarda hücrelerin alt popülasyonlarına somatomotor kortekse anterograd kemogenetik modifiye edici ve servikal omuriliğe retrograd taşınabilir bir Cre rekombinaz enjekte ederek gen terapileri uygulamak için yeni bir yöntem göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yenidoğan Sıçanlarında Kortikospinal Sistemin Kombine Beyin ve Omurga Cerrahisi Kullanılarak Çift Viral Vektörle Hedeflenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Yenidoğan sıçanları üzerindeki araştırmaları kısıtlayan engellerin başarılı bir şekilde ele alınması, pediatrik omurilik yaralanmalarında (SCI'ler) yetişkin SCI'lere kıyasla görülen sonuçlardaki farklılıkları incelemek için önemlidir. Ek olarak, merkezi sinir sisteminin (CNS) hedef hücrelerine tedavileri güvenilir bir şekilde sokmak zor olabilir ve yanlışlıklar çalışmanın veya terapinin etkinliğini tehlikeye atabilir. Bu protokol, viral vektör teknolojisini yeni bir cerrahi teknikle birleştirerek gen terapilerini doğum sonrası 5. günde yenidoğan sıçanlarına doğru bir şekilde tanıtmaktadır. Burada, Cre'nin retrograd taşınması (retroAAV2) için tasarlanmış bir virüs, omurilikteki kortikospinal nöronların akson terminallerinde tanıtılır ve daha sonra hücre gövdelerine taşınır. Sadece tasarımcı ilaç (lar) (DREADD) virüsü tarafından aktive edilen çift flokslu ters oryantasyon (DIO) tasarımcı reseptörü daha sonra beynin somatomotor korteksine enjekte edilir. Bu çift enfeksiyon tekniği, DREADD'lerin ekspresyonunu sadece birlikte enfekte olmuş kortikospinal sistem (CST) nöronlarında teşvik eder. Bu nedenle, somatomotor korteks ve servikal CST terminallerinin eşzamanlı olarak birlikte enjeksiyonu, yenidoğan sıçanlarında servikal SCI modellerini takiben iyileşmenin kemogenetik modülasyonunu incelemek için geçerli bir yöntemdir.
Giriş
SKY, pediatrik popülasyonda nispeten nadir görülen bir olay olsa da, özellikle travmatiktir ve muazzam lojistik öngörü gerektiren kalıcı bir sakatlığa neden olur. Ayrıca, pediatrik SCI'lerin daha yüksek bir oranı, yetişkin popülasyona kıyasla servikal ve tam olarak sınıflandırılır 1,2. Memeli türleri arasında bir ayırt edici özellik, yenidoğanların SCI'den yetişkinlerden önemli ölçüde daha iyi iyileşmesidir ve bu, genç popülasyonlarda iyileşme için itici mekanizmaları değerlendirmek için bir fırsat sunar 3,4,5. Buna rağmen, kısmen genç hayvanların çok daha sıkı anatomik yer işaretlerinde seçilmiş nöron popülasyonlarını doğru bir şekilde hedeflemenin zorluğu nedeniyle, yenidoğan ve bebek kemirgen araştırmalarını ele alan daha az multimodal çalışma vardır6. Bu makalede, Cre-dependent-DREADD'lerin uygulanması ile majör motor yollarını modüle etmek için sıçan omuriliğine yüksek verimli anterograd ve retrograd adeno ilişkili vektörlerin doğrudan enjeksiyonu üzerinde durulmakta ve multimodal rejenerasyon çalışmalarının kapsamı genişletilmektedir.
Viral vektörler, hedef genlerin yerini almak, büyüme proteinlerini yukarı düzenlemek ve CNS 7,8,9'un anatomik manzarasını izlemek için genetik materyalin tanıtılması da dahil olmak üzere geniş bir uygulama alanına sahip önemli biyolojik araçlardır. Spinal motor yolakların anatomik detaylarının birçoğu klasik izleyiciler, yani biyotinile dekstran amin kullanılarak incelenmiştir. Geleneksel izleyiciler nöroanatominin ortaya çıkarılmasında etkili olsa da, dezavantajları yoktur: doğru enjekte edilseler bile yolları ayrım gözetmeksizin etiketlerler ve çalışmalar hasarlı aksonlar tarafından alındıklarını bulmuşlardır10,11,12. Sonuç olarak, bu, kopmuş aksonların liflerin yenilenmesiyle karıştırılabileceği rejenerasyon çalışmalarında yanlış yorumlara yol açabilir.
Aşağıdaki yöntem, modülasyon çalışmalarında son zamanlarda popüler hale gelen iki viral vektör sistemini, aynı nöronun iki ayrı alanında iki farklı viral vektör ile 13,14'ü kullanmaktadır. Birincisi, projeksiyon nöronlarının hücre gövdelerini lokal olarak enfekte eden bir vektördür. Diğeri ise projeksiyon nöronlarının akson terminallerinden taşınan retrograd bir vektördür (Şekil 1). Retrograd vektör Cre rekombinazını taşır ve yerel vektör, bir floresan proteinin (mCherry) kodlandığı "Cre-On" çift flokslu diziyi içerir. Hem hM3Dq hem de mCherry'yi ifade eden doğal transgen, promotöre göre ters çevrilir ve iki LoxP bölgesi ile çevrilidir (Şekil 2). Bu nedenle, mCherry sadece Cre rekombinazının LoxP bölgeleri arasında bir rekombinasyon olayını indüklediği, transgenin oryantasyonunu uygun okuma çerçevesine çevirdiği ve hem DREADD hem de floresan proteininin ekspresyonuna izin verdiği çift dönüşümlü projeksiyon nöronlarında ifade edilir. Viral transgen doğru yönde olduğunda ve uygulanabilir olduğunda, DREADD'ler ayrı ayrı enjekte edilen bir ligand, yani klozapin-N-oksit yoluyla geçici olarak nöromodülasyonu indükleyebilir. Protokol, yenidoğanlarda indüklenebilir nöromodülasyon araştırmalarını doğrulamak için tasarlanmıştır, burada CST'leri seçici olarak modüle etmek için DREADDS enjekte edilir. İki viral sistem, enjeksiyonları doğrulamak için her DREADD-pozitif hücrenin floresan altında yüksek doğrulukla izlenebilir olmasını sağlayan bir sigorta poliçesi görevi görür.
