Method Article

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Bağırsak ve Kolonik Organoidlerin Üretimi, Bakımı ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/62721

⸱

July 9th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, insan pluripotent kök hücre kaynaklı ince bağırsak ve kolonik organoidlerin üretilmesi, sürdürülmesi ve karakterize edilmesi için ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Bu yöntemler, tekrarlanabilirliği artırmak, ölçeklenebilirliği genişletmek ve organoidlerin kaplanması ve geçirilmesi için gereken çalışma süresini azaltmak için tasarlanmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak bölgesel spesifikasyonu, gelişmekte olan gastrointestinal (GI) sistemin tanımlanmış alanlarına benzersiz morfoloji ve fonksiyonun verildiği bir süreci tanımlar. Bağırsaktaki bölgesel spesifikasyon, kemik morfogenetik protein (BMP) yolu da dahil olmak üzere çoklu gelişimsel yollar tarafından yönlendirilir. Normal bölgesel spesifikasyona dayanarak, insan embriyonik kök hücrelerini (hES) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (iPSC'ler) içeren insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) insan kolonik organoidleri (HCO'lar) üretmek için bir yöntem geliştirilmiştir. BMP sinyalinin üç günlük bir indüksiyonu, orta / arka bağırsak tüp kültürlerini, insan kolonunda bulunan tüm ana epitel hücre tiplerini ve birlikte gelişen mezenkimal hücreleri içeren özel AT açısından zengin dizi bağlayıcı protein 2 (SATB2) eksprese eden HCO'lara yeterince modeller. Bu kritik modelleme döneminde BMP'nin ihmal edilmesi (veya BMP inhibitörü NOGGIN'in eklenmesi) insan bağırsak organoidlerinin (HIO'lar) oluşumuna neden oldu. HIO'lar ve HCO'lar morfolojik ve moleküler olarak sırasıyla insan gelişmekte olan ince bağırsak ve kolona benzer. İnsan bağırsak gelişimini incelemek için HIO'ların ve HCO'ların faydasına rağmen, HIO'ların ve HCO'ların üretilmesi zordur. Bu makale, HIO'ları ve HCO'ları oluşturmak, sürdürmek ve karakterize etmek için yöntemler sunar. Ek olarak, protokoldeki kritik adımlar ve sorun giderme önerileri sağlanır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan kolon gelişimini incelemek, insan fetal dokusunun kullanımındaki kısıtlamalar nedeniyle zordur. Hayvan modelleri paha biçilmez olmuştur ve tarihsel olarak farelerde bağırsak gelişimini incelemek için genetik yaklaşımlar için kullanılmıştır. Bununla birlikte, fare ve insan bağırsak gelişimi arasındaki farklılıklar, farelerin bir model sistem olarak uygulanabilirliğini sınırlar. Örneğin, farelerin ince bağırsaklarında ve kolonunda kript oluşumu doğum sonrası meydana gelse de, insanlar tam olarak oluşmuş kriptlerle doğarlar1. Ayrıca, insan ince bağırsağı ve kolonu, ince bağırsaktamotilin (MLN) eksprese eden enteroendokrin hücreler 2 ve kolonda müsin 5B (MUC5B) eksprese eden goblet hücreleri 3,4 dahil olmak üzere farelerde bulunmayan hücre tiplerini içerir. Bu nedenle, kolon gelişiminin erken aşamalarını tanımlayan dinamik moleküler olayları doğru bir şekilde modelleyen bir hücre kültürü sistemine sahip olmak önemlidir. Bu nedenle, hPSC'leri kolon özelliklerine sahip hücreler üretmeye yönlendirmek, insan kolon gelişiminin incelenmesi için güçlü bir model sağlar.

hPSC'lerden bağırsak benzeri6 ve kolon benzeri organoidlerin7 tekrarlanabilir5, senkron ve verimli oluşumunu kolaylaştırmak için protokoller geliştirilmiştir. Bu protokoller, fetal bağırsak ve kolonun gelişimini taklit eden aşamalı bir farklılaşma prosedürü kullanır (Şekil 1). İlk olarak, kesin endoderm, bir Nodal taklitçisi olan Activin A ile muamele edilerek insan pluripotent kök hücrelerinden üretilir. Kesin endodermin yüksek seviyelerde WNT ve fibroblast büyüme faktörüne (FGF) maruz kalması, CDX2 + orta / arka bağırsak tüp sferoidlerine morfogenezi indükler. Midgut / hindgut sferoidleri daha sonra hücre dışı matrise (ECM) gömülür ve BMP sinyalinin geçici bir manipülasyonu yoluyla HIO'lara veya HCO'lara modellenir. NOGGIN kullanarak BMP sinyalini inhibe etmek veya tek başına büyüme ortamı eklemek, insan proksimal ince bağırsağına benzeyen HIO'ların oluşumuna neden olur.

BMP2 kullanılarak BMP sinyalini aktive ederek, orta/arka bağırsak sferoidleri, epitel ve mezenkim7'deki desenlenmeyi koruyan HCO'lara modellenir. HCO'lar kolonla zenginleştirilmiş, MUC5B eksprese eden goblet hücreleri içerir ve kolona özgü insülin benzeri 5 (INSL5) eksprese eden enteroendokrin hücreler üretme yeteneğine sahiptir. HCO'lardan izole edilen mezenşim, insan primer kolon mezenşimi8'de de eksprese edilen homeobox A13 (HOXA13) ve HOXD13'ü eksprese eder. Modelleme adımının, farklılaşma protokolünün 7-10. günlerinde gerçekleştiğini hatırlamak önemlidir. Bu üç günlük süre, uzun süreli in vitro kültürü takiben sürdürülen kolonik desenlenmeyi indüklemek için yeterlidir.

