Burada sunulan, mekanistik çalışmalar, hastalık modelleme ve tarama uygulamaları için uygun, çift kutuplu çok kuyulu bir plakada 48 dokudan oluşan paralel bir kültür için tasarlanmış bağ dokuları üretmek için bir protokoldür. Protokol, farklı organ ve türlerden fibroblastlarla uyumludur ve burada insan primer kardiyak fibroblastlarla örneklenmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fibroblast Türetilmiş İnsan Tarafından Tasarlanmış Bağ Dokusu Tarama Uygulamaları için
Bu makalede
Özet
Özet
Fibroblastlar fenotipik olarak son derece dinamik hücrelerdir ve biyokimyasal ve biyomekanik uyaranlara yanıt olarak hızla miyofibroblastlara transdifferentiate. Kardiyak fibrozis de dahil olmak üzere fibrotik süreçlerin mevcut anlayışı zayıf kalır ve bu da yeni anti-fibrotik tedavilerin gelişimini engeller. Kontrol edilebilir ve güvenilir insan modeli sistemleri fibrozis patolojisinin daha iyi anlaşılması için çok önemlidir. Bu, fibroblastların ve fibrotik dokunun patofizyolojisinin 3 boyutlu (3D) bir ortamda çalışmalarını kolaylaştırmak için 48 kuyulu bir döküm plakasında mühendislik bağ dokuları (EKT) oluşturmak için son derece tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir protokoldür. EKT, kutupların etrafında ayarlanabilir sertlik ile üretilir ve tanımlanmış bir biyomekanik yük altında çalışmalara izin verir. Tanımlanan yükleme koşullarında hücre-matris etkileşimleri ile kontrol edilen fenotipik adaptasyonlar incelenebilir. Paralel test, doku sıkıştırma ve yüke karşı kasılma gibi birden fazla parametrenin zaman dilimi analizi fırsatı ile 48 kuyu formatında uygulanabilir. Bu parametrelerden doku sertliği ve elastikiyet gibi biyomekanik özellikler incelenebilir.
Giriş
Fibrotik hastalıkların incelenmesinde önemli bir engel, fibroblastların davranışları ve patolojik türevleri hakkında fikir veren temsili insan 3D doku modellerinin olmamasıdır. Fibrotik süreçleri incelemek için, standart 2D kültür sistemleri alt optimaldir, çünkü izole fibroblastlar, uyumlu olmayan 2D substratlarda kültürlendiğinde α düz kas aktinine (SMA) hızla transdifferentiate olurlar1,2,3. Bu nedenle, standart 2D kültüründeki fibroblastlar düzenli bir "sağlıklı" doku fenotipini yansıtmaz3,4,5,6.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm adımlar, muhafaza seviyesi 1 altındaki laboratuvarlara monte edilen Sınıf II biyogüvenlik davlumbazlarında yapılmalıdır. Viral aracılı gen transferi gibi yerel düzenlemelere ve yapılacak manipülasyonların türüne bağlı olarak, muhafaza seviyesi biyogüvenlik seviyesi 2 veya 3'e yükseltilmelidir. Tüm kültürler 37 °C'de havada % 5 CO2 nemlendirilmiş atmosfere sahip bir hücre kültürü inkübatörde tutulur. Birimlerin (Adım 1 ve 2) bir T75 hücre kültürü şişesi için sağlandığını unutmayın. Birimleri standart hücre kültürü önerilerine göre farklı kültür biçimlerine ayarlayın.
1. Monolayer kültürü için birincil kardiyak fibroblast (CF) çö....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
ECT, ilk 24 saat içindeki ilk hücre kollajen hidrojel hacmine kıyasla yaklaşık% 95 sıkıştırmaya ulaşır. Kontrol koşulları altında ve FCS varlığında doku sıkışması ve kasılması dökümden birkaç saat sonra ortaya çıkar ve özellikle 5. güne kadar artar (Şekil 5A). Kutup sapması takip eden 15 gün boyunca daha da artabilir (20 gün test edilen en uzun süreydi). Kutup saptırma büyüklüğü hücre tipine, hücre durumuna ve hücre ve doku kültürü koşullarına bağlıdır. Tipik olarak, biyomekanik özellikler k.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Sunulan protokol, bu hücrelerin hücre dışı matris ortamları üzerindeki mekanik etkisinin incelenmesine izin veren birincil insan CF'sinden EKT'nin üretilmesini açıklar.
