Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

ALS'yi Bölgesel Olarak Spesifik İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla Modellemek için Bir Elektrofizyolojik Platformun Kurulması

5.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62726

⸱

26 Ağustos 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Johns Hopkins University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Omurilik insan kaynaklı pluripotent kaynaklı astrositleri ve nöronları ve elektrofizyolojik kayıt için ortak kültürlerini ayırt etmek için bir yöntem tanımladık.

Özet

İnsan pluripotent kök hücre kaynaklı astrositler (hiPSC-A) ve nöronlar (hiPSC-N), Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) patofizyolojisini in vitro olarak modellemek için güçlü bir araç sağlar. Çok elektrot dizisi (MEA) kayıtları, büyük nöron popülasyonlarından elektrik alan potansiyellerini kaydetmenin ve zaman içindeki ağ aktivitesini analiz etmenin bir yoludur. Daha önce, omurilik astrosit fenotipini teşvik etmek için teknikler kullanılarak farklılaştırılan hiPSC-A'nın varlığının, hiPSC-A olmadan veya kemirgen astrositlerinin varlığında kültürlenenlere kıyasla, bölgesel olarak spesifik omurilik hiPSC-motor nöronlarının (MN) olgunlaşmasını ve elektrofizyolojik aktivitesini geliştirdiği gösterilmiştir. Burada açıklanan, omurilik hiPSC-A'yı hiPSC-MN ile birlikte kültürlemek ve MEA kayıtlarını kullanarak elektrofizyolojik aktiviteyi kaydetmek için bir yöntemdir. Burada açıklanan farklılaşma protokolleri, omuriliğe bölgesel olarak özgü astrositlere ve nöronlara özgü olsa da, ortak kültürleme platformu, kortikal hiPSC-A ve hiPSC-N dahil olmak üzere diğer kaderlere özgü tekniklerle farklılaştırılmış astrositlere ve nöronlara uygulanabilir. Bu protokoller, glia-nöron etkileşimleri hakkında bilgi vermek için elektrofizyolojik bir test sağlamayı ve ALS'de terapötik potansiyeli olan ilaçları test etmek için bir platform sağlamayı amaçlamaktadır.

Giriş

İnsan pluripotent kök hücre kaynaklı astrositler (hiPSC-A) ve nöronlar (hiPSC-N), Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) patofizyolojisini in vitro olarak modellemek için güçlü araçlardır ve ilaç keşif stratejileri için translasyonel bir paradigma sağlar1. Araştırmacılar, hiPSC-A'nın hiPSC-N ile ortak kültürünün, her iki hücre tipinin morfolojik, moleküler, elektrofizyolojik ve farmakolojik olgunlaşmasını arttırdığını, karmaşık nöronal ağlar ve in vivo muadillerine benzeyen astrosit-nöron etkileşimleri ürettiğini göstermiştir 2,3. Benzer ko-kültür deneyleri, astrosit aracılı nörotoksisite 4,5 ve nöronal hiper-uyarılabilirlik6 gibi ALS patobiyolojisinin ayırt edici özelliklerini özetleyebilir. Ek olarak, farklılaşma protokollerindeki ilerlemelerle, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC), kortikal ve omurilik hiPSC-A ve hiPSC-N 7,8 dahil olmak üzere bölgesel olarak spesifik nöral alt tiplere ayrılabilir. Bu stratejiler, ALS'de kortikal ve spinal motor nöron patolojisinin modellenmesi için potansiyel ve her ikisi üzerindeki astrositik etkiyi sağlar. Bununla birlikte, bu, bu etkileri belirlemek için tekrarlanabilir bir fonksiyonel tahlil yapılmasını gerektirir.

Son zamanlarda, çoklu elektrot dizisi (MEA) kaydının nöron-astrosit ortak kültürlerinin elektrofizyolojik karakterizasyonu için özellikle uygun olduğu gösterilmiştir2. Tek hücreli elektrofizyolojik analizlerin aksine, bu yüksek yoğunluklu elektrot dizileri, kültür koşullarını bozmadan ve hücre zarlarının bütünlüğünü korumadan büyük nöron popülasyonlarından hücre dışı alan potansiyellerini pasif olarak kaydeder. Bu platformlar, kültürlerin hücresel ve ağ aktivitesini zaman içinde ve farmakolojik manipülasyona yanıt olarak kaydetmek için özellikle yararlıdır. Son olarak, astrositlerin varlığı bir kültür değişkeni olduğunda, MEA kayıtları astrosit-nöron çift yönlü etkileşimleri hakkında işlevsel bilgiler sağlayabilir 2,9.

Burada, hiPSC'nin omurilik hiPSC-A ve daha önce doğrulanmış olan hiPSC-motor nöronlara (MN) farklılaşması için optimize edilmiş bir protokolsunulmaktadır 2. Omurilik hiPSC-A farklılaşma protokolü tutarlı bir şekilde, hücrelerin sırasıyla% 80,% 50 ve% 90'ına kadar S100 kalsiyum bağlayıcı protein B (S100β), glial fibriler asidik protein (GFAP) ve Homeobox B4 (HOXB4) için pozitif olan astrosit kültürleriyle sonuçlanır ve olgunlaşan bir glial ve omurilik spesifikasyonunu gösterir 2,10 . HiPSC-MN farklılaşma protokolü, olgun bir alfa-motor nöron kimliği2'yi düşündüren kolin asetiltransferaz (ChAT) için% >90 pozitif nöronlar üretir. Ek olarak, protokol, astrositsiz veya kemirgen astrositleri olan nöronal kültürlerle karşılaştırıldığında, Scholl analizi ve immünofloresan mikroskopi ile artmış morfolojik karmaşıklığa sahip nöronlarla sonuçlandığı daha önce gösterilen hiPSC-A / MN ortak kültürlerinin üretilmesi için teknikleri açıklamaktadır2. Bu tanımlar omurilik hiPSC-A ve hiPSC-N'ye özgü olsa da, benzersiz bir avantaj, astrositlerin ve nöronların başlangıçtaki bağımsız kültürünün, daha sonraki zaman noktalarında ko-kültüre yönelik adımların ardından, diğer spesifik bölgelerden ve hastalığa özgü hücrelerden nöron-astrosit etkileşimlerinin etkilerini incelemek içinçevrilebilmesidir7,8 . Son olarak, protokol bu kültürlerin MEA plakalarında nasıl yetiştirileceğini açıklar, böylece ko-kültür kompozisyonunun bir faktörü olarak fonksiyonel aktivite, hücresel kompozisyonu ve kültür koşullarını manipüle etme yeteneği ile zaman içinde incelenebilir.

Bu protokollerin amacı, astrosit-nöron etkileşimlerini araştırmak, hastalığa özgü değişiklikleri incelemek ve ALS alanında terapötik potansiyele sahip ilaçları test etmek için fonksiyonel bir test sağlamaktır. Bu protokolün en zorlu adımları için video talimatları sağlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hücre kültürü media hazırlama

  1. Tablo 1'de belirtilen bileşimleri kullanarak bireysel hücre kültürü ortamını hazırlayın.
  2. Medyayı 500 mL filtrelenmiş şişelerde karıştırın ve steril olarak filtreleyin ve 2 haftaya kadar 4 ° C'de ışıktan korunmuş olarak saklayın.