Aşağıda açıklanan protokoller, besleyici içermeyen hPSC kültürüne aşina olan araştırmacılar içindir. Bu tür hPSC kültürüne aşina olmayan araştırmacılar için, Cincinnati Çocuk Hastanesi'ndeki Kök Hücre Teknolojileri veya Pluripotent Kök Hücre Tesisi (PSCF) tarafından sunulanlar gibi hPSC'ler hakkında bir eğitim kursu önerilir. Başlangıç hPSC'lerinin kalitesi kritik öneme sahiptir ve tüm aşağı akış adımlarını etkileyebilir. Takip eden protokol, 4 gün boyunca büyütülen ve bölünmeye hazır olan hPSC'lerle başlayacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. İnsan bağırsağı ve kolonik organoidlerin oluşumu

  1. ECM kaplı plakaların hazırlanması
    1. 50 mL'lik konik bir tüpe 50 mL soğuk DMEM ortamı ekleyin.
    2. -4 °C dondurucudan 80x hESC onaylı ECM'nin bir kısmını ( Malzeme Tablosuna bakın) çıkarın ve buz üzerinde çözdürün.
      NOT: 4x stok hazırlamak için gereken ESC onaylı ECM hacmini belirlemek için ürünün analiz sertifikasına bakın.
    3. ESC onaylı ECM tam olarak çözülmezse, 50 mL konik tüpten 750 μL DMEM alın ve ECM ile karıştırın.
    4. DMEM/hESC onaylı ECM karışımını DMEM ile 50 mL konik tüpe aktarın ve iyice karıştırın. 4 x 24 oyuklu hücre kültürü plakalarının her birine oyuk başına 0.5 mL ekleyin.
    5. Tüm yüzeyin kaplandığından emin olmak için ECM'yi kuyuya eşit şekilde yaymak için plakaları sallayın. Parafilm kullanarak, ECM kaplı plakaları kapatın ve en az 1 saat boyunca bir biyogüvenlik kabininde oda sıcaklığında bırakın. ECM kaplı plakaları 4 °C'de 2 haftaya kadar veya ihtiyaç duyulana kadar saklayın.
  2. hPSC'nin tek hücreli kaplaması
    1. Oda sıcaklığına ulaşmasını sağlamak için ECM kaplı 24 delikli bir plakayı 30 dakika boyunca bir biyogüvenlik kabininin içine yerleştirin.
    2. mTeSR1 tam ortamı, hücre ayırma solüsyonunu ve gelişmiş DMEM'i 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve 30 dakika ısınmalarına izin verin.
    3. hPSC'lerin minimum farklılaşma ile en az %85 oranında birleştiğini doğrulayın. Gerekirse farklılaşmış hücreleri çıkarın.
    4. Kaplama ortamını 50 mL'lik konik bir tüpte aşağıdaki gibi hazırlayın: 13 mL mTeSR1 ve 13 μL 10 mM Y-27632 Rho ile ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü.
      NOT: Y-27632, anoikis'i inhibe eder ve tek hücrelerin hayatta kalmasını artırır.
    5. 6 oyuklu bir plakadan hücreleri toplamak için, ortamı 3 ila 4 oyuktan aspire edin ve kuyucuk başına 2 mL gelişmiş DMEM ile bir kez yıkayın.
    6. Gelişmiş DMEM'i aspire edin ve her bir oyuğa 1 mL hücre ayrışma solüsyonu dağıtın. Plakayı %5 CO2, 37 °C inkübatör içinde 5-7 dakika inkübe edin. Mikroskop altında hücrelerin süspansiyonda olup olmadığını kontrol edin.
    7. 5 mL'lik bir pipet kullanarak 4-5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek kalan hücre kümelerini ayırın.
    8. Her oyuğa 2 mL gelişmiş DMEM ekleyin, 4-5 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 × g'da döndürün.
    9. Hücre peletini aspire etmeden besiyerini tüpten aspire edin ve hazırlanan mTeSR1 artı ROCK inhibitörü ortamından 6 mL ekleyin. 3-4 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri nazikçe yeniden süspanse edin ve ardından süspansiyonu 50 mL'lik tüpün içindeki mTeSR1/ROCK inhibitör ortamının geri kalanına aktarın. 4-5 kez kuvvetlice tekrar askıya alın ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın.
    10. Hücreleri kaplamadan hemen önce ECM'yi 24 oyuklu plakadan aspire edin. 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri tekrar süspanse edin ve her oyuğa 0.5 mL hücre süspansiyonu dağıtın.
      NOT: Optimum kaplama yoğunluğunun deneyci tarafından belirlenmesi gerekir. Burada optimal hücre sayısı kuyu başına 80.000-200.000 hücredir.
    11. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı saat yönünde 3 kez, saat yönünün tersine 3 kez, 3 kez ileri ve geri ve 3 kez yan yana hafifçe sallayın.
    12. Plakayı 37 °C,% 5 CO2 inkübatöre aktarın ve 24 saat inkübe edin.
      NOT: Hücrelerin kuyucuklar içinde uygun şekilde dağılmasını sağlamak için ilk birkaç saat plakayı rahatsız etmeyin.
    13. 24 saat sonra (Şekil 2A), harcanan ortamı aspire edin, mTeSR1 oyuğu başına 0.5 mL ekleyin, 37 ° C'de tekrar inkübe edin, 24 saat boyunca% 5 CO2 (Şekil 2B) ve ardından bir sonraki adıma geçin.
