Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme

2.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62729

⸱

16 Temmuz 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molloy College

Bu makalede

Özet

Burada sunulan, pH'a duyarlı bir floresan moleküle konjuge edilen opsonize olmayan maya (zymosan) parçacıklarının makrofaj (MΦ) fagositozunun mezenkimal kök hücre (MSC) aracılı regülasyonunun dinamik görüntülerini ölçmek ve üretmek için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Mezenkimal kök hücreler (MSC) geleneksel olarak rejeneratif özellikleri için çalışılmıştır, ancak daha yakın zamanda immünoregülatör özellikleri ön plandadır. Bağışıklık hücresi aktivitesi ile etkileşime girerler ve düzenlerler. Bu çalışmanın odak noktası makrofaj fagositik aktivitesinin MSC düzenlemesidir. Makrofaj (MΦ) fagositozu, enfeksiyona doğuştan gelen bağışıklık sistemi yanıtının önemli bir parçasıdır ve MSC'nin bu yanıtı modüle ettiği mekanizmalar aktif olarak incelenmektedir. Burada sunulan, MSC ile ortak kültürdeyken pH'a duyarlı bir floresan molekülüne konjuge edilen opsonize olmayan zymosan parçacıklarının MΦ fagositozunu incelemek için bir yöntemdir. Fagositik aktivite arttıkça ve etiketli zymosan parçacıkları fagolyozomların asidik ortamına dahil edildikçe, pH'a duyarlı molekülün floresan yoğunluğu artar. Uygun ekscitasyon ve emisyon dalga boyları ile fagositik aktivite floresan spektrofotometre kullanılarak ölçülür ve kinetik veriler 70 dakikalık bir süre içinde göreceli floresan ünitelerde değişiklik olarak sunulur. Bu nicel verileri desteklemek için, fagositik aktivitedeki değişiklik dinamik görüntüleme kullanılarak görselleştirilir. Bu yöntemi kullanan sonuçlar, ortak kültürde MSC'nin hem naif hem de IFN-γ tedavi edilen MΦ'nin opsonize edilmemiş zymosan'ının MΦ fagositozunu artırdığını göstermektedir. Bu veriler, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin MSC düzenlemesi hakkındaki mevcut bilgi birikimine katkıda bulunur. Bu yöntem, alttaki hücresel ve moleküler mekanizmaları tam olarak tanımlamak için gelecekteki araştırmalarda uygulanabilir.

Giriş

Mezenkimal kök hücreler (MSC) bağ dokusu hücrelerine yol açan progenitör hücrelerdir. MSC yetişkin memeli dokularında bulunur ve kemik iliği1'denizole edilebilir. İmmünomodülatör özellikleri nedeniyle, bu hücreler yaygın olarak incelenir2. T hücrelerinin MSC regülasyonuna odaklanan ilk çalışmalar3,4,5,6, ancak daha yakın zamanda, doğuştan gelen bağışıklığın önemli bir hücresel bileşeni olan makrofaj hücrelerinin (MΦ) düzenlenmesi, 7 , 8 , 9,10,11,12,13,14'ün dikkatini çekmiştir. . Msc-MΦ etkileşiminin enflamatuar hastalığın tedavisindeki önemi, monositlerin / makrofajların tükenmesinin MSC'nin hayvan modellerinde terapötik etkilerini kırdığı gerçeği ile altı çizilmiştir8. Burada, odak noktası MSC'nin MΦ ile hücre teması etkileşimidir. MSC, enflamatuar yanıtlardan antienflamatuar yanıtlara geçişi teşvik ederek MΦ'nin fenotipini düzenleme kapasitesine sahiptir ve doku onarım faaliyetlerine yol açarak 8,9,10,11ve bu düzenleyici mekanizmaları göstermek için çok şey yapılmıştır. Diğer durumlarda, MSC MΦ güdümlü enflamatuar yanıt12,13'ü destekleyebilir veya şiddetlendirebilir ve MΦ fagositik aktivitesiniartırabilir 14,15. Bununla birlikte, MSC'nin MΦ fagositik etkinliğini düzenlediği mekanizmaları ve koşulları tanımlayan kritik bir mevcut veri eksikliği vardır.