Bu yöntem aynı zamanda yenidoğan araştırmalarındaki boşluğu kapatmaya yardımcı olur. Pediatrik SCI zorluklarını ortaya koymaktadır ve rejenerasyon, filizlenme veya plastisiteyi analiz eden araştırmalar, yenidoğanlar ve yetişkinler arasındaki farkları vurgulamalıdır 3,15,16,17. Cerrahi prosedürü optimize ederek ve Nissl boyama ile önceki anatomik çalışmalar yapılarak, hem kraniyal hem de spinal enjeksiyonların koordinatları doğrulandı. Amaç, artan sadakat ve hayatta kalma kabiliyeti ile yenidoğan bir sıçana ikili enjeksiyon için bir yöntem sağlamaktı.
Mevcut model için, anterograd vektör, referans18,19 olarak bregma kullanılarak somatomotor korteksin hücre gövdelerine enjekte edildi. Spinal enjeksiyonlar açısından, retrograd vektör, CST akson terminallerinin20,21 bulunduğu lamina V-VII'ye enjekte edildi. Bazı lezyon modellerinin genç hayvanları nasıl farklı şekilde etkilediğinin ve sonraki iyileşmenin yaşlı bir hayvandan nasıl ayrıldığının altında yatan birçok temel soru vardır. Bu çalışma, yenidoğan kemirgenlerinde servikal yaralanmaları ve ön ayak fonksiyonunun geri kazanılabilirliğini incelemek için sağlam bir araç olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, önceki çalışmaların çoğu, lomber veya torasik yaralanmaları takiben iyileşme lokomotifini ele almıştır 5,22,23,24. Çift viral vektörü burada açıklanan yeni enjeksiyon tekniği ile eşleştirerek, bu protokol yenidoğan kemirgen araştırmalarını rahatsız edebilecek belirli sorunları (yani hayatta kalabilirlik) hafifletmeye yardımcı olur. Bu yöntem sağlam, pratik ve çok yönlüdür: teknikteki küçük değişiklikler, farklı yolakların, yani ventral CST, dorsal CST ve yükselen dorsal yolların hedeflenmesine izin verecektir.
Bu sistem için, lokal olarak etkili bir virüs (örneğin, AAV2), ilgilenilen nöronal hücre cisimlerinin bölgesine enjekte edilir. Yerel virüsün ekspresyonunu kontrol eden ikinci bir retrograd taşınan virüs, bu nöronal popülasyon için akson terminallerine enjekte edilir. Böylece, tanım gereği, sadece kortikospinal nöronlar etiketlenir. RetroAAV-Cre virüsü, yapısal olarak aktif bir CMV promotörü ile seçildi, çünkü mekik plazmid, çeşitli hücre tiplerinde Cre'ye bağımlı ekspresyon için birkaç AAV serotipi üretmek için kullanıldı. Kortikal enjeksiyonlar için, AAV2, nöronlara herhangi bir ifadeyi sınırlamak için sinapsin-1 promotor tarafından tahrik edilen transgen ile seçildi. 2-viral sistem, ilgilenilen nöronal popülasyonun kökenine ve sona ermesine daha fazla dayandığından, ilgilenilen nöronal popülasyon içindeki ilgi genlerinin ekspresyonunu yönlendirebilirlerse, birkaç farklı destekleyiciler kullanılabilir. Örneğin, uyarıcı nöronal promotör CamKII, sinapsin-1 ile değiştirilebilir. Bu AAV serotiplerinin kullanımına ek olarak, olgunlaşmamış ve çok daha az ölçüde retrograd transport, yetişkin kortikospinal motor nöronları da yüksek retrograd taşınabilir lentivirüs (HiRet) kullanılarak elde edilebilir25. HiRet lentivirüsleri, retrograd taşıma için sinapstaki alımı hedeflemek için kimerik Kuduz / VSV glikoproteini kullanır. Bir Tet-On promotörü ile birleştirilen bu 2-viral sistem, geriye dönük bağımlı bir şekilde indüklenebilir ekspresyonu destekler26,27.
Retrograd virüsler, bir hedef nöronun sinaptik boşluğuna vektörler yerleştirir ve bu hücrenin aksonu tarafından alınmasına ve hücre gövdesine taşınmasına izin verir. Lentiviral vektörler daha önce gen terapisi çalışmalarında uzun vadeli ekspresyon sağlayan muazzam bir başarıya sahip olsalar da, bu yöntem birkaç basit nedenden dolayı adeno ilişkili viral vektörlere yönelmiştir26,28: AAV daha ekonomiktir, benzer şekilde etkilidir ve daha düşük bir biyogüvenlik seviyesi tanımına sahip olduğu göz önüne alındığında daha az lojistik yük sunar 29,30,31,32 . En çok kullanılan serotip olan AAV2, CST aksonlarının sağlam transfeksiyonunu gösterirken, gelecekteki araştırmacılar, AAV1'in transinaptik olarak etiketlenirken çok yönlülük sunduğunu ve böylece gelecekteki çalışmalarda birkaç olası yineleme ortaya koyduğunu not edebilir33. Son adaptasyon, retrograd virüsü Cre-rekombinaz ile kodlamaktır, böylece birden fazla anterograd vektör aynı anda tanıtılabilir, böylece gereksiz kurum içi virüs atıklarını azaltır ve DRED'lerin doğru yönde ifade etme olasılığını en üst düzeye çıkarır.