Planlanan EKT deneyleri (0,75 x 106 hücre/EKT) için yeterli hücre elde etmek için fibroblastların genişletilmesi gerekir. En iyi tekrarlanabilirlik için, 2D monolayer kültüründe kültür öncesi dondurulmuş veya dokudan türetilmiş fibroblastların, her pasajda % 80'e kadar standartlaştırılmış bir süre boyunca ve EKT oluş.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
GLS ve SL taslağı hazırladı. Tüm yazarlar protokol gelişimine katkıda bulundu ve makaleyi düzenledi. TM, MT ve WHZ, sayısız GmbH'nin bilimsel danışmanlarıdır.
Teşekkürler
Bu çalışma Alman Kardiyak Derneği (GLS için DGK Araştırma Bursu) ve Alman Araştırma Vakfı (DFG tarafından GLS ve AD için IRTG 1816 projesi aracılığıyla desteklenmiştir; MT için DFG 417880571 ve DFG TI 956/1-1; MT ve WHZ için SFB 1002 TP C04; WHZ için SFB 1002 TP S01; ve WHZ için EXC 2067/1-390729940J). WHZ, IndiHEART projesi aracılığıyla Alman Federal Bilim ve Eğitim Bakanlığı (BMBF) ve Fondation Leducq (20CVD04) tarafından desteklenmektedir. MT, WHZ ve SL, Alman Kardiyovasküler Araştırmalar Merkezi (DZHK) tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Hücre kültürü reaktifleri: | |||
| Akaktaz Çözeltisi | Merk Millipore | SCR005 | |
| Ayrışma reaktifi – TrypLE Express | Gibco | , | |
| s fosfat tamponlu salin (DPBS), pH 7.2, -Ca2 +, -Mg2 + | Gibco | 14190144 | |
| FGM-2 Fibroblast Büyüme Ortamı-2 BulletKit | Lonza | CC-3132 | |
| FBM Fibroblast Büyüme Bazal Orta | Lonza | CC-3131 | |
| FGM-2 Fibroblast Büyüme Ortamı-2 SingleQuots, Takviyeler ve Büyüme Faktörleri | Lonza | CC-4126 | |
| Fibroblast Büyüme Ortamı 3 KIT | PromoCell | C-23130 | |
| Fibroblast Bazal Ortam 3 | PromoCell | C-23230 | |
| Büyüme Ortamı 3 SupplementPack | PromoCell | C-39350 | |
| Penisilin (10000 U/mL)/ Streptomisin (10000 μ L / mL) | Gibco | 15140122 | |
| Sodyum hidroksit çözeltisi (NaOH) 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770-100ML | |
| Hücre kaynakları: | |||
| Ventrikülden normal insan kardiyak fibroblastları (NHCF-V) | Lonza | CC-2904 | |
| İnsan Kardiyak Fibroblastları (HCF-c) | PromoCell | C-12375 | |
| İnsan Kardiyak Fibroblastları ( HCF-p) | PromoCell | C-12377 | |
| Birincil insan sünnet derisi fibroblastları-1 (HFF-1) | ATCC | SCRC-1041 | |
| Kollajen kaynakları: | |||
| 0.01 M HCl LLC'de Kollajen Tip I (sığır) | Kollajen Solüsyonları | FS22024 | 6-7 mg / mL |
| Kollajen Tip I (sıçan kuyruğu) 0.02 M HCl | Corning | 354236 | ~ 4 mg / mL |
| İlaçlar: | |||
| Latrunculin-A (Lat-A) | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | |
| Plastik eşya: | |||
| Hücre kültürü plastik | eşyası Sarstedt ve Starlab | ||
| Mesh hücre süzgeci (Naylon, gözenek boyutu 40 & mu; m) | Falcon | 352340 | |
| myrPlate-uniform | myriamed GmbH | TM5 med | |
| Serolojik pipetler geniş açıklıklı, steril (10 mL) | Corning | 07-200-619 | |
| Özel aletler: | |||
| 1/2 & Prime için Bi-telesentrik CORE lens; dedektörler | OptoEngineering | TCCR12096 | |
| Alan tarama kamerası Basler ace acA4024 | Baskı | 107404 |
Kaynaklar
- Driesen, R. B., et al. Reversible and irreversible differentiation of cardiac fibroblasts. Cardiovascular Research. 101 (3), 411-422 (2014).
- Shi, X., et al. Elasticity of cardiac cells ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