MΦ, fenositoza yol açan opsonize (antikor veya tamamlayıcı kaplamalı) veya opsonize olmayan patojenleri tanıyan reseptör ailelerine sahiptir16. İkincisinin aktivasyonu ve aktivitesi daha az iyi çalışılmıştır17. İnflamatuar olmayan bir in vitro ortamda, MSC opsonize olmayan patojenlerin MΦ fagositozunu geliştirir13. Bununla birlikte, uyarlanabilir bir immün yanıt sırasında lenfositler tarafından üretilen enflamatuar bir ortama maruz kaldıktan sonra opsonize olmayan patojenlerin MΦ tarafından tanınması azaltılabilir. Doğal öldürücü hücreler ve efektör lenfositler tarafından salınan IFN-γ, opsonize olmayan parçacıkların MΦ fagositozu üzerinde inhibitör bir etkiye sahiptir18. MSC'nin MΦ fagositozunun doğrudan temas regülasyonunun mekanizmalarını incelemek için bir ortak kültür modeli geliştirilmiştir. Burada sunulan deneyin amacı, MSC'nin MΦ'nin IFN-γ maruz kaldıktan sonra opsonize olmayan patojenlerin MΦ fagositozunu düzenleyip düzenlemediğini belirlemektir (Şekil 1).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Tüm orta hazırlık ve hücre kültürü teknikleri, laminer akışlı bir biyogüvenlik kabini kullanılarak aseptik koşullar altında gerçekleştirilir. Açıklanan tüm kültür kuluçka adımları, 37 °C, %5 CO2ve %95 nem atmosferini korumak için tasarlanmış bir inkübatör kullanılarak gerçekleştirilir.

1. Hücre kültürü

  1. Büyüme ortamının hazırlanması
    1. MSC ve LADMAC için, 500 mL yüksek glikoz DMEM'e 50 mL FBS ve 5 mL 100x antibiyotik / antimykotik karışım ekleyin.
    2. MΦ için, 500 mL FBS, 100 mL LADMAC durum ortamı (bölüm 1.2 adımlarını izleyerek hazırlanmış) ve 500 mL yüksek glikoz DMEM'e 5 mL 100x antibiyotik karışımı ekleyin.
      NOT: LADMAC hücreleri, MΦ hücrelerinin büyümesini desteklemek için gerekli koloni uyarıcı faktör (CSF-1) üretir.
  2. LADMAC şartlandırılmış ortamın hazırlanması
    1. DONMUŞ stoktan LADMAC hücrelerini tohumlamak için, beş T75 cm2 hücre kültürü işlenmiş şişenin her birine bölüm 1.1'den 19 mL büyüme ortamı ekleyin ve 37 °C'ye eşit olarak 15 dakika boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
    2. Bu arada, 37 °C'lik bir su banyosunda2-3 dakika kuluçkaya ya da çözülene kadar 10 6 donmuş hücreden oluşan bir aliquot'u hızlı bir şekilde çözün. Hücreleri 15 mL veya 50 mL steril konik tüpte 9 mL taze MSC büyüme ortamına ekleyin ve 5 dakika boyunca sallanan bir kova rotorunda 125 x g'da santrifüj ekleyin.
    3. Süpernatantı aspire edin veya dekantlayın, 5 mL taze büyüme ortamı ekleyin ve hücre peletini yeniden canlandırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipet ekleyin.
    4. Steril bir serolojik pipet kullanarak beş T75 cm 2 şişenin her birine1 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
    5. Her 2-3 günde bir, 7-10 günlük bir süre boyunca ek 10 mL orta ekleyin. Daha sonra, hücreleri ve süpernatantı steril 50 mL konik tüpler halinde 5 dakika boyunca 125 x g'da steril bir serolojik pipet ve santrifüj kullanarak toplayın.
    6. Süpernatantı hücre peletinden ayırın ve 0,2 μm steril tek kullanımlık vakum filtre ünitesi kullanarak süpernatantı steril filtreleyin.
      1. Aspiratör tertibatını paketten çıkarın ve elektrikli boru kullanarak aspiratör pompasına bağlayın. Üst bölmeye üst bölmeye dökün ve kapağı değiştirin. Alt bölmeye filtrelemek için aspiratör pompasını açın.
      2. 50 mL steril konik borulara pipetleme yaparak aliquots hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
    7. Hücre peletini dondurmak için, 106 hücre / mL'de dondurucu ortamda yeniden depolayın, bir dondurucu kabına yerleştirin ve ardından -80 ° C dondurucuya yerleştirin. 24 saat sonra LN2 depolama alanına aktarın.
  3. Ortak kültüre hazırlık için hücreleri yayma
    1. Donmuş stoktan MSC ve MΦ hücrelerini tohumlamak için, dört 100 mm hücre kültürünün her birinde bölüm 1.1'de hazırlanan uygun büyüme ortamının 9 mL'sini eşit olarak her hücre tipi için işlenmiş yemekler ve 15 dakika boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
    2. Bu arada, 106 donmuş hücrenin aliquotlarını 37 °C'lik bir su banyosunda 2-3 dakika veya sadece çözülene kadar inkübe ederek hızlı bir şekilde çözün. Daha sonra, çözülmüş MSC hücrelerini 9 mL taze MSC büyüme ortamına ekleyin ve çözülmüş MΦ hücrelerini 15 veya 50 mL steril konik tüplerde 9 mL taze MΦ büyüme ortamına ekleyin ve 5 dakika boyunca sallanan kova rotorunda 125 x g'da santrifüj ekleyin.
    3. Üst soyunun aspire veya dekant ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ile uygun taze büyüme ortamının 4 mL her pelet resuspend. 1.3.1 adımında dengelenmiş her hücre tipi için dört 100 mm'lik yemeğin her birine 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
    4. Hücreli bulaşıkları inkübatöre geri verin. Ortamı her 2-3 günde bir% 70-% 80 bir araya gelene kadar değiştirin.