Nihayetinde, bu protokol korteks ve servikal omurgaya eşzamanlı enjeksiyonu gösterir, özellikle sırasıyla hücre gövdelerini ve kortikospinal sistemin akson terminallerini hedef alır. Yüksek doğrulukta transfeksiyon serebral korteks ve omurilikte görülür. Tarif edilen protokol 5 günlük Sprague Dawley sıçanları için mükemmelleştirilmiş olsa da, anestezi ve stereotaktik koordinatlarda küçük ayarlamalarla doğum sonrası günler 4-10 için uygundur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Aşağıdaki cerrahi ve hayvan bakım prosedürlerinin tümü Temple Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Tarif edilen protokol bir sağkalım ameliyatıdır ve hayvanlar sonunda zaman noktalarının tamamlanmasında 100 mg / kg sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyon ile ötenazi yapılmıştır.
1. Ameliyat öncesi hazırlık
- 3.5 nL cam kılcal pipetler kullanarak viral enjeksiyon için en az iki çekilmiş cam iğne hazırlayın; DREADD için bir iğne ve rCre için bir iğne. İhtiyati bir önlem olarak, intraoperatif olarak kırılmaları durumunda 4-5 iğne hazırlayın.
- Mikromakas kullanarak, iğneden 1-2 mm fazla cam kesin.
- Her iğne için 30°'ye yerleştirin, 30-40 μm diyafram açıklığına ve 45° eğimli açıya sahip bir uç oluşturmak için bir mikropipet eğim makinesi kullanın.
- İğneleri kapalı bir Petri kabında saklayın ve Petri kabını 15 dakika boyunca UV ışığı altında bir biyogüvenlik başlığına yerleştirerek sterilize edin.
- İşlemden önce -80 °C dondurucudan uygun bir hacim çıkararak, her hayvanın her bir virüsün 3 μL'sine ihtiyaç duyacağını unutmayın.
NOT: Kullanılmadığında virüsü buz üzerinde taşıyın ve saklayın. Bu protokol, hayvan başına her virüsün 3 μL'sini enjekte etmek için AAV2-hM3Dq-mCherry ve AAV2-retroCre kullanılarak geliştirilmiştir. DREADD plazmid, pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry ( Malzeme Tablosuna bakınız), anterograd AAV2'yi 10 12genom kopyası (GC) / mL'× 1.54 viral titre ile yapmak için kullanıldı. Cre plazmidi pAAV-CMV-scCre, retrograd AAV2'yi 4.27 × 1012 GC / mL'lik bir viral titre ile yapmak için kullanıldı. - Enjektörü mikro pompaya takın ve Vernier terazili bir mikromanipülatöre yerleştirin.
- İğnede virüsün varlığını veya yokluğunu görsel olarak doğrulamaya yardımcı olmak için, renkli boyayı, yani kırmızı yağı iğneye yükleyin. İğnedeki kabarcıklardan kaçının.
- Cam iğneyi enjektöre yerleştirin ve iğnenin doğru şekilde oturduğundan emin olun.
- Varsa, tüm işlemi her virüs için ayrı bir enjeksiyon pompası ile tekrarlayın. Sadece bir tane mevcut enjeksiyon pompası varsa, iki ayrı iğne hazırlayın ve virüsleri değiştirme zamanı geldiğinde kullanılan iğneyi değiştirin.
2. Anestezi ve cerrahi alan hazırlığı
- Hayvanı dijital ölçekte tartın. Gerekli anestezik hacmini belirlemek için ameliyat öncesi ağırlığı kaydedin.
NOT: Bu protokol, ameliyat süresi boyunca tatmin edici bir anestezik düzlem sağlamak için en güvenilir anestezik tekniğin ketamin ve hipoterminin bir kombinasyonu olduğunu bulmuştur. Ketamin kendi başına anesteziyi sağlamak için yetersizdir ve intraoperatif mortaliteyi arttırmadan önce ksilazin ile takviye edilmesi dar bir eşiğe sahiptir. Hipotermi tek başına uzun süreli ameliyatlar için yeterli değildir (çift omurga ve beyin cerrahisi muhtemelen >1 saatlik sabit anestezi gerektirir). - Seyreltilmiş ketamin (10 mg / mL) omuz bıçakları arasına deri altından enjekte ederek yavruyu anestezi altına alın, böylece hayvan 100 mg / kg ketamin dozu alır; 5 dakika bekleyin.
NOT: Örneğin, doğum sonrası 5. günde, bir sıçan yavrusu 10 g ağırlığındadır ve seyreltilmiş ketamin çözeltisinden (10 mg / mL) 0.1 mL alır. - Yavruyu 6-8 dakika boyunca ezilmiş buz üzerine yerleştirin. Buzla doğrudan teması önlemek için hayvanı lateks eldiven veya parafilm içine yerleştirerek donmaya karşı koruyun.
- Uygun bir anestezik düzlemi doğrulamak için forseps kullanarak ayağı sıkıca sıkıştırın. Refleksif çekilme meydana gelirse, devam etmeden önce buz üzerinde 2 dakika daha bekletin.