2. Akıcı olmayan insan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin (hiPSC) bakımı ve pasajı

  1. Bodrum membran matrisini (-80 °C'de alikotlarda saklanır) gece boyunca 2-8 °C'lik bir buzdolabında çözün.
  2. Bodrum membran matrisini 1:100'de (v / v) soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) veya Dulbecco'nun Modifiye Kartallar Ortamı (DMEM) ile seyreltin.
  3. Doku kültürü plakasının tabanını kaplamak için yeterli bazal membran matrisi ekleyin (10 cm'lik bir plaka için 5 mL, 6 delikli plakanın tek kuyucukları için 2 mL) ve 37 ° C'de gece boyunca en az 30 dakika veya oda sıcaklığında en az 1 saat inkübe edin.
  4. Seyreltilmiş bazal membran matrisini aspire edin ve kültür ortamı ve tohumlama hücreleri eklemeden önce plakayı PBS ile bir kez yıkayın.
  5. Ne zaman geçmeye hazır olduklarını belirlemek ve tahmin etmek için plakaları günlük olarak inceleyin. Kolonilerin çoğunluğu yeterince yoğunlaştıktan sonra hiPSC'nin geçiş plakaları, kolonilerin merkezi dağınık beyaz alanlar gösterir. Plakaların bu noktadan sonra olgunlaşmasına izin vermeyin. Hücre çok katmanlılığı, kenarlardaki uzun hücrelerin fazlalığı, koloniler içinde gevşek kompaktlık veya artan hücre ölümü nedeniyle kolonilerin merkezinde sarı bir alanın ortaya çıkmasına neden olan aşırı farklılaşmaya neden olacaktır.
  6. Geçiş gününde, tüm plakanın doğru bir şekilde kaplanmasını kolaylaştırmak için plakaların alt dış yüzeyine bir işaretleyici ile ızgara çizgileri çizin.
  7. 200 μL pipet ucu ile manuel olarak kazıma yapan faz kontrastlı mikroskop (10x büyütme) kullanarak bir kültür davlumbazındaki farklılaşmış kolonileri ayırın.
  8. Plakaları PBS ile iki kez durulayın (10 cm'lik plakalar için yıkama başına 5 mL).
  9. 5 mL önceden ısıtılmış doku ayrışma proteazı (Malzeme Tablosu) ekleyin ve kolonilerin kenarları yuvarlanmaya başlayana kadar (4-7 dakika), ancak koloniler plakadan kaldırılmadan önce hücreleri 37 ° C'de inkübe edin.
  10. Dissosiyasyon proteazını dikkatlice aspire edin. Plakayı PBS ile iki kez nazikçe durulayın, kolonileri yerinden çıkarmamaya dikkat edin.
  11. Kültür plakasına 5 mL önceden ısıtılmış hiPSC ortamı (Tablo 1) ekleyin.
  12. Kolonileri, yukarıdan aşağıya doğru ileri geri bir hareket kullanarak 5 mL'lik bir pipetin ucuyla tüm plakayı çizerek daha küçük hücre agregalarına bölerek kaldırın.
  13. Plakayı 90° çevirin ve yukarıdaki adımı tekrarlayın.
  14. 5 mL'lik bir pipetle yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek hücre agregalarını nazikçe tritüre edin ve hücre agregalarının çoğunluğu yaklaşık 50-100 hücre olana kadar agregaların boyutunu periyodik olarak mikroskop altında kontrol edin.
  15. Hücre agregalarını, orijinal plakayı yıkamak için ek bir hiPSC ortamı kullanarak önceden kaplanmış bazal membran matris plakalarına tohumlayın. Hücre agregalarının çoğunu toplayın ve 5 mL'lik bir pipet kullanarak yeni plakalara aktarın.
    NOT: Protokol tutarlı bir şekilde uygulanırsa, orijinal plaka, geçişten önce kültür yüzeyinin yaklaşık% 50'sini kaplayan iPSC kolonileri içermelidir. Bu durumda, bölünme oranı bir plakadan beş yeni plakaya kadar olmalıdır. Bununla birlikte, bunun büyüme koşullarına ve hücre hattına özgü büyüme oranlarına bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.
  16. Agregaları eşit olarak dağıtmak için yeni tohumlanmış plakaları ileri geri sallayın.
  17. Plakaları bir inkübatöre (37 ° C ve% 5 CO2) aktarın ve uygun hücre yapışmasını sağlamak için gece boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
  18. 10 mL hiPSC ortam ile her gün tam bir ortam değişimi gerçekleştirin. Geçişi takip eden gün aşırı hücresel kalıntı varsa, ortam değişiminden önce 5 mL ortam ile bir kez yıkayın.
  19. iPSC kolonilerinin çoğunluğunun merkezinde beyaz alanlar göründüğünde bir sonraki geçişi planlayın (adım 2.5). Bu, her geçişten 4-6 gün sonra gerçekleşecektir.

3. Donma hiPSC

  1. İlk adımları hiPSC geçişi için adım 2.5-2.14'teki gibi gerçekleştirin.
  2. Hücre agregalarını 15 mL'lik bir tüpe toplayın ve 2 dakika boyunca 200 x g'de döndürün.
  3. Süper nantantı aspire edin, peleti dondurucu bir ortamda yeniden askıya alın ve 5 mL'lik bir pipet kullanarak kriyotüplere aktarın.
    NOT: Geçiş adımlarına benzer şekilde, normal bölünme oranı, kolonilerin yoğunluğuna bağlı olarak bir iPSC plakasından beş kriyotüpe kadardır. Her kriyotüp için toplam 1 mL donma ortamı kullanın.
  4. Kriyotüpleri soğutulmuş bir kriyoprezervasyon kabına yerleştirin ve gece boyunca -80 ° C'ye aktarın.
  5. Hücreleri 24 saat sonra sıvı nitrojene aktarın.

4. Çözme hiPSC

  1. 10 cm'lik bir plakayı bazal membran matrisi ile kaplayın (bkz. 2.1-2.3).
  2. Bir iPSC kriyotüpünü sıvı azottan çıkarın ve hızlı bir şekilde çözülmesi için hemen 37 ° C'lik bir su banyosuna 2 dakikaya kadar yerleştirin. Şişeyi banyoda kısmen çözülene ve sıvı ile çevrili küçük bir buz parçası içerene kadar çalkalayın.
  3. Hücre agregalarını kriyotüpten 1000 μL'lik bir pipet kullanarak 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Dondurucu ortamdaki dimetil sülfoksiti (DMSO) seyreltmek için 15 mL'ye kadar önceden ısıtılmış hiPSC ortamı ekleyin.
  4. 15 mL konik tüpü 2 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj edin.
  5. Süpernatantı aspire edin ve hücre agregalarının daha fazla tritürasyonunu önlemek için 20 μM Rho ile ilişkili sarmal bobin oluşturan protein serin / treonin kinaz inhibitörü (ROCK-I, bileşik Y-27632) içeren hiPSC ortamında hücre peletini yeniden askıya almak için 5 mL'lik bir pipet kullanın.
  6. Hücre agregalarını, 5 mL'lik bir pipet kullanarak bazal membran matris kaplı 10 cm'lik bir plakaya aktarın.
    NOT: Protokol tutarlı bir şekilde uygulanırsa, bir kriyotüpteki hücreler tek bir 10 cm'lik plakaya aktarılabilir.
  7. Agregaları eşit olarak dağıtmak için plakayı sallayın.
  8. Plakayı bir inkübatöre aktarın ve uygun hücre yapışmasına izin vermek için gece boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
  9. Çözülmeden sonraki gün ROCK-I olmadan 10 mL hiPSC ortamı ile tam bir ortam değişimi gerçekleştirin.