  3. Kesin endodermin (DE) hPSC'lerden ayırt edilmesi
    1. 15 mL'lik konik bir tüpe, 13 mL Aktivin Gün 1 ortamı ( Malzeme Tablosuna bakınız), 13 μL 100 μg / mL Aktivin A ve 1.95 μL 100 μg / mL BMP4 ekleyin. Ortamı 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.
    2. mTeSR1 ortamını 24 oyuklu plakadan aspire edin ve oyuk başına 0.5 mL Aktivin Gün 1 ortamı ekleyin. Plakayı 37 °C,% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin ve 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra hücreleri kontrol edin.
      NOT: Şekil 2C'de gösterildiği gibi geniş hücre ölümü belirgin olmalıdır. Tek tabaka seyrek görünse de, hücre kolonileri genişlemiş olacaktır.
    3. 15 mL'lik konik bir tüpte 12.5 mL Aktivin Gün 2 ortamına 12.5 μL 100 μg / mL Aktivin A ekleyerek Aktivin Gün 2 tam ortamını hazırlayın. Tüpü 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
    4. 24 oyuklu farklılaşma plakasını CO2 inkübatörden çıkarın ve harcanan ortamı çıkarın. Kuyucuk başına 0.5 mL önceden ısıtılmış Activin Day 2 ortamını dağıtın ve plakayı 24 saat boyunca CO2 inkübatörünün içine geri yerleştirin.
      NOT: Ortamı dağıtırken dikkatli olunmalıdır. Ortamı doğrudan kuyu ortasına dağıtmayın, çünkü bu tek tabakadaki hücreleri ayıracaktır. Ortamı kuyunun kenarından dikkatlice dağıtın. Ertesi gün, ihmal edilebilir hücre ölümü ile tek bir hücre tabakası oluşur. Hücreler şimdi ~% 90 ila 95 birleşik olmalıdır (Şekil 2D).
    5. 15 mL'lik konik bir tüpte 12.5 mL Aktivin Gün 3 ortamına 12.5 μL 100 μg / mL Aktivin A ekleyerek Aktivin Gün 3 tam ortamını hazırlayın. Tüpü 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
    6. Harcanan ortamı çıkarın ve kuyucuk başına 0.5 mL Activin Day 3 ortamı dağıtın.
      NOT: Ortamı dağıtırken dikkatli olunmalıdır. Ortamı doğrudan kuyu ortasına dağıtmayın, çünkü bu tek tabakadaki hücreleri ayıracaktır. Ortamı kuyunun kenarından dikkatlice dağıtın. Ertesi gün, tek tabaka bu aşamada çok az hücre ölümü ile veya hiç hücre ölümü olmadan tam birleşmeye ulaşmalıdır. Activin Day 3 medium'u ekledikten 24 saat sonra tek tabaka birleşmezse, orta arka bağırsak sferoidleri oluşturmaya çalışmayın. Orta hindgut sferoidlerinin oluşumuna geçmeden önce DE tek tabakasının ideal morfolojisi için Şekil 2E'ye bakın.
    7. DE farklılaşmasını optimize ederken çatal başlı kutu A2 proteini (FOXA2) ve cinsiyet belirleyici bölge Y (SRY) kutusu transkripsiyon faktörü 17'nin (SOX17) ekspresyonu için tek tabakanın immünofloresan (IF) boyamasını gerçekleştirin.
  4. DE'nin orta arka sferoidlere farklılaşması
    1. 50 mL'lik konik bir tüpe, FGF4 (CHIR99021 yok) ile 25 mL orta hindgut indüksiyon ortamı ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
    2. Tam orta hindgut indüksiyon ortamını hazırlamak için, ortam ısındıktan sonra 7,5 μL CHIR99021 ekleyin.
    3. Harcanan ortamı çıkarın, oyuk başına 0.5 mL orta arka bağırsak indüksiyon ortamı dağıtın ve 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2'de inkübe edin.
    4. Ertesi gün tek tabaka içindeki hücrelerin yoğunlaşması meydana geldikten sonra (Şekil 3A), harcanan ortamı taze orta arka bağırsak indüksiyon ortamı ile değiştirin ve plakayı 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöre geri yerleştirin.
      NOT: Boru şeklindeki yapılar, Şekil 3B'de gösterildiği gibi, 48 saatlik orta arka bağırsak indüksiyonundan sonra fark edilecektir. Orta arka bağırsak sferoidleri, Şekil 3C'de gösterildiği gibi 3. günde tek tabakadan tomurcuklanmaya başlayacaktır.
    5. Ortamı değiştirirken yüzen sferoidlerin atılmasını önlemek için, eski ortamı 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 300 × g'da 1 dakika santrifüjleyin. Sferoidleri 12.5 mL taze orta hindgut indüksiyon ortamında yeniden süspanse edin, aynı 24 oyuklu plakaya oyuk başına 0.5 mL ekleyin ve 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO2'de inkübe edin.
    6. Hindgut indüksiyonunun 4. gününde (Şekil 3D), ortamı 15 mL'lik bir tüpe toplayarak ve ardından 1 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyerek plaka kuyucuklarından yüzen sferoidleri hasat edin. ECM'ye orta arka bağırsak sferoidlerini gömmek için bir sonraki adıma geçin.