- % 5'lik bir iyot çözeltisi ile ıslatılmış steril gazlı bez kullanarak hayvanın baş ve sırt bölgesine geniş çapta antiseptik uygulayın. Daha sonra,% 70 etanol içine batırılmış gazlı bezle sterilize edin. Antiseptik mendilleri, gazlı bezi ıslatmak için iyot ve etanol arasında dönüşümlü olarak her biri üç kez uygulayın.
NOT: Genç yavrular gözlerini sadece 14 günlükken açtıkları için göz bakımına gerek yoktur. - Bir hayvan çift ameliyat (beyin + omurga) alacaksa, ameliyattan önce omuz bıçakları arasında deri altından normal bir salin bolus (0.02 mL / g) sağlayın.
NOT: Hayvan ameliyat sırasında yanıt verirse ve daha fazla anestezi gerekiyorsa, hayvanı 5 dakika boyunca buz üzerinde değiştirin.
3. Cerrahi alan ve alet hazırlama
- Neşter tutucu, rongeurlar, hemostatlar, orta nokta kavisli forsepsler ve retraktörler içeren cerrahi aletleri otoklav
- Mikroskobu hazırlayın ve yetişkin stereotaksik tutucu içinde sıkıca konumlandırmak için yenidoğan sıçan stereotaksik adaptörünü takın.
- Ameliyatı sterilize eldivenler kullanarak yapın. Önceden paketlenmiş steril cerrahi eldivenlerden oluşan bir paket açın ve steril eldiven sargısını masanın üzerine yerleştirin ve sargıyı kullanılmış aletleri yerleştirmek için ek bir alan olarak kullanın.
NOT: İyi cerrahi uygulamaları takip etmek ve prosedür boyunca steriliteyi korumak önemlidir. - Neşter tutucusuna 11 bıçağı sabitleyin. Steril salin, 4.0 kromik katgut sütürü, 4.0 ipek sütür ve kanamayı kontrol etmek için steril gazlı bez, steril pamuk uçlu aplikatörler ve üçgenler gibi malzemeler yerleştirin.
- Yukarıda tarif edildiği gibi, bir bölge kraniyotomi ve diğer bölge servikal laminektomi için atanmış olmak üzere iki cerrahi alan oluşturun.
- Hayvanı alın ve stereotaksik adaptöre sabitleyin: yenidoğanlar çok kıkırdaklı olduklarından, kulak çubuklarını geniş bir şekilde mandibuler eklemlere doğru yönlendirerek yavaşça sabitleyin. Yatay olarak stabilize edildikten sonra, ön ağızlığı yavaşça yerleştirin.
NOT: "Düz" bir cerrahi alan sağlamak için kullanılan bağlayıcı olmayan bir kural, kulak çubuklarını aynı yükseklikte ve ağızlığı yaklaşık 2-3 seviye daha alçakta sabitlemektir.
4. Kraniotomi yapmak ve somatomotor korteksi açığa çıkarmak
- Kafa derisinin üstündeki orta çizgideki forsepslere basarak, sagital sütür için hissederek insizyonun yapılacağı alanı tanımlayın. Göz çizgisinin hemen üstünden başlayarak sagital sütür düzlemi boyunca 1 cm'lik bir kesi yapın. Temiz, düz ve hassas bir kesi sağlamak için cildi gergin tutun.
- Forsepsleri kafatasının yüzeyi boyunca nazikçe inceleyerek ve dikiş çizgilerinin yanı sıra parietal ve frontal kemikler boyunca uzanan forsepslerin neden olduğu girintilere çok dikkat ederek bregmayı (koronal ve sagital sütürlerin yakınsaması) tanımlayın.
- İlgilenilen tarafta ağırlıklı kancaların uygulanmasıyla açıklığı koruyun. Spinal enjeksiyonun sağ tarafta, kraniyal enjeksiyonun sol tarafta olduğunu unutmayın.
- Daha fazla doğruluk için bregma maruziyetini en üst düzeye çıkarmak için aponevrozu pamuk uçları ve mikromakas kombinasyonu ile temizleyin. Koronal sütürün, sonraki enjeksiyonlar için kaba bir şablon sağlamak için yanal olarak yeterince net bir şekilde göründüğünden emin olun.
- Mikromakası kullanarak, bregmaya hemen bitişik sol frontal kafatası kemiğinin yaklaşık 3 x 2 mm'lik bir bölümünü kesin.
NOT: Kemik kapağı dikkatlice çıkarıldıktan sonra, maruz kalan beyin maddesinin enjeksiyona hazır olduğu açık bir pencere olmalıdır. Beynin kontralateral tarafındaki kalan dikiş çizgileri, ön-arka (AP) eksen boyunca doğruluğu korumak için görsel bir rehber görevi görecektir. - Herhangi bir döküntüyü, beyin omurilik sıvısını (BOS) ve kanı pamuk uçlarıyla temizleyin.
NOT: Kan veya BOS için görsel çizgiyi hafifçe gizlemek normaldir, bu nedenle bölgeyi pamuklu uçlarla düzenli olarak temizlemeniz önerilir.
Şekil 3: Kraniyal enjeksiyon koordinatlarının (mm) bregmaya göre şematik bir gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
5. Virüsün yüklenmesi ve enjektörün konumlandırılması
- Bir parafilm parçası üzerine ~5 μL pipet yaparak virüsü enjektöre yükleyin ve iğneyi, ucu virüsün damlacığının üzerinde duracak şekilde konumlandırın.
- Düzgün enjeksiyon sağlamak için enjektöre ekstra virüs yüklendiğinden emin olun. Örneğin, toplam 3 μL (her enjeksiyon bölgesi için 1 μL) enjekte ederken, mikropompayı kullanarak virüsün 4 μL'sini 250 nL / s oranında çekin.