5. HiPSC'nin omurilik Nöral Progenitör Hücrelerine (NPC) Ayırt Edilmesi

  1. Farklılaşmaya başlamadan önce bazal membran matris kaplamalı 6 delikli plakaların kullanıma hazır olduğundan emin olun.
  2. Çözüldükten sonra en az bir kez ve tercihen iki kez ve en az dört adet 10 cm'lik plaka ile geçirilmiş iPSC ile başlayın (adım 5.11'deki açıklamaya bakın).
  3. İlk adımları, hiPSC geçişi için 2.5-2.14 numaralı adımlarda olduğu gibi gerçekleştirin.
  4. Hücre agregalarını en az iki adet 10 cm'lik plakadan 5mL'lik pipet kullanarak 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
  5. 2 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
  6. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 10 mL'lik bir pipet kullanarak 10 mL hiPSC ortamı ile yeniden askıya alın ve ardından her agregadaki hücreden hücreye yapışmaları gevşetmek için 2 dakika boyunca 200 x g'de tekrar santrifüj yapın.
  7. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 1000 μL'lik bir pipet kullanarak 20 μM ROCK-I içeren 1 mL hiPSC ortamında yeniden askıya alın.
  8. Hücre agregalarını tritüre etmek için 1000 μL'lik bir pipetle yukarı ve aşağı pipet. Hücre süspansiyonunun çoğunluğu tek hücrelerden veya <10 hücreli küçük agregalardan oluşana kadar agregaların boyutunu mikroskop altında periyodik olarak kontrol edin.
  9. Hücreleri bir hemositometre (tercih edilen) veya otomatik bir hücre sayacı ile sayın ve hücre süspansiyonundaki hücre yoğunluğunu hesaplayın.
  10. Plaka 3.0 x 106 hücreli her bir kuyucukta 6 delikli plaka bodrum membran matrisi ile önceden kaplanmıştır. Hücre süspansiyonunu aktarmak için 1000 μL pipet kullanın.
    NOT: Protokol tutarlı bir şekilde uygulanırsa, bu, iki adet 10 cm'lik plakanın 6 kuyucuklu / plakalı tek bir kuyucuğa oranına karşılık gelir.
  11. 5.3-5.10 basamaklarını iki adet 10 cm'lik plakadan oluşan ikinci bir partiyle tekrarlayın ve nihai ürünü ikinci bir 6 delikli plakanın bodrum membran matrisi kaplı kuyusuna yerleştirin. Hücre süspansiyonunu aktarmak için 1000 μL pipet kullanın.
    NOT: Omurilik NPC protokolünün ideal olarak tamamlanması, dört adet 10 cm'lik plakaya eşit iki kuyucuk gerektirir. İş akışı kolaylığı için, 5.3-5.10 adımlarını, her biri nihai ürün iki ayrı 6 delikli plaka olan ve her biri içinde 3.0 x 106 hücre içeren bir kuyucuk bulunan iki plakadan oluşan iki parti ile tamamlayın.
  12. Elde edilen insan iPSC monokatmanını, spontan (kontrolsüz) farklılaşmayı önlemek için akıcılık %>90'a ulaşana kadar, tipik olarak ertesi gün, ancak ilk kaplamadan en fazla 3 gün sonra olmak üzere 20 μM ROCK-I içeren hiPSC ortamında tutun.
  13. Hücre kaplamasını takip eden gün farklılaşmaya başlanamıyorsa, hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve medyayı günlük olarak 20 μM ROCK-I içeren taze bir hiPSC ortamına değiştirin. Kaplamadan sonraki 3 gün içinde% >90 birleşmezse, hücreleri atın ve protokolü baştan başlatın.
  14. %>90 birleşime ulaşıldığında farklılaşmaya başlayın. Bu, farklılaşma protokolünün in vitro 1 (DIV1) günüdür.
  15. DIV 1'de, 20 μM ROCK-I içeren hiPSC ortamını atın ve kök hücre ortamında bulunan fetal büyüme faktörünü (FGF) ve dönüştürücü büyüme faktörü-beta'yı (TGFβ) çıkarmak için PBS ile iki kez durulayın.
  16. Ortamı, 48 saat boyunca 0,2 μM LDN193189 (LDN) ve 10 μM SB431542 (SB) ile desteklenmiş WiCell ortamına (Tablo 1) değiştirin.
  17. DIV 3'te, PBS ile bir kez yıkayın ve ortamı 48 saat boyunca LDN (0.5 μM) + SB (10 μM) + Retinoik Asit (RA; 1μM) ile desteklenmiş WiCell ortamına değiştirin.
  18. DIV 5'te, PBS ile bir kez yıkayın ve ortamı WiCell olarak değiştirin: 48 saat boyunca LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + RA (1 μM) ile desteklenmiş nöral indüksiyon ortamı (NIM) tabanı (Tablo 1) (% 50:% 50, v / v).
  19. DIV 7'de, adım 5.18'dekiyle aynı ortamla ortam değişimi gerçekleştirin.
  20. DIV 8'de bir kez PBS ile yıkayın ve ortamı 48 saat boyunca RA (1 μM) + puromorfamin (PMN) (1 μM) + Rekombinant insan beyni kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) (10 ng / mL) + Askorbik asit (ASAC) (0.4 μg / mL) ile desteklenmiş WiCell: NIM bazına (% 50:50) değiştirin.
  21. DIV 10'da, PBS ile bir kez yıkayın ve 48 saat boyunca adım 5.20'de belirtildiği gibi ortamı NIM tabanına (%100) değiştirin.
  22. DIV 11 veya 12'de, geçişe hazırlık olarak 25cm2'lik steril bir kültür şişesini bazal membran matrisi ile kaplayın.
  23. Ortamı 6 delikli plaka l'nin her bir kuyucuğundan aspire edin ve hücreleri PBS ile bir kez durulayın.
  24. Her bir oyuğa 2 mL% 0.05 tripsin ekleyin ve 5-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin; Plakaların aralıklı olarak sallanması, hücre ayrılmasında yardımcı olabilir.
  25. Hücreler hala süspansiyonda değilse, NIM ortamını 1000 μL'lik bir pipet ucundan dairesel bir hareketle hücrelere çıkararak (tüm yüzeyi kapladığınızdan emin olun) veya bir hücre kazıyıcıyla kazıyarak (tercih edilmez) mekanik olarak ayırın.
  26. Hücreleri 2 kuyucuktan 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 mL'lik bir pipet kullanılarak kullanılan tripsin miktarına uygun oranda tripsin inhibitörü ekleyin.
  27. 2 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın, süpernatanı aspire edin ve ardından 10 mL'lik bir pipet kullanarak 10 mL NIM tabanı ile yeniden askıya alın.
  28. Hücreden hücreye yapışmaları gevşetmek için 2 dakika boyunca 200 x g'de tekrar santrifüj yapın.
  29. İkinci santrifüjleme adımından sonra, süpernatanı çıkarın ve peleti RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng / mL) + ASAC (0.4 μg / mL) ve ROCK-I (20 μM) ile desteklenmiş 1 mL NIM ortamı (% 100) ile yeniden askıya alın. 1000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak, bulutlu bir süspansiyon elde edilene kadar hücreleri yaklaşık beş kez yukarı ve aşağı tritürleştirin.
  30. Bu ortamdaki agregaları 25 cm2 steril kültür şişesine kaplanmış bazal membran matrisine yeniden tohumlayın, böylece nihai sonuç, hücrelerin 6 kuyucuklu bir plakanın iki kuyucuğundan tek bir bazal membran matris kaplı 25cm2 steril kültür şişesine (2 : 1 geçiş) birleştirilmesidir. Hücre süspansiyonunu aktarmak için 1000 μL pipet kullanın.
    NOT: Hücreler DIV 13'te %>90 oranında akıtılmalıdır ve 14. Güne kadar başka bir adıma gerek yoktur. Hücreler birleşmiyorsa, ROCK-I'i 1 veya 2 gün daha medyada saklayın.
  31. DIV 14'te, ortamı taze NIM ortamı + RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/mL) + ASAC (0,4 μg/mL) olarak değiştirin.
  32. DIV 15'te, ortamı NIM olarak değiştirin: RA (1 μM) + PMN (1 μM) + ASAC (0.4 μg / mL) + Ek B (50x) + BDNF (10 ng / mL) + Glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik (GDNF) (10 ng / mL) + İnsülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1) (10 ng / mL) + Siliyer nörotrofik faktör (CNTF) (10 ng / mL) ile nöral farklılaşma ortamı (NDM) tabanı (Tablo 1) (% 50:50). Her geçen gün taze medya ile değiştirin.
  33. DIV 21'de, ortamı 5.32. adımda olduğu gibi NDM tabanına (%100) değiştirin ve her geçen gün taze ortamla değiştirin.
  34. DIV 25-30'da NPC'yi toplayın ve ya dondurun ya da terminal farklılaşması için 10 cm'lik bir plakaya geçirin.
  35. T-25 şişesini PBS ile durulayın ve% 0.05 tripsin ekleyin.
  36. 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatın.
  37. Tripsin ve hücreleri NDM tabanı ile durulayın ve 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Tripsin inhibitörünü tripsin ile uygun oranda ekleyin ve 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
  38. Hücre peletini motor nöron veya astrosit farklılaşma ortamı ile yeniden askıya alın (Tablo 1) ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için yukarı ve aşağı tritüre etmek için 1000 μL'lik bir pipet kullanın (genellikle 5 kata kadar).
  39. Hücreleri sayın ve hiPSC-MN ve hiPSC-A'yı ayırt etmek için +Rock-I farklılaştırma ortamını kullanarak bölüm 6'da açıklandığı gibi kaplanmış 10 cm'lik bir plakaya aktarın.
  40. Alternatif olarak, büyüme faktörleri (5.32-5.33. adımlarda olduğu gibi) ve% 10 DMSO ile% 90 NDM ortamından oluşan bir donma ortamında yeniden askıya alarak kültürleri dondurun, benzer şekilde tritüre edin ve ardından bir kriyotüpe aktarın. Kriyotüp başına Aliquot 6 x 106 NPC.