  5. ECM'de orta/arka sferoidlerin kaplanması ve modellenmesi
    1. Gömmeden önce ECM bazal membran matrisini gece boyunca 4 °C'de çözdürün.
      NOT: Bu ECM, hESC onaylı ECM'den farklıdır. ECM buz üzerine konulmalıdır ve uygun hacimde ECM, buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarılabilir. Tablo 1 , ECM hacmi hakkında bilgi içerir. Sferoidlerin gömüleceği damlacıkta ECM hacminin en az %75 olduğundan emin olun.
    2. 24 oyuklu bir plakayı 37 ° C'lik bir inkübatörde ısıtın.
    3. 1000 μL'lik bir pipet kullanarak 24 oyuğun tümünden yüzen sferoidleri toplayın ve bunları 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Sferoidleri oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Ortamın çoğunu aspire edin, ancak kaplama için gereken hacmi bırakın (Tablo 1).
    4. 1000 μL ve 200 μL pipet uçlarını uçlarını keserek hazırlayın. Önceden ısıtılmış 24 oyuklu plakayı çıkarın.
    5. Yüzen sferoidleri karıştırın, uygun hacmi buz üzerine yerleştirilmiş ECM tüpüne aktarın ve ardından sferoidleri ve ECM'yi iyice karıştırmak için pipetleyerek yeniden süspanse edin.
    6. Kesilmiş 200 μL pipet uçları ile sferoid ve ECM karışımından 65 μL alın ve 24 oyuklu plakadaki her bir oyuğun ortasına yükleyin. İyi bir ECM damlacığı oluştuğundan emin olmak için, karışım dağıtılırken pipeti nazikçe ve yavaşça kaldırın.
      NOT: Plaka kuyu başına 30-100 sferoid.
    7. Plakayı yavaşça 37 °C,% 5 CO2 inkübatöre aktarın ve 5 dakika inkübe edin.
    8. Plakayı ters çevirin ve 15-25 dakika inkübe edin, bu ECM damlacıklarının kubbe benzeri bir yapıyı korumasına yardımcı olacaktır.
    9. Kuluçka sırasında gerekli ortamı hazırlayın ve ısıtın. ECM katılaştıktan sonra, her bir oyuğa 0,5 mL HIO veya HCO desenli ortam ekleyin ve 37 ° C,% 5 CO2'de inkübe edin. ECM'deki sferoidlerin bir görüntüsü için Şekil 3E'ye bakın.
    10. Sferoidleri 3 gün boyunca desen ortamında kültürleyin.
    11. 3 gün sonra, HIO veya HCO modelleme ortamını normal büyüme ortamına değiştirin ve 37 ° C,% 5 CO2'de inkübe edin.
      NOT: Bu zaman noktasındaki (10. gün) organoidler erken evre organoidlerdir. Proje hedefine bağlı olarak, bölüm 2'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, bazı erken aşama organoidler erken modelleme analizi için kullanılabilir.
  6. İnsan bağırsağı ve kolonik organoidlerin büyümesi ve geçmesi
    1. 10. günden sonra, büyüme ortamını her 3 günde bir değiştirin.
      NOT: Kaplama yoğunluğuna ve organoidlerin büyümesine bağlı olarak, daha sık ortam değişiklikleri gerekebilir. Ortamdaki fenol kırmızısı (pH indikatörü) sarı hale gelmeden önce ortam değişiklikleri yapılmalıdır.
    2. Organoidleri 21. güne kadar inkübe edin (Şekil 3F).
      NOT: BMP2 tedavisi, sferoidlerden büyüyen organoidlerin sayısının azalmasına (HIO'lardan ~ 3 kat daha az) neden olacaktır. Bu nedenle, HCO'ların üretilmesi için daha fazla sayıda sferoidin kaplanması gerekir.
  7. 21. günde organoidlerin bölünmesi
    1. Organoidleri inceleyin.
      NOT: Organoidlerin 21. günde bölünmesi gerekir, çünkü organoid büyümesi ve genişlemesi nedeniyle ECM 21. günde neredeyse bozulur.
    2. 1000 μL ve 200 μL pipet uçlarını uçlarını keserek hazırlayın.
    3. 24 oyuklu bir Nunc plakasını 37 ° C'lik bir inkübatörde ısıtın.
    4. Uygun ECM hacmini önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik tüplere alın (Tablo 1).
    5. ECM damlacığını 1000 μL'lik bir pipet ucuyla organoidlerle nazikçe kazıyın ve ECM'yi parçalamak için karışımı birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
    6. Karışımı 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın ve organoidleri mikroskop altında kontrol edin. Gerekirse, steril forseps kullanarak organoidleri birbirinden ayırın. Ayrılmanın organoidlerin epiteline zarar vermediğinden emin olun.
    7. Organoidleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 30 saniye boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve tüpte ~ 1 mL ortam bırakın.
      NOT: Ortamın hacmi, deneyin amacına göre değiştirilebilir. ECM damlası başına daha fazla organoid gerekiyorsa, orta hacim azaltılabilir. Bununla birlikte, daha az organoid gerekiyorsa, orta hacim arttırılabilir.
    8. Organoidleri iyice karıştırın, uygun hacmi buz üzerine yerleştirilmiş ECM tüpüne aktarın ve ardından organoidleri ve ECM'yi iyice karıştırmak için pipetleyerek yeniden süspanse edin.
    9. Kesilen 200 μL'lik pipet uçlarını kullanarak 24 oyuklu plakanın her bir oyuğunun ortasına 65 μL sferoid ve ECM karışımı ekleyin.
      NOT: Pipetleme sırasında önce organoidleri ve ardından ECM'yi almak çok önemlidir. Böylece, karışımı dağıtırken, organoidler ECM damlacığının en üstünde yer alır.