- Fazla virüsü laboratuvar mendiliyle temizleyin.
- Mikromanipülatörü Vernier ölçeği görünecek şekilde konumlandırın ve iğneyi sagital sütürün üzerine yerleştirin.
- İğneyi bregmayı temsil eden alanın hemen üstüne indirin (Şekil 3) ve AP ve medial-lateral (ML) koordinatlarını not edin.
- Enjeksiyonların sol tarafta olacağı göz önüne alındığında, bregma için ML koordinatlarından 1, 1.5 ve 2.0 mm'yi (ML: -1.0, -1.5, -2.0) çıkararak hedef koordinatları oluşturun.
NOT: AP pozisyonu, her üç enjeksiyon için de bregma'dan +0,5 mm olacaktır. - İğneyi ilk enjeksiyon için yerine getirin. AP: +0,5, ML: -1,0
- İğneyi dış kortekse girintileyene kadar maruz kalan beyne indirin. İğnenin yüksekliğini not edin ve beyin yüzeyinin yüksekliğinden 0,6 mm çıkararak iğneyi yerine getirin. Enjeksiyon derinliği: kortikal yüzey -0.6 mm.
NOT: Sıçanın pozisyonunda hafif bozulmalar meydana gelebileceğinden, her enjeksiyon için yüzeyin derinliğine dikkat etmek önemlidir.
6. Somatomotor kortekse virüs enjekte etmek
- İğne yerleştirildikten sonra, enjektörü 250 nL / dak hızında 1 μL enjekte edecek şekilde programlayın.
- Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, iğnenin kortekste 3 dakika dinlenmesine izin verin.
- Enjeksiyonları diğer koordinatlar için tekrarlayın: korteks boyunca bregma ile ilişkili olarak toplam 3 enjeksiyon, hepsi -0.6 mm derinlikte: 1) AP: +0.5 mm, ML: -1.0 mm 2) AP: +0.5 mm, ML: -1.5 mm 3) AP: +0.5 mm, ML: -2.0 mm.
- Enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra dikiş için bölüm 9'a bakınız ve servikal laminektomi için hayvanı diğer ameliyat masasına transfer edin.
7. Hassas omurilik enjeksiyonları için omurilik penceresi oluşturma
- Kafatasının tabanını palpe etmek için parmakları kullanarak kesi bölgesini tanımlayın. Orta çizgide, #11 bıçak kullanarak kafatası tabanına 1-2 mm posterior insizyona başlayın ve yüzeysel kası ortaya çıkarmak için insizyonu 1 cm posterior uzatın. Temiz bir kesi sağlamak için başparmak ve işaret parmağı ile gerginlik uygulayarak cildi gergin tutun.
- Bıçağın keskin noktasını kullanarak, omurilik boşluğunu ve derin omurilik kaslarını açığa çıkarmak için yüzeysel kasın orta çizgisi boyunca yavaşça bir dizi kesik yapın. Kasları açmak ve cerrahi pencereyi görselleştirmek için bir çift forseps kullanın.
NOT: Yüzeysel kas açık pembe görünürken, derin omurilik kasları açık beyazımsı gri görünecektir. - Derin omurga kasları açığa çıktıktan sonra, cerrahi pencereye retraktörler yerleştirin. Gerekirse, yanal cilde tutunmak için forseps kullanın ve retraktörlerin dişlerinin etrafına germek için kasları kullanın. Cerrahi pencereyi 7-8 mm genişliğe geri çekerek omurganın engelsiz bir şekilde görülmesini sağlayın.
- İkinci servikal (C2 veya eksen) omurları, dorsal olarak yansıtan ve büyük bir kubbe şeklindeki kastaki kapsüllemeyi yansıtan belirgin dikenli süreci ile tanımlayın. Bu süreci hissetmek ve tanımlamak için forseps veya künt bir prob kullanın, çünkü bu yol gösterici dönüm noktası olacaktır.
NOT: Bitişik C3 omurları genellikle büyük C2 kası tarafından hafifçe tıkanır; Bu nedenle, forseps veya kemik kazıyıcı ile C3'teki kasın nazikçe diseksiyonu, omurların tanımlanmasına ve vertebral sayıma yardımcı olmasına yardımcı olur. - Bir kemik kazıyıcının düz kenarını kullanarak, derin omurilik kasını yanlara nazikçe kazıyarak C3-C7 omurlarını açığa çıkarın. Medial başlayın ve vertebral laminaların net bir şekilde ayırt edilmesini sağlayacak uygun maruziyeti sağlamak için vertebral laminaya paralel yön boyunca lateral olarak kazıyın. Herhangi bir kanamayı pamuk uçlarıyla kontrol edin.
- Bir çift mikromakas kullanarak, kıkırdaklı laminaların yanal kenarlarını C6 ve C7'de dikkatlice kesin. Vertebral seviyeleri sayarken C2'yi kılavuz olarak kullanın.
- Bir çift ince forseps kullanarak, omuriliği açığa çıkarmak için laminanın disseke edilmiş kısmını dikkatlice çıkarın. Omurga penceresinin istenen enjeksiyon bölgesini barındıracak kadar büyük olduğundan emin olun. Yukarıda tarif edildiği gibi omuriliği mikromakas ve forseps ile delebilecek keskin veya pürüzlü kemik kısımlarını çıkarın.
- Hayvanı, bölüm 3.6'da açıklandığı gibi stereotaksik kranial tutucuya yerleştirin. Ek olarak, arka kısımlarını yükseltmek için hayvanın gövdesinin altına yuvarlanmış bir gazlı bez parçası yerleştirin.