2. Deneysel yemeklerde tohum MSC, Gün 1

NOT: MSC'nin tohumunu atadan önce, floresan spektrofotometri için deneysel 96 kuyu plaka düzenini ve dinamik görüntüleme için oda kaydırağını tasarlayın. 96 kuyu plakası için, hücre içeren kuyulara sahip deneysel kuyuları kuşatın, ancak testte kullanmayın. Reaktif boşluğu (RBL) için kullanılacak en az dört kuyuyu işaretleyin. Örnek bir 96 kuyu şablonu için Tablo 1'e ve 4 kuyulu oda slayt şablonu örneği için Tablo 2'ye bakın. Açık tabanlı siyah veya beyaz 96 kuyu plakaları önerilir. 1,5 mm borosilikat cam bölme kaydırağı en uygun olanıdır, ancak oda sayısı çalışma tasarımına bağlı olarak ayarlanabilir. Aşağıdaki yöntemlerin özet akış şeması Şekil 2'ye eklenmiştir.

  1. %70-%80 izdiahta, 100 mm'lik yemeklerde kültürlerden büyüme ortamını epire edin ve MSC'yi izole etmek için 5 mL PBS ekleyin.
  2. PBS'yi aspire edin, % 0.05 trypsin / EDTA'nın 2 mL'sini ekleyin ve 3-5 dakika boyunca kültür inkübatörüne yerleştirin.
  3. 3 dakika sonra, ters bir mikroskop kullanarak hücre müfrezesini kontrol edin. Hücreler ayrılırsa, sonraki adıma geçin; değilse, 1-2 dakika daha inkübasyona devam edin. 5-6 dakikadan uzun süre kuluçkaya yatmayın.
  4. Müstakil hücrelerle yemeğe 5 mL taze büyüme ortamı ekleyin. Trypsin/medium karışımını kullanarak yemeği durulayın ve steril bir serolojik pipet kullanarak hücreleri temiz, steril 50 mL konik bir tüpe toplayın.
  5. 125 x g'da5 dakika santrifüj. Süpernatantı emiş edin ve hücre peletini hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ile 10 mL taze büyüme ortamında yeniden diriltin.
  6. Hücreleri saymak için, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde% 0,4 trypan mavi çözeltisinin 30 μL'sine 10 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Daha sonra, bir hemositometre sayım odasının kapakları altında karışımın pipeti 10 μL.
  7. Ters veya parlak alan mikroskobu kullanarak, 10x hedefiyle, 1 mm2 karenin dördünde yersiz (uygulanabilir) hücreleri sayın. Formülü kullanarak hücre numarasını hesaplayın: hücreler/mL = hücre sayısı/# 1 mm2 kare x seyreltme faktörü x 104.
    NOT: Bu örnekte, sayılan 1 mm2 kare sayısı dörttür ve seyreltme faktörü 4'tür.
  8. 1 x105 hücre/mL süspansiyonu hesaplamak ve hazırlamak içinC1 V 1 = C 2 V2 denklemini kullanın. Doldurulacak 96 kuyulu plakanın her kolonu için 1 mL hücre/mL süspansiyon ve plaka tasarımına göre doldurulacak 4 kuyulu hazneli slaydın her odası için 0,75 mL hazırlayın.
    NOT: C1 = hücre sayısı, V1 = hesaplananlar, C2 = 1 x 105, V2 = 5,50 mL.
  9. V1'ibelirleyin, süspansiyonu hazırlamak için gereken taze ortamın hacmini belirlemek için toplam hacmin istenen 5,50 mL'sinden çıkarın. Orijinal süspansiyondan hücre hacmini (V1) 1 x 105 hücre/mL ile toplam 5,50 mL taze ortam hacmine ekleyin.
  10. Plaka tasarımına göre çok kanallı bir mikropipettor kullanarak plaka tasarımına göre 100μL 1 x 10 5 hücre/mL süspansiyon ve oda kaydırağı kuyularının her birine plaka tasarımına göre 530 μL ekleyin. Bir gecede kuluçkaya yaslanın.
    NOT: Bu deney için MSC, 96 kuyu plakasının 1, 2, 3 ve 6 numaralı sütunlarında (Tablo 1) ve 4 kuyulu oda slaydının 1 ve 2 numaralı kuyularında(Tablo 2)kaplanır. Bu nedenle, 1 x 10 5 hücre/ mL süspansiyonun en az5,50 mL'si hazırlanır. MΦ% 80'de izdiham, MSC'nin deneysel plakalarda tohumladığı gün enflamatuar mediatörlerle tedavi edilir.

3. MΦ'yi IFN-γ ile etkinleştirin, Gün 1

  1. Etkinleştirme ortamını ve IFN-γ stoğunu hazırlayın.
    1. 200 mL aktivasyon ortamı için, 200 mL serumsuz yüksek glikoz DMEM'e 40 mg BSA ve 0,2 μm steril tek kullanımlık vakum filtre ünitesi kullanarak steril filtre ekleyin.
    2. %0,1 BSA/PBS hazırlamak için 20 mg BSA ila 20 mL PBS ekleyin. Çözülecek girdap. Temiz, steril 50 mL konik bir tüpe filtrelemek için 0,2 μm steril şırınna filtresi kullanın.
    3. 100 μg/mL stok çözeltisi elde etmek için 100 μg liyofilize IFN-γ steril %0,1 BSA/PBS çözeltisinin 1 mL'sini ekleyin. -20 °C'de 50 μL aliquots'ta saklayın.
  2. MΦ'i IFN-γ ile etkinleştirme
    1. gereken ortamın her 1 mL'si için 2,5 μL 100 μg/mL IFN-γ stoğu ekleyin. Etkinleştirilecek her 100 mm'lik çanak için, 250 ng/mL konsantrasyonda IFN-γ içeren 10 mL aktivasyon ortamı hazırlayın.
    2. MΦ kültürlerinden büyüme ortamını epire edin ve durulamak için IFN- γ olmadan aktivasyon ortamının 5 mL'si ile değiştirin.
    3. Durulama için kullanılan ortamı aspire edin ve deneysel çanak için 10 mL IFN- γ takviyeli aktivasyon ortamı ve kontrol için 10 mL takviyesiz aktivasyon ortamı ile değiştirin. Kültürleri 16-24 saat kuluçkaya yatır.