    10. Plakayı 37 °C,% 5 CO2 inkübatöre 5 dakika boyunca koyun.
    11. ECM damlacıklarının kubbe benzeri bir yapıyı korumasına yardımcı olmak için plakayı 15-25 dakika daha ters çevirin.
    12. Her oyuğa 0.5 mL HIO / HCO büyüme ortamı ekleyin ve 37 ° C,% 5 CO2'de inkübe edin.
      NOT: Büyüme ortamı, modellemeden sonra hem HIO'lar hem de HCO'lar için aynıdır.
    13. Ortamı 35. güne kadar her 2-3 günde bir değiştirin (Şekil 3G).

2. Ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile organoidlerin desenlenmesinin doğrulanması

  1. RNA'yı toplamadan önce, üreticinin talimatlarını izleyerek 1x RNA lizis tamponu hazırlayın.
  2. Harcanan ortamı atın ve 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 350 μL lizis tamponu ekleyin. 1 mL'lik bir pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek organoidleri parçalayın. Daha iyi lizis için, 5 saniye boyunca maksimum hızda kısa bir süre girdap.
  3. RNA ekstraksiyonu için hazır olana kadar tüm numuneleri -80 °C'de tutun. Hazır olduğunda, RNA örneklerini -80 °C dondurucudan çıkarın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde çözdürün. Numunelerin tamamen parçalanmasını sağlamak için tüpleri oda sıcaklığında 10-15 dakika kuvvetlice vorteksleyin.
  4. Numuneleri tekrar buzun üzerine yerleştirin ve üreticinin talimatına göre RNA ekstraksiyonuna devam edin. Bir sonraki adıma geçmeye hazır değilseniz, RNA örneklerini -80 °C'lik bir dondurucuya aktarın.
  5. Standart metodolojiyi kullanarak RNA ekstraksiyonu, DNAse tedavisi, cDNA sentezi ve RT-qPCR gerçekleştirin. Primer adlarının ve dizilerinin bir listesi için Tablo 2'ye bakın.

3. İmmünofloresan ile organoidlerin desenlenmesinin doğrulanması

  1. Organoidlerin toplanması ve fiksasyonu
    1. Uygun kuyucuklardan HIO veya HCO ortamını aspire edin ve her oyuğa 1 mL buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak organoidleri ECM'den ayırın. ECM'nin büyük parçalarını organoidlerden ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
    2. Organoidleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve tüpün geri kalanını buz gibi soğuk PBS ile doldurun ve tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın. Organoidlerin yerçekimi ile yerleşmesine ve PBS'yi aspire etmesine izin verin.
      NOT: Organoidler yerçekimi ile çökelmezse, 300 × g'da 1 dakika santrifüjleyin.
    3. PBS'yi aspire edin ve 1 mL buz gibi soğuk ECM bozundurucu solüsyon ekleyin. Tüpü hafifçe çalkalayarak dönen bir platform üzerinde 10-15 dakika buz üzerinde tutun.
      NOT: Organoidlerin ve Hücre Kurtarma Solüsyonunun uygun şekilde karıştırılmasını sağlamak için tüpü 45 ° 'lik bir açıyla eğin. 10-15 dakika sonra, organoidler tüpün dibine çökmelidir, bu da ECM'nin tam sindirimini gösterir.
    4. Tüpe 15 mL'ye kadar soğuk PBS ekleyin; Tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın. Organoidler tüpün dibine çöktüğünde, PBS'yi aspire edin ve organoidleri sabitlemek için 1 mL önceden soğutulmuş% 4 paraformaldehit ekleyin. Organoidleri% 4 paraformaldehit ile buz üzerinde 1 saat inkübe edin.
    5. Tüpün geri kalanını buz gibi soğuk PBS ile doldurun ve gece boyunca 4 °C'de sallanan bir platforma yatay olarak yerleştirin. Ertesi gün, paraformaldehit/PBS'yi belirtilen atık kabına atın ve adım 3.1.2'de açıklandığı gibi 15 mL buz gibi soğuk PBS ile bir kez yıkayın.
    6. PBS'yi aspire edin ve tüpü PBS'de% 30 sükroz ile doldurun. Tüpü gece boyunca 4 °C'de sallanan bir platform üzerine yatay olarak yerleştirin.
    7. Ertesi gün, organoidleri OCT ortamı ile 7 mm x 7 mm x 5 mm'lik bir temel modele gömün ve kuru bir buz / etanol banyosu kullanarak hızlı dondurma yapın.
    8. Blokları laboratuvar mendilleriyle kurulayın, bir kağıt havluya sarın ve gece boyunca -80 °C dondurucuda saklayın. Ertesi gün, bir kriyostat kullanarak mikroskop slaytları üzerine 5 μm'lik kesitler kesin. Slaytları -80 °C'de saklayın.
  2. Organoidlerin immünofloresan boyanması
    1. Slaytları -80 °C dondurucudan işleyin ve standart protokolleri kullanarak IF boyama yapın.
    2. Lamellere lamel uygulayın ve görüntülemeden önce en az 2 saat veya gece boyunca ışıktan koruyarak oda sıcaklığında kurutun.