NOT: Hayvanın arka kısımlarının yükseltilmesi, solunum hareketlerinin enjeksiyon sırasında iğnenin konumunu etkilemesini önlemek için toraksı tutucunun yüzeyinden etkili bir şekilde kaldırır. - Enjeksiyonlara başlamadan önce, omuriliğe hakaret etmeden bölgeye pamuk uçları ve Sugi üçgenleri uygulayarak herhangi bir kan veya beyin omurilik sıvısının omurga penceresini temizleyin. Ayrıca, enjeksiyon bölgesinin sürekli kanama veya BOS sızıntısı ile tıkanmasını önlemek için pencerenin çevresi etrafında bir bariyer oluşturun. Bunu yapmak için, omurilik penceresinin yan kısımlarına küçük bir emilebilir pamuk parçası yerleştirin.
8. Akson terminallerini hedefleyen omuriliğe doğrudan enjeksiyonlar
- Cam enjeksiyon iğnesinin ucunu kullanarak, omuriliğin orta hattını omuriliği tanımlayarak yaklaşık olarak belirleyin. Bununla birlikte, spinal arter belirgin şekilde merkezden uzaksa veya herhangi bir şekilde saparsa, C2 dikenli sürecin pozisyonunu kullanarak ve bunu omurganın uzunluğu boyunca tahmin ederek orta hatta yaklaşın.
NOT: Virüsü yükleme talimatları için bölüm 5.1'e bakın. - Tanımlandıktan sonra, iğneyi yaklaşık orta çizgideki C5 laminanın hemen arkasına yerleştirin ve bunu referans noktası olarak kullanın. Daha sonra, mikromanipülatörü kullanarak, iğneyi yanal olarak 0,3 mm sağa doğru hareket ettirin. İğneyi omuriliğin yüzeyine dokunana kadar indirin; Bu derinlikten, iğneyi omuriliğe 0,6 mm batırın. Gerekirse, omuriliği delene kadar iğneyi daldırmaya devam edin; daha sonra iğneyi uygun derinliğe geri çekin veya indirin.
- 250 nL/dak'da 1 μL retroAAV2-scCre enjekte edin. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, iğneyi yavaşça geri çekmeden önce virüsün omuriliğe yayılması için 2 dakika bekleyin. Enjeksiyonları, omurga penceresinde biri orta noktada ve sonuncusu T1 laminanın hemen önünde olmak üzere iki bölgede daha aynı yanal ve derinlik koordinatlarını kullanarak tekrarlayın.
9. Yara kapatma ve ameliyat sonrası bakım
- Hayvanı stereotaksik tutucudan çıkarın ve retraktörleri veya kancaları çıkarın. Yara bölgesini birkaç damla steril normal salin ile temizleyin.
- Kafa derisini 4.0 ipek dikiş, toplamda iki veya 3 dikiş ile dikin.
- Servikal açıklığı dikerken, kas katmanlarını sıkıca yeniden bağlamak için 4.0 kromik bağırsak kullanın (2 dikiş yeterli olmalıdır). Servikal cilt açıklığını 4.0 ipek ile dikin (4 dikiş beklenir).
- Hayvan kapatıldıktan sonra, dikişlere dikkatlice sıvı bandaj uygulayın.
- Hayvanı bir ısıtma lambasının altına yerleştirin ve tamamen uyanana kadar yakından izleyin. Hayvan uyandığında, hareket ettiğinde ve kuruduğunda, yaraları steril gazlı bezle nazikçe temizleyin. Sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın.
- Hayvanı annesiyle birlikte ev kafesine geri getirin. Anneden yavrulara doğru ihmal ve bebek yamyamlığını önlemeye özen gösterin:
- Araştırmacıları, ameliyattan bir hafta önce başlayarak, günde iki kez nazik bir şekilde (5-10 dakika) ameliyat beklentisiyle anneyle tanıştırın.
- Anneye bozulmayı sınırlamak için yavruları birlikte ev kafesine geri getirin.
- Anneye ameliyat günü deri altından 1.5 mg/kg q12 h asepromazin enjekte edin.
