Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Summary

Burada, larva evresi 4 C. eleganlardan aktif nükleer özü izole etmek ve transkripsiyon aktivitesini bir in vitro sistemde görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Abstract

Caenorhabditis elegans, 1963 yılında piyasaya sürüldüldüklerinden beri biyolojik araştırmalar için önemli bir model sistemidir. Bununla birlikte, C. elegans, in vitro transkripsiyon ve DNA replikasyon gibi nükleer özlerini kullanarak biyolojik reaksiyonların biyokimyasal çalışmasında tam olarak kullanılmamıştır. Biyokimyasal çalışmalarda C. elegans'ı kullanmanın önemli bir engeli, nükleer özün aktivitesini feda etmeden nematodun kalın dış kütikülünü bozuyor. Kıtkeni kırmak için Dounce homojenizasyon veya sonication gibi çeşitli yöntemler kullanılırken, genellikle protein kararsızlığına yol açarlar. Aktif nükleer proteinlerin in vitro reaksiyonlar için larva veya yetişkin C. eleganlardan izole edilmesi için belirlenmiş bir protokol yoktur. Burada protokol, larva evresi 4 C. eleganların balç homojenizatörü kullanılarak homojenizasyonunu ayrıntılı olarak açıklar. Balch homojenizatör, hayvanları bu süreçte kütikülleri kıran dar bir boşluktan yavaşça zorlamak için basınç kullanır. Balch homojenizatörün düzgün tasarımı ve hassas işlenmesi, deneyler arasında hayvanların tutarlı bir şekilde taşlanmasına izin verir. Balch homojenizatörden elde edilen homojenatın fraksiyone edilmesi, C. eleganların transkripsiyon aktivitesini test etmek için bir in vitro yöntemde kullanılabilecek işlevsel olarak aktif nükleer ekstrakt sağlar.

Introduction

Küçük, serbest yaşayan nematod Caenorhabditis elegans , çok çeşitli biyolojik soruları ele almak için basit ama güçlü bir model organizmadır. 1963'te piyasaya sürülmesinden bu yana, nematodlar nörobiyoloji, metabolizma, yaşlanma, gelişim, bağışıklık ve ^genetik1 sorularını yanıtlamak için paha biçilmez olmuştur1. Hayvanın ideal bir model organizma olmasını sağlayan birçok özelliğinden bazıları arasında kısa nesil süre, RNA parazitinin etkinliği, şeffaf vücut ve hem hücresel soyunun hem de sinir sisteminin tamamlanmış haritaları bulunur.

Nematodun bilime katkıları çok büyük olsa da, ökaryotik transkripsiyon si....

Protocol

1. Medya hazırlıkları

1. Üreticinin talimatlarına uyarak steril lysogeny et suyu (LB) agar plakaları ve sıvı ortam hazırlayın.
2. Çizgi Escherichia coli (E. coli) bir LB agar plakası üzerinde OP50 suş. Bakteri çizgisini bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
3. E. coli OP50 çizgi plakasını kuluçkadan sonra 4 °C'de saklayın. E. coli OP50 plaka, nem kaybını önlemek için parafilme sarılırsa 2 hafta boyunca 4 °C'de güvenle saklanabilir.
4. Tablo 1'deki tarifi kullanarak 2 L Nematod Growth Media (NGM) hazırlayın.
   NOT: Nystatin isteğe bağlıdır. Nystatin, KÜFün ve diğer mantar kontaminasyonla....

Results

Özetlenen adımların ardından fonksiyonel nükleer ekstrakt (Şekil 1) verilmelidir, taşlama veya yıkama adımlarındaki sapma zayıf aktiviteye veya düşük verime yol açabilir. Fonksiyonel C. elegans nükleer özü elde edilirse, daha önce açıklanan in vitro teste eklendiğinde CMV promotörünün bölgesini DNA şablonuna aşağı doğru yazıya dökecektir. Elde edilen RNA transkript, geleneksel yöntemler kullanılarak nükleer proteinlerden ve DNA şablonundan .......