4. MΦ izole ve ortak kültürleri hazırlamak, Gün 2

  1. Aktivasyon ortamını MΦ hücrelerinden çıkarın ve 5 mL taze büyüme ortamı ile değiştirin. Bir hücre kaldırıcı ile hafifçe kazıyın ve hücreleri 50 mL konik bir tüpe toplayın.
  2. MSC için açıklandığı gibi trippan mavi dışlama ve hemositometri kullanarak hücreleri sayın, adım 2.6-2.7.
  3. Denklemi 2.8-2.9 adımlarında kullanarak, biri kontrolden hücrelerle ve diğeri tedavi edilen MΦ kültürlerinden hücrelerle olmak üzere 2 x10 5 hücre/mL'lik iki ayrı süspansiyon hazırlayın.
    NOT: Doldurulacak 96 kuyulu plakanın her kolonu için 1 mL hücre/mL süspansiyon ve plaka tasarımına göre doldurulacak 4 kuyulu hazneli slaydın her odası için 0,75 mL hazırlayın.
  4. MK'yi içeren 96 kuyu plakasının deneysel kuyularından ortamı hafifçe epire edin. Çok kanallı bir mikropipette kullanarak, plaka tasarımına göre MSC'li ve MSC'siz uygun deneysel kuyulara 100 μL işlem görmüş ve MΦ hücre süspansiyonlarını kontrol edin. Bir gecede kuluçkaya yaslanın.
  5. Ortamı MSC içeren 4 kuyulu hazne slaydından hafifçe emiş ve bir mikropipette kullanarak, tasarıma göre uygun kuyulara 530 μL MΦ hücre süspansiyonu ekleyin. Bir gecede kuluçkaya yaslanın.