NOT: Ağrı yönetimi, yavrular için analjezi sağlamak ve aktiviteye daha erken dönüşü teşvik etmek, böylece anne ile yeniden bütünleşmeyi teşvik etmek gibi ikili bir amaca hizmet eder. - Ameliyattan sonra başlayarak toplam 3 gün boyunca (postoperatif günler 0, 1, 2) 0.05 mg/kg deri altından q8 saat buprenorfin enjekte edilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Viral vektörün başarılı bir şekilde enjekte edilmesi ve taşınması, omurilik ve motor korteksteki tek taraflı nöronların transdüksiyonu ile sonuçlanmalıdır. Şekil 4 , bir beyin koronal bölümünün motor korteksindeki katman V CST nöronlarının, Cre-bağımlı-DREADD'leri-mCherry'yi rCre'nin kontralateral omurga enjeksiyonu ile birlikte enjekte ettiğini göstermektedir. Kesitler dsRed antikoru ile boyandı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Enjekte edilebilir kemogenetik değiştiriciler ile beyin aktivitesinin indüklenebilir genetik modülasyonu, SCI'den iyileşmenin altında yatan çeşitli mekanizmaları incelemede güçlü bir araçtır. İndüklenebilir G-proteinine bağlı reseptörler (DREADD'ler) için hedeflemenin doğruluğu, floresan izlemenin histolojideki anatomik hassasiyeti doğruladığı düşünüldüğünde daha da artar. Bu yazıda, seçilmiş nöronal yolakların (uyarıcı veya inhibitör DREADD'lerle) inhibe edilmesinin veya uyarılmasının gelişmiş akson rejenerasyonu veya f...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Shriners Çocuk Hastaneleri SHC-84706'dan bir burs hibesi ile finanse edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| #11 neşter bıçakları | Roboz | RS-9801-11 | Neşter ile kullanım için. |
| #10 Neşter Bıçakları | Roboz | RS-9801-10 | Neşter ile kullanım için. |
| 1 mL Şırıngalar | Becton, Dickinson and Company | 309659 | Anestezik SC enjeksiyonu ve sıvı bolus için |
| 4.0 ipek sütür | Ethicon | 771-683G | Cildin kapatılması için |
| 4.0 Kromik Katgüt Sütür | DemeTECH | NN374-16 | Kapanış sırasında kasları yeniden bağlamak için. |
| 48000 Mikropipet Beveler | World Hassas Aletler | 32416 | Fonksiyonel cam iğneler oluşturmak için çekilen cam kılcal boruların uçlarına eğim vermek için kullanılır. |
| % 5 İyot Çözeltisi | Purdue Ürünleri LP | L01020-08 | Cerrahi bölgenin sterilizasyonunda kullanım için. |
| %70 Etanol | N/A | N/A | Yeni hazırlanan cam iğnelerin, cerrahi hazırlık sırasında hayvan modellerinin sterilizasyonu için |
| Ketamin (Ketaset) | Zoetis | 240048 | Ameliyat sırasında hayvanı doğru bilinç düzleminde tutmak için. |
| Boncuk Sterilizatörü | CellPoint | 5-1450 | Cerrahi aletleri ısıyla sterilize etmek için. |
| Dijital Tartı | Okaus | REV.005 | Cerrahi hazırlık sırasında hayvanı tartmak için. |
| Esnek İğne Eki | Dünyası Hassas Aletler | MF34G-5 | Cam iğneleri temizlemek ve cam iğnelere kırmızı yağ yüklemek için. |
| Cam Kılcal Borular | Dünya Hassas Aletler | 4878 | Çekilmiş cam iğneler için - nanolitre enjektörler için tasarlanmalıdır. |
| Kanama durdurucular | Roboz | RS-7231 | Cerrahide genel kullanım içindir. |
| Orta Nokta Kavisli Forseps | Roboz | RS-5136 | Cerrahide genel kullanım için. |
| Vernier Ölçekli Mikromanipülatör | Kanetec | N/A | Ameliyat sırasında hassas hedefleme için. |
| Mikromakas | Roboz | RS-5621 | Yeni çekilmiş cam kılcal borulardan cam fısıltılarını kesmek için. |
| Lab Standard Stereotaksik Alet | Çalma | 51600 | Yenidoğan sterotoks tutucusunu yerinde tutmak için |
| Fare ve Laboratuvar Standardı ile Yenidoğanlar Adaptör | 51615 | Kraniyal cerrahi ve spinal enjeksiyonlar sırasında yenidoğan kafatası fiksasyonu için | |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | Enjeksiyon hızını kontrol etmek için. |
| Nanolitre 2000 Pompa Kafası Enjektör | Dünyası Hassas Aletler | 500150 | Virüsü kontrollü bir şekilde yüklemek ve enjekte etmek. |
| İğne Çektirme | Narishige | PC-100 | Cam iğneler oluşturmak için cam kılcal boruları ısıtmak ve ayırmak için. |
| pAAV-CMV-scCre | Wu laboratuvarı | Cre plazmid | |
| pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plazmid #44361) | Bryan Roth' Addgene | DREADD plazmid | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | Nanoenjektöre virüs yüklenmesine yardımcı olmak için. |
| PrecisionGlide İğneleri (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | Hayvan modelinin enjeksiyonuna izin vermek için 1 mL ve 10 mL şırıngalarla kullanım içindir. |
| Sıçan Diş Forseps | Roboz | RS-5152 | Dikenli süreçleri kavramak için. |
| Kırmızı Yağ | N/A | N/A | Enjeksiyon sırasında dokuya giren virüsün görselleştirilmesi için bir cephe sağlamak için. |
| Ekartörler | Roboz | RS-6510 | Cerrahi yarayı açık tutmak için. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | Ameliyat sırasında omurgadaki kasları çıkarmak için. |
| Neşter Bıçak Sapı | Roboz | RS-9843 | Ameliyat sırasında hayvan modelinin açık derisini ve yağ pedini kesmek için. |
| Makas | Roboz | RS-5980 | Cerrahide genel kullanım için. |
| Zımba Çıkarma Forseps | Kent Scientific | INS750347 | Zımbaları çıkarmak için, yanlış uygulanmaları gerekir. |
| Steril Bez | Phoenix Araştırma Ürünleri | BP-989 | Operasyon için steril bir yüzey sağlamak. |
| Steril Pamuk Uçlu Aplikatörler | Puritan | 806-WC | Steriliteyi korurken cerrahi yaradaki kanı emmek için. |
| Steril Gazlı Bez | Covidien | 2146 | Steriliteyi korurken cerrahi alanı ve cerrahi aletleri temizlemek için. |
| Steril Salin | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | Kan temizliğinde kullanım ve ameliyat sonrası sıvıların değiştirilmesi için. |
| Cerrahi Eldivenler | N/A | N/A | Ameliyat sırasında steril alanı korumak için cerrah tarafından kullanılır. |
| Cerrahi Isıtma Yastığı | N/A | N/A Ameliyat | sırasında hayvan modelinin vücut ısısını korumak için. |
| Cerrahi Mikroskop | N/A | N/A | Cerrahi yaranın daha iyi görselleştirilmesi için. |
| Cerrahi Zımba | Kent Scientific | INS750546 | Zımbaları uygulamak için. |
| Su Konveksiyonlu Isınma Pedi | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | Bilinçsiz hayvanın vücut ısısını korumak için işlem sonrası kurtarma alanında kullanım içindir. |
| Ağırlıklı Kancalar | N/A | N/A | Cerrahi yarayı açık tutmak için. |
| Sıvı bandaj | NewSkin | 985838 | Ameliyat sonrası dikişler boyunca uygulamak ve yara iyileşmesini teşvik etmek için |
| Tel Kafes Lambası | ZooMed | LF10EC | Hayvanların anesteziden kurtulmasına ve doğal olarak sıcak vücut ısısını korumasına yardımcı olmak için |
Kaynaklar
- Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature. Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
- Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P. Epidemiology of pediatric spinal cord injury in the united states: Years 1997 and 2000. Journal of Pediatric Orthopedics. 26 (6), 745-749 (2006).