Discussion

C. elegans , düşük maliyetli bakımı ve genetik manipülasyon kolaylığı nedeniyle ökaryotik transkripsiyon sistemini incelemek için çekici bir model organizmadır. Burada L4 C. elegans fonksiyonel olarak aktif nükleer özün tutarlı izolasyonu için bir protokol açıklanmıştır. Bu protokol transkripsiyon etkinliğini görselleştirmeye odaklansa da, transkripsiyon aktivitesinin daha hassas bir ölçümünü elde etmek için transkripsiyon sonrası üretilen cDNA RT-qPCR kullanılarak ^{ölçülebilir8}. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
< güçlü > Sarf malzemeleri ve reaktifler< / güçlü >
0,2 mL 8 Şeritli Tüpler ve Düz Şerit Kapaklar, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Bireysel PCR tüpleri	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL steril mikrotüpler	Genesee Scientific	24-282S
% 100 mutlak moleküler sınıf etanol	Fisher Scientific	BP2818
%100 etanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serolojik pipet	VWR uluslararası	89130-898
150 mm petri plakaları	Tritech Research	T3325
15 mL konik santrifüj tüpleri	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastik şırınga	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject şırınga	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vakumlu filtre kabı 0.22 &mikro; m PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL konik santrifüj tüpleri	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serolojik pipet	VWR international	89130-902
5 mL serolojik pipet	VWR uluslararası	89130-896
Ağar, Kriter	VWR Uluslararası	C7432
Agaroz	Denville Bilimsel	CA3510-6
Alkol geçirmez işaretleyici	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR Uluslararası	90000-264
Caenorhabditis elegans< / em >	CGC	N2
Kalsiyum diklorür	Millipore Sigma	ve nbsp; C4901
Kolesterol	Kırlangıç Sigma	C8667
Kontrol DNA tapınağı klonlama primerleri, İleri 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'
Kontrol DNA tapınağı klonlama primerleri, İleri 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'
Deiyonize su
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA jel boyası, SYBR güvenli	Invitrogen	S33102
DNA merdiven karışımı, O' gen cetveli	Fisher Scientific	SM1173
DNA Yükleme Boyası, 6x TriTrack	Fisher Scientific
DNase, Taban Çizgisi-SIFIR	Lucigen
Kuru buz
Escherichia coli< / em> OP50 suşu	CGC	OP50
Buzlu asetik asit	Fisher Scientific	A38
Gliserol	Kırlangıç Sigma	G6279
HeLa nükleer ekstrakt in vitro transkripsiyon sistemi, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Çözeltisi, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hidroklorik asit% 37	Millipore Sigma	P0662
Hipoklorit ağartıcı	Clorox
LB Et Suyu	Millipore Sigma	L3022
Magnezyum diklorür	Millipore Sigma	M8266
Magnezyum Sülfat	Millipore Sigma	M7506
Orta ağırlıkta bulaşıklar	Fisher Scientific	02-202-101
mikroskop slaytları, Vista vision	VWR International	16004-368
moleküler dereceli su, Hypure	Hyclone Laboratories
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR sistemi, FailSafe, premix A	Lucigen
Potasyum klorür	Millipore Sigma	P39111
Potasyum fosfat dibazik	Millipore Sigma	P3786
Potasyum fosfat monobazik	Millipore Sigma	P0662
Proteaz inhibitörü, Tek kullanımlık kokteyli durdurun 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein test kiti, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
ters transkripsiyon kiti, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA ekstraksiyon kiti RNeasy mikro kiti	Qiagen	74004
RNase İnhibitörü	Uygulamalı Biyosistemler
Sodyum Klorür	VWR Uluslararası	BDH9286-12KG
Sodyum hidroksit	Millipore Sigma	ve nbsp; 1-09137
0.2 & mikro ile steril şırınga filtresi; m Polietersülfon membran	VWR uluslararası	28145-501
Sükroz	VWR Uluslararası	200-334-9
transkripsiyon primerleri, İleri 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'
transkripsiyon primerleri, Ters 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'
Tris-Base	Fisher Bilimsel	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
< güçlü > Ekipman< / güçlü>
-20 derece C inkübatör	ThermoFisher Scientific
20 & derece; C kuluçka makinesi	ThermoFisher Scientific
37 & derece; C inkübatörü	Forma Scientific
4 & derece; C buzdolabı	ThermoFisher Scientific-80
& derece; C dondurucu	Eppendorf
Otoklav	Sanyo
Balch homojenizatör, isobiotec hücre homojenizatör	Isobiotec
Masaüstü Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Santrifüj, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Santrifüj, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Diseksiyon mikroskobu, Leica M80	Leica Microsystems
Florometre, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866,
Jel görüntüleme sistemi, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Jel sistemi	ThermoFisher Scientific
Isı bloğu	VWR International	12621-048
Mikrosantrifüjler, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipet L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipet L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipet L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipet L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Sallanan platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010