5. Fagositoz tahlil, kinetik floresan 96 kuyu plakası okuma, Gün 3

  1. Test parametrelerini ayarlama
    1. Tahlil günü, floresan plaka okuyucuyu açın ve sistemdeki sıcaklığı 37 ° C'ye ayarlayın.
    2. System Pro yazılımını açın ve cihazın bilgisayara bağlı olup olmadığını belirlemek için sol üst köşedeki enstrüman simgesini kontrol edin. Çizgili kırmızı daire görünüyorsa, müzik aleti simgesine tıklayın ve bağlantıyı kurmak için açılır penceredeki enstrümanı seçin.
    3. Plaka Kurulum Yardımcısı açılır penceresine erişmek için Yeni Deneme'yi seçin. Plaka Kurulum Yardımcısı menüsünden Edinme Ayarlarınızı Yapılandır'ı seçin.
    4. Optik yapılandırma için ayarlar menüsünden Monokromatör'u seçin. Okuma modu için FL (floresan) ve okuma türü için Kinetik'i seçin.
    5. Aynı yapılandırmalar penceresinde, Kategorialtında Dalga Boyları 'nıtıklatın ve bant genişliklerini uyarım için 9 nm ve emisyon için 15 nm olarak ayarlayın.
    6. Dalga Boyu Çiftlerinin Sayısını 1 olarak ayarlayın. LM1 dalga boylarını heyecan için 510 nm'ye ve emisyon için 540 nm'ye ayarlayın.
    7. Kategoriler arasında devam edin ve sonraki Plaka Türü'nü seçin. Kullanılan plaka türüyle eşleşen seçeneği belirleyin.
      NOT: Seçimin plaka türüyle eşleşmesi önemlidir. Okuma yükseklikleri sistem tarafından seçime göre ayarlanır.
    8. Ardından, Alanı Oku'u seçin ve deneysel tasarıma dahil edilen 96 kuyu plakasının alanını vurgulayın.
    9. PMT ve Optik 'iseçin, PMT Kazancını Yüksek ve okuma başına Yanıp Sönen değer 6olarak ayarlayın. Alttan okuma plakası kullanıyorsanız Alttan Oku'nun yanındaki kutuyu işaretleyin.
    10. Zamanlama'yı seçin ve 70 dakikalık bir süre boyunca 10 dakika aralıklarla ayarlayın.
    11. Salla 'yıseçin, İlk Okumadan Önce kutusunu işaretleyin ve 5 sn olarak ayarlayın. Okumalar Arasında kutusunu işaretleyin ve 3 sn olarak ayarlayın. Hem Düşük hem de Doğrusal olarak sallama yoğunluğunu ayarlayın.
    12. Pencereyi kapatın. Plaka Kurulum Yardımcısı penceresi açılırken Plaka Düzeninizi Yapılandır'ı seçin. Plaka tasarımının BL kuyularını vurgulayın ve Plaka Boşluğu'na tıklayın.
    13. Deneysel satırların her birini vurgulayın, Ekle 'yetıklayın, grubu adlandırın ve bir renk seçin.
    14. Plaka tasarımının altındaki Atama Seçenekleri'nin altında Seri'yi seçin ve pencerede seriyi tanımlayın ve Tamam 'ıtıklatın. Her grup için tekrarlayın.
  2. Zymosan süspansiyonu hazırlayın