- Bregman, B. S., Goldberger, M. E. Anatomical plasticity and sparing of function after spinal cord damage in neonatal cats. Science. 217 (4559), 553-555 (1982).
- Castro, A. J. Ipsilateral corticospinal projections after large lesions of the cerebral hemisphere in neonatal rats. Experimental Neurology. 46 (1), 1-8 (1975).
- Commissiong, J. W., Toffano, G. Complete spinal cord transection at different postnatal ages: Recovery of motor coordination correlated with spinal cord catecholamines. Experimental Brain Research. 78 (3), 597-603 (1989).
- Yuan, Q., Su, H., Chiu, K., Wu, W., Lin, Z. Contrasting neuropathology and functional recovery after spinal cord injury in developing and adult rats. Neuroscience Bulletin. 29 (4), 509-516 (2013).
- Kim, J., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualizing and manipulating neuronal circuits in vivo. The European Journal of Neuroscience. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Atasoy, D., Sternson, S. M. Chemogenetic tools for causal cellular and neuronal biology. Physiological Reviews. 98 (1), 391-418 (2018).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Reiner, A., et al. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Oguchi, M., et al. Double virus vector infection to the prefrontal network of the macaque brain. PloS One. 10 (7), 0132825(2015).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Bernstein, D. R., Stelzner, D. J. Plasticity of the corticospinal tract following midthoracic spinal injury in the postnatal rat. The Journal of Comparative Neurology. 221 (4), 382-400 (1983).
- Brown, K., Wolfe, B., Wrathall, J. Rapid functional recovery after spinal cord injury in young rats. Journal of Neurotrauma. 22, 559-574 (2005).
- Tillakaratne, N. J. K., et al. Functional recovery of stepping in rats after a complete neonatal spinal cord transection is not due to regrowth across the lesion site. Neuroscience. 166 (1), 23-33 (2010).
- Kartje-Tillotson, G., Neafsey, E. J., Castro, A. J. Electrophysiological analysis of motor cortical plasticity after cortical lesions in newborn rats. Brain Research. 332 (1), 103-111 (1985).
- Gennaro, M., et al. Focal stroke in the developing rat motor cortex induces age- and experience-dependent maladaptive plasticity of corticospinal system. Frontiers in Neural Circuits. 11, 47(2017).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Paxinos, G. 2, Academic Press. New York. 294-309 (1985).
- Kjell, J., Olson, L. Rat models of spinal cord injury: From pathology to potential therapies. Disease Models & Mechanisms. 9 (10), 1125-1137 (2016).
- Takeoka, A., Arber, S. Functional local proprioceptive feedback circuits initiate and maintain locomotor recovery after spinal cord injury. Cell Reports. 27 (1), 71-85 (2019).
- Flynn, J. R., Graham, B. A., Galea, M. P., Callister, R. J. The role of propriospinal interneurons in recovery from spinal cord injury. Neuropharmacology. 60 (5), 809-822 (2011).
- Ohne, H., et al. Mechanism of forelimb motor function restoration in rats with cervical spinal cord hemisection-neuroanatomical validation. IBRO Reports. 7, 10-25 (2019).
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Sheikh, I. S., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60(2018).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487, 235-238 (2012).
- Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. Direct injection of a lentiviral vector highlights multiple motor pathways in the rat spinal cord. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59160(2019).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yáñez-Muñoz, R. J., Moon, L. D. F. Corticospinal tract transduction: A comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Therapy. 19 (1), 49-60 (2012).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. Plos One. 9 (2), 87447(2014).
- Tervo, D. G. R., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: Comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2006).
- Zingg, B., Peng, B., Huang, J., Tao, H. W., Zhang, L. I. Synaptic specificity and application of anterograde transsynaptic AAV for probing neural circuitry. The Journal of Neuroscience. 40 (16), 3250-3267 (2020).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Hasegawa, A., et al. Mechanism of forelimb motor function restoration after cervical spinal cord hemisection in rats: A comparison of juveniles and adults. Behavioural Neurology. 2016, 1035473(2016).
- Alstermark, B., Isa, T. Circuits for skilled reaching and grasping. Annual Review of Neuroscience. 35, 559-578 (2012).
- García-Alías, G., Truong, K., Shah, P. K., Roy, R. R., Edgerton, V. R. Plasticity of subcortical pathways promote recovery of skilled hand function in rats after corticospinal and rubrospinal tract injuries. Experimental Neurology. 266, 112-119 (2015).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Z'Graggen, W. J., et al. Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion. Journal of Neuroscience. 20 (17), 6561-6569 (2000).
- Ueno, M., et al. Corticospinal circuits from the sensory and motor cortices differentially regulate skilled movements through distinct spinal interneurons. Cell Reports. 23 (5), 1286-1300 (2018).
- Kim, J., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863(2014).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