6. NPC kültürlerini çözme

  1. Hücreleri çözmeden bir gün önce 10 cm'lik plakaları poliornitin (PLO) ve laminin ile kaplayın.
    1. Plakalara PBS'de 100 μg/mL'ye seyreltilmiş 5 mL FKÖ veya damıtılmış su (dH2O) ekleyin. Gece boyunca en az 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. PLO solüsyonunu aspire edin ve plakaları PBS ile üç kez durulayın. (FKÖ uygun şekilde yıkanmadığı takdirde zehirlidir.)
    3. PBS'de seyreltilmiş laminini, PLO kaplı plakalara 10 μg/mL konsantrasyonuna ekleyin. En az 1 saat boyunca, tercihen gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Kuluçkadan sonra, hücre yapışmasını arttırmak için laminin çözeltisini durulamadan aspire edin.
      NOT: Plakalar önceden PLO ile kaplanabilir, üç kez suyla yıkanabilir, steril bir başlıkta kurutulabilir ve 4 ° C'de saklanabilir.
  2. Her 10 cm hücre kültürü plakası için 6 x 106 hücre/ şişe içeren bir NPC şişesini (yani DIV 25 veya 30) çözün.
  3. NPC kriyotüpünü sıvı azottan çıkarın ve hemen 37 ° C'lik bir su banyosuna 2 dakikaya kadar yerleştirin. Sıvıyla çevrili küçük bir buz parçası olana kadar şişeyi sallayarak hızlıca çözün.
  4. Hücre agregalarını 1000 μL'lik bir pipet kullanarak 15 mL'lik bir konik içine aktarın ve DMSO'yu seyreltmek için 15 mL'ye kadar önceden ısıtılmış NDM veya Dulbecco'nun Modifiye Kartallar Ortamı (DMEM) / Ham'ın F21 F12 takviyesini ekleyin.
  5. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
  6. Süpernatanı aspire edin, hücre peletini astrosit veya MN farklılaşma ortamı (Tablo 1) + ROCK-I (20 μM) ile yeniden askıya alın ve tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar (5 kata kadar) yukarı ve aşağı tritüre etmek için 1000 μL'lik bir pipet kullanın.
  7. Tek hücreli süspansiyonu PLO-Laminin kaplı 10 cm'lik bir plakaya aktarın.
  8. Plakayı bir inkübatöre aktarın ve uygun hücre yapışmasına izin vermek için gece boyunca rahatsız edilmeden bırakın.

7. Omurilik NPC'sini motor nöronlara ayırt etmek

  1. İlk adımları 6.1-6.8 adımlarında belirtildiği gibi, son ortam MN farklılaştırma ortamı + ROCK-I (20 μM) olacak şekilde gerçekleştirin.
  2. Kaplamadan sonraki gün, ROCK-I olmadan MN farklılaştırma ortamı ile ortamın tam bir değişimini gerçekleştirin ve ardından ortamı her gün değiştirin. Hafta sonu boyunca, Cuma günü hücreleri besleyin ve ardından Pazartesi günü tekrar besleyin. Hücre kalıntılarını çıkarmak için gerektiğinde hücreleri PBS ile durulayın.
  3. Ortamı MN farklılaşma ortamı + sitozin arabinozid (ARA-C) (0.02 μM) ile değiştirin ve glial bağlı progenitörler, hücre kümelerinde toplanan post-mitotik MN progenitörleri altında tek proliferasyon yapan düz hücreler olarak ortaya çıktığında 48 saat boyunca inkübe edin.
    NOT: Genellikle, bu ilk kaplamadan sonraki ilk 7 gün içinde gerçekleşir, ancak hücre hattına bağlı olarak değişkenlik olabilir.
  4. 48 saat sonra, ARA-C içeren ortamı aspire edin, kültürleri PBS ile üç kez hafifçe durulayın ve ortamı ARA-C olmadan taze MN ortamına değiştirin.
  5. ARA-C ile tedaviden sonra, nöronal kümelerin erken ayrılmasını önlemek için eski ortamı vakum aspiratörü yerine manuel pipetle çıkararak her gün (veya Pazartesi, Çarşamba ve Cuma) ortam değişimleri yapın. Ek olarak, kültür plakalarına nöronal bağlılığı daha da arttırmak için MN ortamını haftada bir kez Laminin 1 μg / mL ile zenginleştirin.