    1. Sistem sıcaklığının 37 °C'ye ulaşmasını beklerken, canlı hücre görüntüleme ortamının 5 mL'sinde 1 mg zymosan partiküllerini yeniden yaşayın.
      1. Parçacıkları içeren şişeye 1 mL canlı hücre görüntüleme ortamı ekleyin ve bunları bir cam kültür tüpüne toplayın. Şişeyi ek bir 1 mL görüntüleme çözeltisi ile durulayın ve tüm parçacıkların aktarıldığından emin olmak için aynı cam tüpe aktarın. 0,2 mg/mL parçacık süspansiyonu elde etmek için 3 mL ek görüntüleme çözümü ekleyin.
    2. 30-60 s için hızlı darbeli girdap. Ardından, 60 hızlı darbe ile sonicate etmek için bir sonda sonicator kullanın.
      NOT: Parçacıkların homojen bir süspansiyonu oluşturmak ve süspansiyonun deneysel kuyulara eklemeden önce çok uzun süre oturmasına izin vermemek çok önemlidir. Topaklanma hızla yineler. Hücre yoğunluğu başına partikülün, kullanılan MΦ kaynağına, tedavisine ve yoğunluğuna bağlı olarak optimize edilmesi gerekebilir. Sunulan çalışmalarda konjuge zymosan parçacıkları kullanılmıştır. Bununla birlikte, eşli E. coli ve S. aureus da mevcuttur.
  3. Zymosan ekleyin ve plakayı okuyun
    1. Ortamı deneysel kuyulardan emiş edin ve canlı hücre görüntüleme çözeltisinin 100 μL'si ile 1x durulayın. RBL kuyularını canlı hücre görüntüleme çözümüyle de durulayın.
    2. Canlı hücre görüntüleme solüsyonunun deneysel ve RBL kuyularından emiş ve bölüm 5.2'de hazırlanan 100 μL zymosan parçacık süspansiyonu ile değiştirin.
    3. Dokunmatik yüzey arayüzünü kullanarak floresan okuyucunun plaka tepsisini açın. Plakayı kapaksız olarak, sol üst köşede A1 kuyusu bulunan tepsiye yerleştirin. Dokunmatik yüzeyi kullanarak tepsiyi kapatın ve üst menüdeki yeşil Oku düğmesine tıklayın.
    4. Okuma tamamlandığında, dosyayı uygun klasöre kaydedin ve Dosya 'yı tıklatıp Dışarı Aktar 'ı seçerek verileri elektronik tablo biçiminde dışa aktarabilirsiniz.
    5. Elektronik tablodaki (Tamamlayıcı Dosya 1) her çoğaltma grubu için ortalama ± SEM göreli floresanını her zaman noktasında(10dk, 20 dk, 30 dk vb.) hesaplayın ve verileri grafik yazılımına aktarın.
    6. Verileri sunmak ve iki yönlü ANOVA (Faktör olarak Zaman x Tedavi/MSC) uygulamak için bir çizgi grafik biçimi kullanın ve ardından tek tek gruplar arasındaki farkları belirlemek için Tukey'in çoklu karşılaştırma testi.
      NOT: 96 kuyulu plaka okuması devam ederken, dinamik görüntüleme plakasını zaman atlamalı görüntü alımı için hazırlayın. Dinamik görüntülemenin aynı anda bir deneysel kuyunun analiziyle ilerlediğinden emin olun.