    3. Konfokal mikroskobun 25x objektifini kullanarak slaytları görüntüleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orta/arka bağırsak indüksiyon aşaması sırasında başarılı sferoid üretimi, başarılı modellemenin göstergesidir. Desenlemenin doğru olduğunu doğrulamak için yüzen sferoidlerde ve tek katmanda CDX2 için IF boyama gerçekleştirin. Kesin endoderm (DE) aşamasında boyama, DE indüksiyonunun etkinliğini gösterebilse de, verimli DE indüksiyonu olmadan sferoid üretimi mümkün değildir. DE indüksiyonunun etkinliğini test etmek için, FOXA2 ve SOX17 için IF boyama ve/veya RT-qPCR gerçekleştirin.

Modelleme aşa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hPSC'lerin HIO'lar ve HCO'lar olarak ayırt edilmesi, her adımda kalite kontrolleri gerektiren karmaşık bir süreçtir. Başlangıç hPSC'lerinin DE'ye farklılaşmayı başlatmadan önce minimum farklılaşmaya sahip olması gerekir. DE farklılaşması için kaplanan hPSC'lerin yoğunluğunu optimize etmek, protokolün başarısı için kritik öneme sahiptir. DE farklılaşmasının kalitesini sağlamak için, DE farklılaşmasının verimliliğini belirlemek için FOXA2 ve SOX17 için IF gerçekleştirin. DE farklılaşması, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Múnera laboratuvarı, NIH / NCI 5U54CA210962-02 Güney Carolina Kanser Eşitsizlikleri Araştırma Merkezi (SC CADRE), NIH / NIGMS P20 GM130457-01A1 Sindirim ve Karaciğer Hastalığında COBRE ve NIH / NIDDK 1P30 DK123704-01 MUSC Sindirim Hastalığı Araştırma Çekirdek Merkezi tarafından finanse edilmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
%1 Sığır serum albümini (BSA) solüsyonuYOKYOKYOK
15 mL Corning tüpüDoğan21008-918YOK
%30 SükrozYOKYOKPBS'de yapılmıştır.
%5 Normal eşek serumuJackson İmmünoaraştırma Laboratuvarı017-000-121YOK
50 mL Corning tüpüDoğan21008-951YOK
AccutaseTermo BilimselA1110501Hücre dekolmanı çözümü; 5 mL Accutase'i 10 mL'lik tüplere toplam 20 tüpe ayırın ve -20 °'de saklayın; 6 aya kadar C. 4 ° C kullanmadan önce bir gece bekletin.
Aktivasyon AHücre yönlendirme sistemleriGFH6-100x10Liyofilize tozu 100 µ'da yeniden oluşturun; %0.1 sığır serum albümini (BSA) içeren steril PBS'de g/mL. Aliquot 38 µ Activin A'nın L'sini önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüplerine koyun ve -80 ° C (Tüplerin süresi, alındığı tarihten itibaren 12 ay sonra sona erer).
Activin 1. gün orta (RPMI 1640)CorningMT10041CVEsansiyel olmayan amino asitler (NEAA, Corning 11140050) kullanın ve 4 &dereceC'de saklayın. Temel 1. gün ortamı: 500 mL RPMI 1640 ve 500 mL NEAA. Activin Day 1 medium'u hazırlarken, 13 mL temel day 1 medium, 13 µ l Activin A (100 µ g/mL) ve 2 µ l BMP4 (100 µ g/mL). Baz besiyeri 3 haftaya kadar stabildir ancak büyüme faktörlerinin eklenmesinden hemen sonra kullanılmalıdır.
Activin 2. gün orta (RPMI 1640, %0,2 FBS hacim/hacim)Hidrolik klonSH30070.03TEsansiyel olmayan amino asitler (Corning 11140050) kullanın ve 4 °C'de saklayın. Temel 2. gün ortamı: 500 mL RPMI 1640, 500 mL NEAA ve 1 mL %0.2 serum. Activin Day 2 medium'u hazırlarken, 12.5 mL temel day 2 medium ve 12.5 µ ekleyin; Activin A'nın L (100 &mikro; g/mL). Baz besiyeri 3 haftaya kadar stabildir ancak büyüme faktörlerinin eklenmesinden hemen sonra kullanılmalıdır.
Activin 3. Gün orta (RPMI 1640, %2 FBS hacim/hacim)Hidrolik klonSH30070.03TEsansiyel olmayan amino asitler (Corning 11140050) kullanın ve 4 °C'de saklayın. Temel 3. gün ortamı: 500 mL RPMI 1640, 500 mL NEAA ve 10 mL %2 serum. Activin Day 3 medium'u hazırlarken, 12.5 mL temel day 3 ve 12.5 µ ekleyin; Activin A'nın L (100 &mikro; g/mL). Baz besiyeri 3 haftaya kadar stabildir ancak büyüme faktörlerinin eklenmesinden hemen sonra kullanılmalıdır.
Alexa Fluor 488 Eşek Anti-KeçiTermo BilimselA11055 Serisi1:500 seyreltme (İkincil antikor)
Alexa Fluor 488 Eşek anti-TavşanTermo BilimselA21206 Serisi1:500 seyreltme (İkincil antikor)
Alexa Fluor 546 Eşek anti-FareTermo BilimselA10036 Serisi1:500 seyreltme (İkincil antikor)
Alexa Fluor 647 Eşek anti-FareTermo BilimselA31571 Serisi1:500 seyreltme (İkincil antikor)
Temel kalıpBalıkçı22-363-552YOK
Temel bağırsak ortamı (ileri DMEM)Gibco12491015  Temel bağırsak ortamını hazırlarken, 2 mM L-Glutamin (Corning A2916801), 500 mL 100 U/mL Penisilin-Streptomisin (Gibco 15-140-122) ve 7.5 mL elde etmek için 500 mL DMEM, 500 mL N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL B27 (Gibco), 500 mL L-Glutamin ekleyin; 1 M HEPES, 15 mM HEPES almak için.  Baz besiyeri 3 haftaya kadar stabildir ancak büyüme faktörlerinin eklenmesinden hemen sonra kullanılmalıdır.