8. NPC'yi omurilik astrositlerine ayırma

  1. Bölüm 6'da olduğu gibi NPC kültürlerini çözün, hacim konsantrasyonu için% 1 (NS +% 1 FBS) ve kaplama için ROCK-I (20 μM) hacimli fetal sığır serumu (FBS) ilavesiyle Astrosit Farklılaşma Ortamı (Tablo 1) kullanın.
    NOT: Ticari olarak temin edilebilen serum replasmanı (Tablo 1), aynı seyreltme faktörleri kullanılarak FBS ile değiştirilebilir.
  2. Kaplamadan sonraki gün, kültür ortamını ROCK inhibitörü olmadan NS +% 1 FBS ortamı ile değiştirin ve ardından ortamı her gün değiştirin. Hafta sonları hücreleri Cuma günü ve ardından Pazartesi günü tekrar besleyin. Hücre kalıntılarını çıkarmak için gerektiğinde hücreleri PBS ile durulayın. Hücreler ölmeye devam ederse, hücre sağkalımını teşvik etmek için medyayı ROCK-I (10 μM) ile destekleyin. Ölümsüz hücreleri seçme potansiyeli göz önüne alındığında, ROCK-I'i çok sık veya çok uzun süre kullanmamaya dikkat edin.
  3. Astrositlerin geçmeden önce kaynaşmalarına izin verin.
    NOT: Hücre boyutu zamanla artacaktır, bu nedenle geçiş için ayarlanmış bir sayı yoktur. Tipik pasaj oranı 1: 2 veya 1: 3'tür. Zayıf hayatta kalma veya çok fazla plakaya geçme durumunda, akıcılığı korumak için iki (veya gerektiğinde daha fazla) 10 cm'lik plakayı bir 10 cm'lik plakada birleştirin.
  4. Astrosit progenitör kültürlerini geçmek için, plakaları PBS ile bir kez yıkayın (FBS'yi çıkarmak için), 5 dakika boyunca% 0.05 tripsin ile inkübe edin, hücreleri NS ortamında toplayın +% 1 FBS (FBS tripsini inaktive eder) ve ardından 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı aspire edin, hücreleri NS ortamında +% 1 FBS'de yeniden askıya alın ve ardından tek hücreli bir süspansiyona tritüre edin. NS +% 1 FBS'deki hücreleri yeni 10 cm'lik plakalara dağıtın.
    NOT: Astrosit kültürlerinin genişlemesine ek olarak, plakaların tekrar tekrar geçirilmesi, nöronal bir kader seçen kalan progenitör hücreleri öldürme amacına hizmet eder. Bu nedenle, çok yüksek bir mitotik oran olmasa bile, nöronal kontaminasyon var gibi görünüyorsa, plakalar 1: 1 oranında geçirilebilir.
  5. Verimi aşağıdaki gibi artırmak için farklılaşma sürecinde kaplamayı değiştirin.
    1. Başlangıçta çözülmüş NPC kültürlerini ve FKÖ/Laminin üzerine ilk kaplamadan sonraki ilk pasajları plakalayın.
    2. Olgunlaşmamış astrositleri bazal membran matris kaplı plakalar üzerine plakalayın.
    3. Daha olgun astrositleri (yani 90. günden sonra) ya bazal membran matrisinde, FK / Laminin kaplı plakalarda (tipik olarak nöronlarla birlikte kültür için) veya kaplanmamış plakalarda plakalayın.
  6. Kültürleri senkronize etmek veya daha sonraki deneyler için tasarruf etmek için astrosit progenitörlerini 60 günlük olgunlaşma süresi boyunca herhangi bir zaman noktasında dondurun. NPC aşamasının ötesinde çözülürken, astrosit progenitörlerini FK / Laminin yerine bazal membran matris kaplı plakalara çözün.
  7. DIV 90'da ve sonrasında, astrosit sağkalımını teşvik etmek ve çoğalmalarını azaltmak için ortamı NS +% 1 FBS'den NS +% 5 FBS'ye geçirin.