6. Fagositoz tahlil, dinamik görüntüleme, 3.

  1. Görüntüleme sistemini ve bilgisayarı açın. Yazılımı açmak için çift tıklatın. Pro program modunu seçin.
  2. Numune olmadığından ve hiçbir şeyin sahnenin hareketini engellemedip engellemedine emin olmak için sahne alanını kontrol edin. Ardından, Şimdi Kalibre 1'etıklayın.
  3. Sağdaki kenar çubuğundaki Kuluçka menüsünün altında, H Unit XL'in yanındaki kutuyu işaretleyin ve 37 °C olarak ayarlayın.
    NOT: Numuneleri görüntüleme için hazırlamadan önce inkübe aşaması neredeyse sıcaklığa gelene kadar bekleyin.
  4. İlk deneysel kuyuyu 750 μL görüntüleme ortamı ile durulayın ve bölüm 5.2'de hazırlanan 400 μL zymosan parçacık süspansiyonu ile değiştirin. Kalan kuyuları büyüme ortamında bırakın.
    NOT: 15 dakikadan fazla yerleşmişse parçacık süspansiyonu kısa bir süre için girdap ve sonicate gerekebilir.
  5. Slaydı görüntüleme sisteminin inkübe aşamasına yerleştirin. Bir zamanlayıcıyı 10 dakikaya ayarlayın.
  6. Görüntüleme yazılımını kullanın, Bul sekmesinin altında Brightfield'ı seçin ve aşağıdaki sistem yapılandırma penceresindeki göz merceği simgesine tıklayın. 10x hedefiyle, hücrelere odaklanmak için göz merceği ve odaklama düğmesini kullanın.
  7. Edinme sekmesini seçin, Deneme açılan menüsünü kullanın ve ardından pH'a duyarlı boyanın 509 nm ekscitasyon 533 nm emisyon dalga boylarını barındıracak şekilde EGFP filtre kümesini içeren bir dalga boyları kümesi seçin.
  8. Zamanlayıcıda ~2 dakika kaldığında, objektif menüdeki 20x simgesine tıklayarak hedefi 20x olarak değiştirmek için yazılımı kullanın.
    1. Kanallar menüsüne tıklayın, EGFP filtrelerini seçin ve pozlama süresini 400 ms'ye ayarlamak için pozlama menüsünü kullanarak pH'a duyarlı yeşil floroforu fagolysosome içine alındıktan sonra algılayın.
    2. Canlı'ya tıklayın ve odaklama düğmesini kullanarak odağı ayarlayın.
  9. Işığı kapatmak için Durdur'a tıklayın ve üstteki Zaman atlamalı deneysel ayarın yanındaki kutuyu işaretleyin.
  10. Odaklama Stratejisi menüsünde Yazılım Otomatik Netleme'yi seçin. Otomatik odaklama menüsündeki açılır menüden, otomatik odaklama çalışırken ışığa maruz kalma süresini azaltmak için Akıllı ve Kaba ayarları seçin.
  11. Zaman Atlamalı menüsünde, istenen alım sayısını 30-60 ve aralık süresini 1 dk olarak ayarlayın.
  12. Zaman atlamalı parametreler ayarlandıktan ve parçacıkların ilk kuyuya 10 dakika eklenmesinden sonra, alıma başlamak için Denemeyi Başlat düğmesine tıklayın.
  13. İlk deneysel kuyu kullanılarak edinme tamamlandığında, kalan deneysel kuyuların her biri için 6.4-6.12 adımlarını tekrarlayın.
  14. Başlıktaki tarih ve parametrelere sahip tüm deneme dosyalarını uygun klasöre kaydedin.
  15. Yazılımı kapatın. Yazılımı İşleme modunda yeniden açın ve Dışa Aktar menüsünü kullanarak dosyaları MP4 biçiminde dışa aktarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Her grup için ortalama ± SEM her zaman noktasında hesaplandıktan sonra, veriler Y ekseni ile Göreli Floresan Yoğunluğu ve X ekseni Zaman olarak çizgi grafik biçiminde sunulur. Tamamlayıcı Dosya 1, 96 kuyu plakasının elektronik tablo biçimindeki kinetik okumasından ham veri örneği sağlar.