Biorad CFX96 Dokunmatik Gerçek Zamanlı PCR Tespit SistemiBiorad HakkındaYOKDiğer qRT-PCR sistemleri kullanılabilir.
Hücre Geri Kazanım ÇözümüCorning354253ECM'yi bozan çözüm
CHIR99021Yeniden Hücre400041010 mM'de 2.15 mL DMSO ekleyerek sulandırın. 50 µ hazırlayın; L alikotları ve -20 &dereceC.  Tozu 4 ° C, ışıktan korunuyor.
CTRL HIO desen oluşturma ortamıYOKYOKTemel bağırsak ortamı ve 100 ng/mL EGF.
DAPISigma-AldrichD9542 Serisi1:100 seyreltme (İkincil antikor)
DE tek katmanlıYOKYOKTek katman önceki adımlarda oluşturuldu (Bölüm 4.4).
DağıtmakGibco17105041Liyofilize tozu Gelişmiş DMEM'de (Gibco MT15090CV) 1 mg/mL nihai konsantrasyona kadar yeniden süspanse edin. Bir Millipore filtre sterilizasyon tüpü kullanarak vakumlayarak sterilizasyon için çözeltiyi filtreleyin. 10 mL alikot (1 mg/mL) yapın ve -20 ° 6 aya kadar C. 4 ° C kullanmadan önce bir gece bekletin.
EGFTermo Bilimsel236-EG-01M100 ng/mL EGF hazırlarken 500 µ g/mL steril PBS'de. Daha sonra 1 mg EGF'ye 2 mL steril PBS ekleyin ve 500 µ g/mL EGF çözeltisi. Aliquot 100 µ 20 tüpte L EGF.
Fisherbrand 6 cm Şeffaf Kapaklı Petri KaplarıBalıkçıFB0875713AYOK
Fisherbrand Hücre KaldırıcıBalıkçı08-100-240YOK
Fisherbrand Sınıf B Şeffaf Cam Dişli Şişeler, Kapaklar TakılıBalıkçı03-338BYOK
Fisherbrand Tek Kullanımlık Borosilikat Cam Pastör PipetBalıkçı13-678-2D0YOK
Floromount G Kızak Montaj OrtamıVWR100241-874YOK
Gibco gelişmiş DMEMGibco12-491-023YOK
Keçi anti-E-CadherinR& D sistemleriAF648 Serisi1:400 seyreltme (Birincil antikor)
Keçi anti-SOX17R& D sistemleriAF19241:500 seyreltme (Birincil antikor)
HCO'lar modelleme ortamıYOKYOKTemel bağırsak ortamı, 100 ng/mL EGF ve 100 ng/mL BMP2. BMP2 hazırlarken, BMP2 şişelerine (100 &mikro; g). Alikot 25 &mikro; 4 tüpte BMP4 çözeltisi L.  Baz besiyeri 3 haftaya kadar stabildir ancak büyüme faktörlerinin eklenmesinden hemen sonra kullanılmalıdır.
HemositometreSigma-AldrichZ359629YOK
İnsan Pluripotent Kök Hücreleri (hPSC)Pluripotent Kök Hücre TesisiYOKMatrigel kaplı 24 oyuklu bir plakaya ekilen hücreler (Thermo Scientific 73520-906).
Buz gibi soğuk %4 Paraformaldehit çözeltisi (PFA)YOKYOKYOK
Buz gibi Fosfat Tamponlu Salin (PBS)YOKYOKpH 7.4 olmalıdır.
ImmEdge Hidrofobik Bariyer KalemiVektör Laboratuvarları101098-065YOK
İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücreler (iPSC'ler)Pluripotent Kök Hücre Tesisi (Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi)YOKDiğer hESC veya iPSC hatları kullanılabilir, ancak protokolün her hücre hattı için optimize edilmesi gerekir.
Leica mikrotomuYOKYOKYOK
LSM 880 SerisiKonfokal mikroskop
Matrigel Bazal Membran MatrisiCorning354234YOK
Matrigel hESC onaylı MatrisCorning3542774 x 6 oyuklu tabaklar için yeterli seyreltilmiş Matrigel yapmak için yeterli hacimlere karşılık gelen 4 x Matrigel alikotları hazırlayın.
Orta arka bağırsak indüksiyon ortamı (RPMI 1640)CorningMT10041CVEsansiyel olmayan amino asitler (Corning 11140050), %2 FBS hacim/hacim (Hyclone SH30070.03T), 3 &mikro; M CHIR99021 ve 500 ng/mL FGF4. Baz besiyeri 3 haftaya kadar stabildir ancak büyüme faktörlerinin eklenmesinden hemen sonra kullanılmalıdır.
Orta arka bağırsak sferoidleriYOKYOKYOK
MilliporeSigma Steriflip Steril Tek Kullanımlık Vakum Filtre ÜniteleriMilliporeSigmaSCGP00525YOK
Fare anti-CDX2BiyogeneksMU392-UC1:300 seyreltme (Birincil antikor)
Fare anti-FOXA2Abnova/NovusH00003170-M011:500 seyreltme
mTeSR1 tam büyüme ortamıKök Hücre teknolojileri85870Kontaminasyonu önlerken bir 400 mL mTeSR ortamına (85870) 100 mL mTeSR takviyesi (85870) ve 50 mL'lik tüplere alikot ekleyin. 4°'de saklayın; C kullanana kadar.