9. MN ve omurilik astrositlerinin çoklu elektrot dizi plakalarında birlikte kültürlenmesi

  1. Motor nöronları ve astrositleri, aynı gün kullanılmaya hazır olduklarında ayırt edin ve plakalayın ve motor nöronlar için DIV 60'a ve astrositler için DIV 90'a yaşlandırın.
  2. MEA plakalarını, 24 delikli plastik plakalarla çalışıyorsanız, kaplamadan önceki gün veya kaplama gününde aşağıdaki gibi kaplayın (Malzeme Tablosu).
  3. FKÖ'yü suda veya PBS'de 100 μg/mL'ye kadar seyreltin.
    1. Her bir kuyucuğa 15-20 μL ekleyin (pipet konfor seviyesine bağlı olarak), elektrotların alanını ve çevresindeki alanı kaplayan ancak kuyunun tamamını kaplamayan kuyunun merkezinde bir damlacık oluşturun.
    2. Pipet ucundaki elektrotlara zarar vermemeye dikkat edin. Her kuyuda aynı yüzey alanının kaplanmasını sağlamak için kuyudan kuyuya hacimle tutarlı olun.
    3. FKÖ'yü 37 °C'de en az 1 saat (tercihen 2 saat) boyunca inkübe edin.
      NOT: Plakalarda yeterli nem yoksa küçük hacimler kurur. Kaplama ve kayıtlar boyunca yeterli nemi sağlamak için kuyuları çevreleyen bölmelere su ekleyin.
  4. Plastik bir mikropipet ucu kullanarak mümkün olduğunca çok FKÖ aspire edin. Elektrotlara dokunmamaya dikkat edin. 250 μL su ile üç kez yıkayın. Yıkamalar için bir vakum aspiratörü kullanıyorsanız, ucun elektrot dizisinin yakınında olmasına izin vermeyin. Üçüncü yıkamadan sonra, gerektiğinde bir pipet ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla su çıkarın. Yüzeyi, kapak çıkarılmış olarak hücre kültürü başlığının altında kurumaya bırakın.
  5. Plaka yüzeyleri kuruduktan sonra, PBS'de 10 μg / mL'ye seyreltilmiş Laminin ekleyin. Her elektrot dizisini örtmek için 15-20 μL kullanın. Nem bölmelerine su ekleyin, kapağı değiştirin ve plakayı gece boyunca en az 2 saat boyunca 37 °C inkübasyona geri döndürün.
  6. Kaplama gününde, MN ve astrosit kültürlerini PBS ile bir kez durulayın ve hücreleri kaldırmak için 37 ° C'de% 0.05 tripsin ekleyin (5 dakika). Tripsin inhibitörü içeren 15 mL'lik konik bir tüp içine toplayın ve tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için plakaları orta veya baz ile yıkayın. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj yapın ve 1 mL tek hücreli süspansiyon oluşturmak için 1000 μL'lik bir pipetle yeniden askıya alın. MN ve astrositleri yeniden askıya alırken, 20 μM ROCK-I ilavesiyle ortak kültür ortamına (Tablo 1) geçin.
  7. Bir hemositometre kullanarak MN ve astrositleri paralel olarak sayın. Sayma ve hesaplama yaparken, hücre süspansiyonlarını kapatın ve 4 ° C'de bir Strafor rafına yerleştirin.
  8. Kültürleri, motor nöronlar için 5 μL başına 5 x 10 4 hücre konsantrasyonuna ve astrositler için 5 μL başına 2.5 x 104 hücre konsantrasyonuna geri püskürtmek için gereken hacmi hesaplayın. 1 mL hücre süspansiyonlarını 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve hesaplanan hacimde yeniden askıya alın.
  9. Tohumlanmak istenen kuyucukların sayısını hesaplayın ve her hücre süspansiyonunun 5 μL'si ile çarpın. Gerekli miktarda nöron ve astrosit süspansiyonlarını 1: 1 oranında birleştirin ve iyice birleşene kadar pipetleyerek, karıştırın (genellikle iki kez), ancak çok agresif olmaktan kaçının.
  10. Bir pipet ucu kullanarak MEA plakasının her bir kuyucuğundan Laminin'i çıkarın. Son kombine hücre süspansiyonunun 10 μL'sini her bir kuyucuğa aktarın, kuyu başına 5 x 10 4 MN ve 2.5 x 104 astrosit hücre yoğunluğu sağlamak için elektrot dizisini kaplayan küçük bir damlacık oluşturun.
    NOT: Kombine süspansiyondaki yüksek hücre yoğunluğu, doğru ve tutarlı hücre sayımları sağlamak için tohumlama adımı sırasında kuyucuklar arasında sık sık yeniden süspansiyon gerektirir.
  11. Plakaları 20-30 dakika boyunca inkübatöre iade edin. Hücre damlacığını rahatsız etmemeye dikkat edin ve hücrelerin plakalar üzerinde ilk ataşmanlar oluşturmasına izin verin.
  12. 20-30 dakika sonra, her bir kuyucuğun duvarına 250 μL pipet koyarak her bir kuyucuğa sıcak ko-kültür ortamı + ROCK-I ekleyin, ardından karşı taraftaki aynı kuyunun duvarından aşağı doğru 250 μL daha ekleyin. Plakayı inkübatöre geri koyun.
  13. Tohumlamadan sonraki gün plakaları inceleyin (Ortak kültür Günü 1). Önemli miktarda hücre enkazı veya ölü hücre varsa, ortamı ROCK-I içeren taze bir ortak kültür ortamı ile değiştirin. Aksi takdirde, tohumlamadan sonraki ikinci günde (Ortak Kültür Günü 2) ortamı ROCK-I olmadan ortak kültür ortamına değiştirin. Haftada iki kez yarı-orta ölçekli değişimler gerçekleştirin (buharlaşmayı hesaba katmak için% 50'sini aspire edin ve% 60'ını ekleyin).
  14. Tek kuyucuklu 30 mm cam plakalı MEA sistemleri kullanılıyorsa (Malzeme Tablosu), plaka hazırlığı 2 veya daha fazla gün sürebilir. Bunu gerçekleştirmek için aşağıdaki adımları izleyin.
  15. Önceki MEA kültürlerinden hücreleri ve hücre kalıntılarını 5-15 dakika boyunca% 0.05 Tripsin ile kaldırın.
  16. Tripsin aspire edin ve su ile üç kez durulayın.
  17. % 70 etanol ekleyerek sterilize edin ve davlumbazda 10 dakika kuluçkaya yatırın. Etanolün aspire edilmesi ve ardından üç kez suyla durulanması.
  18. Proteaz enzimli %1 anyonik deterjanı suya uygulayın. Plakaları bir kapakla örtün ve termoplastik film ve alüminyum folyo ile sarın ve daha sonra gece boyunca oda sıcaklığında bir rocker üzerinde bırakın.
  19. Deterjanı aspire edin ve ardından üç kez suyla durulayın.
  20. Plakaları saklamayı planlıyorsanız, yeterli miktarda su ekleyin. Plakaları bir kapakla örtün ve termoplastik film ve alüminyum folyo ile sarın ve bir sonraki kullanıma kadar buzdolabında bırakın.
  21. Kaplamayı planlıyorsanız, yüzeyin hücre kültürü başlığı altında kurumasını bekleyin.
  22. Ekstra sterilizasyon gerekiyorsa (örneğin, önceki enfeksiyon veya yeni olmayan kullanım), yalnızca bu noktada, MEA plakalarını 30-60 dakika boyunca kaputun altındaki ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakın.
    NOT: Sık sık UV ışığından kaçınmak, elektrotların zarar görmesini önleyecektir. Plakaların üzerinde serum olduğunda UV ışığının kullanılması, işlevsel olmayan elektrotlara neden olur, bu nedenle sadece temizlenmiş plakalarda kullanılmalıdır.
  23. Plakalar tamamen kuruduğunda, MEA plakalarının cam yüzeyini şarj etmek ve kaplama etkinliğini artırmak için 1 dakika boyunca plazma temizliğine devam edin. Plazma, MEA plaka temizleme-kaplama döngülerinin her 4-5 döngüsünde en az bir kez temizlenir.
    1. Alternatif olarak, plazma temizliği mümkün olmadığında veya garanti edilmediğinde, MEA plakalarının yüzeyini örtmek için yeterli miktarda FBS içeren ortam ekleyin ve bunları gece boyunca inkübatöre geri gönderin.
  24. Yukarıda bölüm 6'da açıklandığı gibi PLO/Laminin kaplama kullanın. PLO çözeltisini (PBS'de 100 μg) plazma temizledikten veya FBS içeren ortamı aspire edip duruladıktan hemen sonra ekleyin.
  25. Hücreleri aşağıdaki yoğunluklarda yukarıdaki gibi plakalayın: 1 x 10 5 hiPSC-A / plaka ve 5 x 105 hiPSC-MN / plaka.

10. Çok elektrotlu dizi kaydı

  1. 200 Hz yüksek geçişli ve 3 kHz düşük geçişli filtreli bir Butterworth filtresi kullanarak ham voltaj verilerini 12,5 kHz örnekleme frekansında ayıklayın. Ani gerilim tanımayı gerilimlerin anlık zaman noktaları olarak ayarlayın ≥6 taban çizgisinden standart sapmalar. Ani artışları, 100 ms'de >5 ani artışa sahip bir etkinlik olarak tanımlayın. Toplam aktif elektrotların% 35'inden fazlası, ağ patlaması başına en az 50 ani artışla 100 ms içinde ateşlendiğinde ağ etkinliğini tanımlayın.
  2. Co-Culture (CC) Gün 1'den sonra mümkün olan en kısa sürede kayda başlayın.
    NOT: Elektriksel aktivite CC Gün 3'ten önce nadiren not edilecektir.
  3. Benzer yoğunluklarda plaka paralel kültürler ve biyokimyasal tahliller, immünositokimya (ICC) veya qPCR için uygun kültür plakalarında veya kapaklarında çoğalır.
  4. Sıcaklık %5'te 37 °C ve CO2'ye ayarlanmış kayıtlar gerçekleştirin. Plakaları makineye aktarın ve kayıttan önce en az 5 dakika boyunca dengelenmelerini sağlayın.
  5. Temel aktiviteyi her gün veya haftalık olarak, deneysel tasarıma bağlı olarak 1-15 dakikadan fazla kaydedin. Orta boy bir değişimden sonra en az 1 saat kayıt yapmayın ve ideal olarak her medya değişiminden sonra 24 saat bekleyin.
  6. Kontaminasyonu önlemek için, steril plakanın kapağının steril davlumbazın dışında açılması gereken herhangi bir kayıttan sonra ortamı değiştirin (yani, adım 9.14'te olduğu gibi yarım orta değişim) (yani, ilaç bileşiklerinin uygulanması). Plakalar ilaç tedavisinin ötesinde kullanılmaya devam edecekse, ilaçları yıkamak için tam orta değişimler yapın ve yıkayın.
  7. Analiz amacıyla, her koşul için en az üç teknik ve biyolojik kopya kullanın. Elektrofizyolojik verileri n ≥ 3 replikasyon aracı olarak eksprese eder.

