Sonbahar ordu kurdunda başarılı germline dönüşümü, Spodoptera frugiperda, hiperaktif piggyBac transposase mRNA kullanılarak elde edildi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hiperaktif piggyBac Transposase aracılı Germline Dönüşümü Sonbahar Ordu Kurdu, Spodoptera frugiperda
Bu makalede
Özet
Özet
Genetik kargonun transpoze edilebilir elementler kullanılarak böcek genomlarına istikrarlı bir şekilde yerleştirilmesi, fonksiyonel genomik çalışmalar ve genetik haşere yönetim stratejileri geliştirmek için güçlü bir araçtır. Böcek dönüşümünde en çok kullanılan transpoze edilebilir element piggyBacve piggyBactabanlı germline dönüşümü model böceklerde başarıyla gerçekleştirildi. Bununla birlikte, bu teknolojiyi tarım zararlılarını içeren model olmayan böceklerde çalıştırmak hala zordur. Bu makale, hiperaktif piggyBac transposase (hyPBase) kullanılarak küresel bir tarım zararlısının, sonbahar ordu kurdunun (FAW), Spodoptera frugiperda'nıngermline dönüşümini rapor ediyor.
Bu çalışmada hyPBase mRNA embriyo mikroenjeksiyonlarında yardımcı plazmid yerine üretilmiş ve kullanılmıştır. Bu değişiklik, transgenik FAW'ın başarılı bir şekilde üretilmesine yol açtı. Ayrıca transgenik hayvanların taranması, transgene yerleştirmenin PCR tabanlı hızlı tespiti ve entegrasyon sahasının termal asimetrik interlaced PCR (TAIL-PCR) tabanlı belirlenmesi yöntemleri de açıklanmıştır. Bu nedenle, bu makale FAW ve diğer lepidopteran böceklerde domuzbactabanlı transgenez kolaylaştıracak transgenik FAW üretmek için bir protokol sürmektedir.
Giriş
Sonbahar ordu kurdu (FAW), Spodoptera frugiperda, Amerika'nın tropikal ve subtropikal bölgelerine özgüdür. Şu anda, bu dünya çapında 100'den fazla ülkede yıkıcı bir böcek otobur1. FAW larvaları, bazı önemli temel gıda bitkileri de dahil olmak üzere 350'den fazla konak bitki ile beslenir2. FAW yetişkinlerinin güçlü göç yeteneği, Amerika'dan diğer yerlere hızla yayılmasına katkıda bulunur1,2. Sonuç olarak, bu böcek şimdi uluslararası gıda güvenliğini tehdit ediyor. Yeni teknolojilerin uygulanması FAW'da ileri çalışmaları kolaylaştırabilir ve bu zararlıyı y....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. hyPBase mRNA'nın in vitro sentezi
NOT: HyPBase dizisinin tam kodlama dizisi sentezlendi ve bir pTD1-Cas9 vektörüne eklendi (bkz. Malzeme Tablosu)pTD1-hyPBase yapısı üretmek için, hyPBase ifade kaseti içeren, T7 promotörü: polyhedrin-5' UTR: hyPBase: polihedrin-3' UTR: poli (A). pTD1-hyPBase yapının tam sırası Tamamlayıcı Malzeme'de sağlanmıştır.
- In vitro sentez için şablonun hazırlanması
- İleri astar, 5'- atgcggtgtgaaataccgcagatgcg-3' ve ters astar 5'- tagaggccccaaggttatgctag-3', yüksek kaliteli polimeraz ve şablon olarak pTD1-hyPBase plasmid kullanarak hyPBase ifade ka....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
HyPBase içeren T7 promotörünün ifadesi için bir yapı: polihedrin-5'UTR: hyPBase: polihedrin-3'UTR: poli (A) sinyali oluşturuldu (Şekil 1A) ve hyPBase mRNA in vitro sentezlemek için ~2.2 kb PCR parçası olarak yükseltildi (Şekil 1B). Daha sonra hyPBase mRNA üretildi ve agarose jel elektroforezise tabi tutuldu. Beklenen boyuttaki mRNA (~1,1 kb bant) %1 agarose jel üzerinde tespit edildi (Şekil 1C).
.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Transpozisyon oranının düşük olması ve transgenik bileşenleri taze embriyolara ulaştırmanın zorluğu, özellikle sipariş olan Lepidoptera'dan gelen birçok model olmayan böcekte germline dönüşümünün başarısını sınırlar. Germline dönüşüm oranını artırmak için, en yaygın kullanılan piggyBac transposase'nin (hyPBase) hiperaktif bir sürümü geliştirildi7,10. Bugüne kadar, lepidopteran böceklerde başarılı germline dönüşümü esas olarak model böcek ipekböceği, .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Rapor edilen araştırma Ulusal Bilim Vakfı I/UCRC tarafından desteklenmektedir, Eklembacaklı Yönetim Teknolojileri Merkezi, Grant No IIP-1821936 ve endüstri ortakları tarafından, Tarım ve Gıda Araştırma Girişimi Rekabetçi Hibe No. 2019-67013-29351 ve Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, ABD Tarım Bakanlığı (2019-67013-29351 ve 2353057000).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.5" Dental Pamuk Ruloları | PlastCare USA | 8542025591 | YETİŞTİRME |
| 1 oz Sufle Kabı Kapakları | DART | PL1N | |
| 1 oz Sufle Kapları | DART | P100N | YETİŞTİRME |
| 48 oz Plastik Şarküteri Kapları | Genpack | AD48 | YETİŞTİRME |
| Eklenti Filtre Seti (Yeşil) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | TARAMA |
| Borosilikat Cam | Sutter Aletleri | BF100-50-10 | ENJEKSİYON |
| Borosilikat Cam | SUTTER CİHAZI | BF-100-50-10 | |
| Diseksiyon Kapsamı | Nikon | SMZ745T | TARAMA |
| Tüy Siklet Forseps | BioQuip | 4750 | YETİŞTİRME |
| Oluk Koruması | ThermWell Ürünler | VX620 | YETİŞTİRME |
| Ters Çevrilmiş Mikroskop | Olympus | IX71 | ENJEKSİYON |
| Mikroenjektör | Narishige | IM-300 | ENJEKSİYON |
| Mikropipet Çektirme | Sutter Aletleri | P-1000 | ENJEKSİYON |
| Mikroskop Slaytları | VWR | 16004-22 | ENJEKSİYON |
| NightSea Tam Sistem NightSea | LLC | SFA-RB-DIM | Tarama |
| Azot Gazı | AWG/ Scott-Gross | NI 225 | ENJEKSİYON |
| Kağıt Havlu | Bounty | 43217-45074 | YETİŞTİRME |
| em>Spodoptera frugiperda Yapay Diyet | Southland Products, Inc | N/A [İstek Tür/Miktar] | YETİŞTİRME |
| em>Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [İstek Tür/Miktar] | YETİŞTİRME |
| Taq MasterMix | polimeraz karışımı |
Kaynaklar
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