Murray'in Clear çözümü (BABB olarak da bilinir)Murray'inYOK1:2 benzil benzoat ve benzil alkol.
NOG HIO desen ortamıYOKYOKTemel bağırsak ortamı, 100 ng/mL EGF ve 100 ng/mL NOGGIN (Dağıtım 25 &mikro; 250 µ'da g NOGGIN; l %0.1 BSA ile steril PBS).
NükleoSpin RNA'sıTakara740955.25Diğer RNA izolasyon kitleri kullanılabilir.
Nunclon delta yüzey doku kültürü kabı 24 kuyucuklu (Nunc)Termo Bilimsel73521-004YOK
Matrigel ile kaplanmış Nunclon delta yüzey doku kültürü kabı 24 oyukluTermo Bilimsel73521-004YOK
Nunclon delta yüzey doku kültürü kabı 6 kuyucuklu (Nunc)Termo Bilimsel73520-906YOK
Nunclon delta yüzey doku kültürü kabı 6-kuyu kaplamalı  Matrigel.Termo Bilimsel73520-906YOK
HIO'lar, CTRL HIO'lar ve HCO'lar için büyüme ortamıYOKYOKTemel bağırsak ortamı ve 100 ng/mL EGF (Nihai konsantrasyon)
Fosfat Tampon Salin, %0,5 Triton X (PBS-T)YOKYOKYOK
AstarEntegre DNA Teknolojileri A.Ş. (IDT)YOKPrimerler protokoldeki Tablo 2'de listelenmiştir.
Tavşan anti-CDX2Hücre MarkasıEPR22764Y1:100 seyreltme (Birincil antikor)
Tavşan anti-SATB2Hücre MarkasıEP281 Serisi1:100 seyreltme (Birincil antikor)
Rekombinant İnsan BMP-4 ProteiniR& D sistemleri314-BP-010Liyofilize tozu 100 µ'da yeniden oluşturun; g/mL, %0.1 sığır serum albümini (BSA) içeren steril 4 mM HCl'de. 45.83 mL moleküler suya 4.17 mL HCl çözeltisi ekleyin, toplamda 50 mL 1 M HCl. Sonra 200 µ ekleyin; L 1 M HCl ila 49.8 mL moleküler dereceli su, toplam 50 mL 4 mM HCl'ye eşittir. Daha sonra 50 mL 4 mM HCl'ye 0,05 g BSA ekleyin ve steril hale getirmek için süzün. Aliquot steril 4 mM HCl %0.1 BSA'dan 33 mikrosantrifüj tüpüne toplam ve -20 &derece; l steril 4 mM HCl %0.1 BSA BMP4 şişelerine (10 &mikro; g) 100 µ'da BMP4 çözeltisi yapmak; g/mL.
Rekombinant İnsan FGF-4 ProteiniR& D sistemleri235-F4-01M100 µ'da yeniden oluşturun; % 0.1 sığır serum albümini içeren steril PBS'de g / mL. %0.1 BSA yapmak için 50 mL PBS'ye 0.05 g BSA ekleyin. Filtre 0.22 µ BSA'yı sterilize etmek için M BSA. 5 tüpte 10 mL %0.1 BSA alikot. 10 mL steril %0.1 BSA içine 1 mg FGF-4 ekleyin. Aliquot 250 µ L'yi önceden soğutulmuş 40 mikrosantrifüj tüpüne koyun ve -80 &dereceC'de saklayın.
ROCK inhibitörü Y-27632Tocris Hakkında1254Nihai konsantrasyon 10 mM'dir (10 mmol/L). DMSO'da 10 mM'de tekrar süspanse edin ve filtre sterilize edin. Her şişeye 3 mL steril PBS ekleyin. Aliqout 100 µ 30 tüpte L ROCK inhibitörü ve -20 &dereceC'de saklayın.
SuperScript VILO cDNA Sentez KitiTermo Bilimsel11-754-250YOK
SuperFrost Plus mikroskop slaytları
Tissue Tek O.C.T BileşiğiVWR25608-930YOK

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress. Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).
  2. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).
  3. van Klinken, B. J., et al. MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells. American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).
  4. Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression. Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).
  5. Lau, S. T., et al. Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses. Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).
  6. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  7. Munera, J. O., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling. Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).
  8. Higuchi, Y., et al. Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts. PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).
  9. Yahagi, N., et al. Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract. Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).
  10. Sarvestani, S. K., et al. Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity. Nature Communications. 12 (1), 262(2021).
  11. Holloway, E. M., et al. Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells. Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).
  12. Britanova, O., et al. Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex. Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).
  13. Jaitner, C., et al. Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system. Elife. 5, 17361(2016).
  14. Teo, A. K., et al. Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells. Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).
  15. Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
  16. Tamminen, K., et al. Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1. PloS One. 10 (7), 0134551(2015).
  17. Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).
  18. Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).
  19. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
  20. Jung, K. B., et al. Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids. Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).
  21. Woo, D. H., et al. Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita. Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).
  22. Sommer, C. A., et al. Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells. PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).
  23. McCauley, H. A., et al. Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport. Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).
  24. Zhang, X., et al. A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development. Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).
  25. Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pluripotent Stem CellsIntestinal OrganoidsColonic OrganoidsHuman Intestinal OrganoidsHuman Colonic OrganoidsBMP SignalingRegional SpecificationSATB2 ExpressionEpithelial Cell TypesMesenchymal Cells

Related Articles