11. Çok elektrot dizisi üzerine farmakolojik testler

  1. Deneysel soruya bağlı olarak farklı bir ko-kültür kombinasyonu kullanın: kontrol astrositleri ile ALS nöronları, ALS astrositleri ile kontrol nöronları, ALS nöronları ve astrositleri, kontrol nöronları ve astrositleri.
  2. Nöronları veya astrositleri hedef alan bileşiklerin geçici elektrofizyolojik etkilerini araştırırken, plaka kapağı çıkarılmış ancak makine kapağı kapalıyken en az 1 dakika boyunca temel aktiviteyi kaydedin.
  3. Elektrofizyolojik kaydı durdurmadan kapağı manuel olarak makineye açın ve birden fazla kuyucuğu tedavi ediyorsanız çok kanallı bir pipet kullanarak 25 μL besiyeri uygun ilaç aracıyla (genellikle taze ortam) değiştirin. Kapağı manuel olarak kapatın.
  4. Ek 1 dakika (veya kültürün iyileşmesi gereken araç kaynaklı önemli değişiklikler varsa daha fazla) kayıt yapın.
  5. Kapağı manuel olarak tekrar açın ve aynı araçta ilgilenilen ilaçla 25 μL ortam değiştirin. Makinenin kapağını kapatın ve kayda devam edin.
    NOT: Kayıt süresi ve uygulanan ilacın/aracın hacmi, deneysel soruya bağlı olarak değişebilir veya optimize edilmesi gerekebilir.
  6. Analiz amacıyla, aracın eklenmesinin elektrofizyolojik parametrelerde önemli değişikliklere neden olmadığından emin olun. İlaç sonrası aktivitenin araç ilavesinden sonrakine kıyasla yüzde değişimlerini hesaplayın ve koşullar arasında karşılaştırın.
  7. Aday hastalık modifiye edici ilaçlar gibi uzunlamasına elektrofizyolojik etkileri araştırmak için, adım 11.2'de özetlenen temel aktiviteyi kaydedin. Bunun için, uygun araçta ilgilenilen ilacı (ilaçları) içeren ortak kültür ortamını veya yalnızca aracı içeren ortamı kullanın.
  8. Analiz amacıyla, ALS'den zaman noktası kayıtlarını karşılaştırın veya ilaçlarla uzunlamasına tedavi edilen ortak kültürleri birbirleriyle ve kontrol koşullarını kontrol edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