Bu çalışmada, Şekil 3Ave Tablo 3'te sunulan en uygun sonuçlar, 1) MSC ile ortak kültürün makrofajın fagositik aktivitesini artırdığını, 2) IFN-y ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

PH'a duyarlı bir boyaya konjuge edilen biyopartiküller kullanılarak fagositozun analizi, geleneksel floresan etiketli parçacıklara göre avantajlı olduğu kanıtlanmış nispeten yeni bir araçtır12,19,20. Geleneksel floresan etiketli parçacıklarda, sadece uç nokta analizi mümkündür. Tespit, fagosit tarafından alınmamış parçacıkları yıkadıktan veya söndürtükten sonra floresan mikroskopi ve/veya spektroflorometri ile gerçekleştirilir. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, NSF Büyük Araştırma Aracı mekanizması tarafından hibe sayıları 1626093 ve 1919583 altında desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 Kuyulu Siyah Polistiren MikroplakaMilliporeSigmaCLS3603-48EA
%0.4 tripan mavisi çözeltisiMilliporeSigmaT8154-20ML
15 mL ve 50 mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj TüpleriThermoFisher339653
4 Kuyulu Odacıklı Kapak Camı, çıkarılabilir olmayan kuyularThermoFisher155382PK
Antibiyotik-Antimikotik (100X)  GibcoThermoFisher15240096
Axiobserver 7 Görüntüleme SistemiZeiss
Sığır Serumu Albümini (BSA)MilliporeSigmaA8806-1G
Hücre kaldırıcıMilliporeSigmaCLS3008-100EA
Kültür şişeleri, doku kültürü ile muamele edilmiş, yüzey alanı 75  cm2, eğimli boyun, kapaklı, filtreliMilliporeSigmaC7231-120EA
D1 ORL UVA [D1]ATCCCRL-12424Fare MSC Hücre Hattı
DMEM, Yüksek GlikozluThermoFisher11965092
Fetal Sığır Serumu, nitelikli, ısıyla inaktiveThermoFisher16140071
HemositometreFisherScientific02-671-51B
I-11.15ATCCCRL-2470Fare MΦ Hücre Hattı
LADMAC Hücre HattıATCCCRL-2420LADMAC hücreleri, büyüme faktörü koloni uyarıcı faktör 1'i (BOS-1) salgılar.
Canlı Hücre Görüntüleme çözümüThermoFisherA14291DJ
PBS, pH 7.4ThermoFisher10010031
pHrodo Green Zymosan Biyopartiküller KonjugeThermoFisherP35365
Rekombinant Murin IFN-&gama;Preprotech315-05
Spectramax i3XMoleküler Cihazlar
Steril Tek Kullanımlık Vakum Filtre Üniteleri, 250 mL, 0.2 & mThermoFisher568-0020
Steril şırınga filtreleri, 0,2 mikrometreThermoFisher723-2520
Doku kültürü ile muamele edilmiş kültür kapları, 100 mm x 20 mmMilliporeSigmaCLS430167-100EA
Tripsin-EDTA (%0,05), fenol kırmızısıThermoFisher25300054
edilmiş

Kaynaklar

  1. Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
  2. Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
  3. Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
  4. Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988(2011).
  5. Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
  6. Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65(2013).
  7. Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088(2010).
  8. Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
  9. Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252(2010).
  10. Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
  11. Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
  12. Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56(2015).
  13. Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70(2014).
  14. Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257(2017).
  15. Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
  16. Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 3-23 (2010).
  17. Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
  18. Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
  19. Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
  20. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
  21. Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mezenkimal K k H crelerKo K lt r Y ntemiDo al Ba kl kFagositoz AnaliziZymosan Partik lleriFloresan G r nt lementerferon GamaH cre Say mFago lizozomal Floresans
Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.