HiPSC-MN ve omurilik hiPSC-A'nın üretimi için omurilik modelleme protokolü Şekil 1'de özetlenmiştir. Bu protokolde, hiPSC'ler akıcı-olmayan koloniler olarak korunur ve geçirilir (Şekil 2A). Nörogenez, LDN193189 ve SB431542'nin eklenmesiyle ikili SMAD inhibisyonu yoluyla başlatılır (nöral indüksiyon), sırasıyla kemik morfogenetik proteini (BMP) ve dönüştürücü büyüme faktörü-beta (TGF-β) yollarını inaktive eder. Bu adım için, hiPSC'nin nöroepitel benzeri bir 2D kü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bugüne kadar, astrosit-nöron ortak kültürlerinin elektrofizyolojik kayıtları için hiPSC ve MEA tabanlı yöntemler, epilepsi9'un in vitro modellemesi için daha yaygın kullanımlarının aksine, ALS6 alanında sınırlı bir uygulama alanı bulmuş ve hala tam olarak insan platformlarında bulunmamıştır. Bununla birlikte, bu platform, nöronal hipereksitabilite mekanizmaları, astrositin nörotoksisiteye katkısı veya ağ aktivitesinin hastalığın ilerlemesindeki rolü gibi ALS araştı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu makale aşağıdaki makaleler tarafından desteklenmiştir: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Hayırsever Vakfı Klinik Bilim İnsanı Kariyer Geliştirme Ödülü (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Açıklanan elektrofizyolojik platformu doğrulamak için kullandığımız MEA platformunu ve veri analiz yazılımını sağladıkları için Dr. Raha Dastgheyb ve Dr. Norman Haughey'e teşekkür ederiz. Khalil Rust'a protokol gösterimi ve çekimleri konusundaki yardımları için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 cm steril kültür plakalarıFalcon353003
25 cm2 steril kültür şişeleriFalcon353136
2-Merkaptoetanol (β-ME)Thermofisher 21985023Çalışma konsantrasyonu 110 &mikro; M
500 mL 0.2 ve mikro; m CA Filtre SistemiCorning430769
5 mL pipetFalcon357543
6 kuyu steril kültür plakasıFalcon3046
Amfoterisin BGibco15290018Çalışma konsantrasyonu 2.0 & mu; g/mL
Proteaz enzimli anyonik deterjan - Terg-A-ZymeSigma-AldrichZ273287Çalışma konsantrasyonu %1 m/v
Askorbik asit (ASAC)SigmaA44030,4 mg/ml stok elde etmek için 100 mg'ı 250 mL dH2O'ya çözün. 0.22 & mikrodan steril filtre; m filtre, alikot ve -80 >m;C'de dondurun Kullanım için 1:1000'de seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 0.4 & mikro; g/mL).
Axion CytoView MEA 24 plaka (M384-tMEA-24W)AxionOPT-24
Axion Edge MEA platformuAxionMaestro Edge
Bodrum Membran matrisi - MatrigelCorning354277Protokoldeki detaylar
Tezgah üstü mikroskop (hücre kültürü başlığı altında steril)Zeiss415510-1100-000Primo Vert
BicucullineSigma Aldrich14340Çalışma konsantrasyonu10 μ M
Siliyer nörotrofik faktör (CNTF)Peprotech450-13Çözün 100 & 1 mL steril PBS'de g ve daha sonra 10 & mikroya 9 mL steril% 0.1 BSA-PBS ekleyin; g/mL'dir. Aliquot ve -80 ° C'de dondurun Kullanım için 1: 1000'de seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
AirGas / Harris9296NCiçin CO2< / sub> tankları ve regülatörü
; 250 & mikro elde etmek için 2.0387 mL DMSO'da g; M hisse senedi. Alikot ve -80 ° C'de dondurun ve kullanım için 1:2000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 125 nM).
Siyanquixaline  (CNQX)Sigma AldrichC239Çalışma konsantrasyonu 50 μ M
Dihidrokainik asit (DHK)Tocris111Çalışma konsantrasyonu 50 μ M ve 300 μ M
DMEM/F12Thermofisher113300Çalışma konsantrasyonu 1x
Esansiyel 8 Orta + Esansiyel 8 TakviyesiThermofisherA151700110 mL Esansiyel 8 (10x)  takviyesini 500 mL Esansiyel 8 Büyüme Ortamı (1x)
ile birleştirin Fetal Sığır Serumu (FBS)Thermofisher16140071Çalışma konsantrasyonu 1x
Glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik (GDNF)Peprotech450-10Çözünme 100 & 1 mL PBS'de 100 & mikro'ya g; g / mL ve daha sonra 10 & mikroya 9 mL steril% 0.1 BSA-PBS ekleyin; g/mL'dir. Aliquot ve -80 ° C'de dondurun Kullanım için 1: 1000'de seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
HemositometreSeçim Mikroskobu Bilimleri63510-20
HeparinMillipore-sigmaH3149-100KU2 mg / mL stok çözeltisi elde etmek için 100 mL PBS'de 200 mg çözün. Stokları 15 mL ve 500 µ olarak aliquot; L tüpleri. Kullanım için 1:1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 2 & mikro; g/mL).
Nem kontrollü Hücre kültürü inkübatörüThermoFisher37037 >m'ye ayarlanmış; C,% 5 CO2
İnsülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1)R& D sistemleri291-G1-200Çözün 200 ve mikro; 2 mL PBS'de g ila 100 & mikro; g / mL, daha sonra 10 & mikro yapmak için 18 mL% 0.1 BSA-PBS ekleyin; g/mL stok ve -80 >m;C'de saklayın. Aliquot ve -80 ºC'de dondurun. 10 & mikro'yu seyreltin; kullanım için 1: 1000'de g/mL stok. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
Kainc asidiAbcamab144490Çalışma konsantrasyonu 5 μ M
Nakavt Serum Replasmanı (KSR)Thermofisher10828Çalışma konsantrasyonu 1x
LamininThermofisher23017-015Stok çözeltisi 1 mg / mL, çalışma konsantrasyonu 10 & mikro; g/mL (kaplama), 1 & g / mL (hücre ortamı)
LDN193189Stemgent04-00742 mg LDN'yi 500 & mikroya çözün; 10 mM stok elde etmek için L Kloroform. Bunu alın ve -80 >m;C'de dondurun. Kullanmak için, önce stoğu 1 ila 10 oranında DMSO'ya [1 mM'ye] seyreltin, ardından 0.2 & mikro elde etmek için istenen ortama 1: 5000 mM seyreltin; M çalışma çözümü
L-GlutaminThermofisher25030Çalışma konsantrasyonu 100x
MEA cam plakalarÇok Kanallı Sistemler60MEA200/30iR-Ti-gr
Çok Kanallı Pipet P200GilsonPJ22224
NeurobazalThermofisher21103049Çalışma konsantrasyonu 1x
Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA)Thermofisher11140050Çalışma konsantrasyonu 100x
Pencillin/StreptomisinThermofisher15140122Çalışma konsantrasyonu 100x
Poliornitin (PLO)Sigma-AldrichP3655100 mg/mL stok çözeltisi elde etmek için 100 mg'ı 1 mL ddW'de çözün. Hisse senedini 100 & mikro'da aliquot; L tüpleri. (çalışma konsantrasyonu 100 & g / mL)
Potasyum klorür (KCl)NAÇalışma konsantrasyonu 100 mM
Purmorfamin (PMN)Millipore-Sigma5402231 mM çözelti elde etmek için 5 mg'ı 9.6 mL DMSO'da çözün. Aliquot ve -80 >m;C'de dondurun Kullanım için 1:1000 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 1 & mikro; M).
Rekombinant insan-beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)Peprotech450-02Sulandırmadan kısa bir süre önce santrifüjleyin. 100 ve mikroyu çözün; 1 mL PBS'de g, 100 & mikro; g / mL ve daha sonra 10 & mikroya 9 mL steril% 0.1 BSA-PBS ekleyin; g/mL'dir. Aliquot ve -80 ° C'de dondurun Kullanım için 1: 1000'de seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 10 ng/mL).
Retinoik asit (RA)SigmaR2625100 mM stok çözeltisi elde etmek için 100 mg'ı 3.3 mL DMSO'ya çözün. Aliquot hisse senedi 100 &mikro; L / tüp ve -80 >m;C'de dondurun. 200 ve mikro alın; L 100 mM stok yapın ve 10 mM stok yapmak için 10x seyreltin (1.8 mL DMSO ekleyin). Aliquot 50 &mikro; L/tüp  ve -80 ° C'de saklayın Kullanım için 1: 10000'de seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 2 & mikro; M).
ROCK-I inhibitörPeprotech12938231480 &'de 5 mg çözün; 10 mM stok elde etmek için L dH2O, alikot yapın ve -80ºC'de dondurun. Kullanım için 1: 500 oranında seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 20 & mikro; M).
SB431542SigmaS431710 mM stok çözeltisi elde etmek için 5 mg'ı 1.3 mL DMSO'ya çözün. Aliquot ve -80 >m;C'de dondurun Kullanım için 1:1000'de seyreltin. (Çalışma Con 10 & Micro; M)
Steril hücre kültürü davlumbazlarıBaker CompanySG-600
Takviyesi B - B27 TakviyesiThermofisher21985023Çalışma konsantrasyonu 50x
Ek N - N2 TakviyesiThermofisher17502048Çalışma konsantrasyonu 100x
Masa üstü hücre kültürü santrifüjüThermoFisher75004261Sorvall Legend X1R
Termoplastik  film - ParafilmPARAFILMP7793
Doku ayrışması proteazı - DispaseStemCell Technologies7923Çalışma konsantrasyonu 1x
Tripsin İnhibitörüSigmaT6522-1G10 mg / mL stok elde etmek için 100 mL ddH < sub > 2 < / sub>O'da 1 g çözün. Alikot ve 4 >m;C'de saklayın. Kullanım için tripsin hacminin 1:10'unu seyreltin. (çalışma konsantrasyonu 1 mg / mL).
Tripsin-EDTA (% 0.05)Thermofisher2530054Çalışma konsantrasyonu 1x
Su banyosuThermoFisher2332Isotemp
: Axion Edge Bileşik E Abcam ab142164 Çözün 250 ve mikro ,

Kaynaklar

  1. Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911(2021).
  2. Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
  3. Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
  4. Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
  5. Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
  6. Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
  7. Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
  8. Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
  9. Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416(2018).
  10. Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
  11. Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
  12. Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79(2015).
  13. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
  14. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  15. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  16. Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
  17. Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
  18. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

ALS Modellemeİnsan Pluripotent Kök HücreleriAstrosit Nöron Ko-KültürüÇok Elektrotlu DiziElektrofizyolojik KayıtOmurilik AstrositleriMotor Nöron DiferansiyasyonuÇift SMAD İnhibisyonuJAK-STAT YoluGlia Nöron Etkileşimi
ALS'yi Bölgesel Olarak Spesifik İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla Modellemek için Bir Elektrofizyolojik Platformun Kurulması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.