Burada sunulan, pH'a duyarlı bir floresan moleküle konjuge edilen opsonize olmayan maya (zymosan) parçacıklarının makrofaj (MΦ) fagositozunun mezenkimal kök hücre (MSC) aracılı regülasyonunun dinamik görüntülerini ölçmek ve üretmek için bir protokol sunulmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Makrofaj Fagositozun Mezenkimal Kök Hücre Regülasyonu; Nicellik ve Görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Mezenkimal kök hücreler (MSC) geleneksel olarak rejeneratif özellikleri için çalışılmıştır, ancak daha yakın zamanda immünoregülatör özellikleri ön plandadır. Bağışıklık hücresi aktivitesi ile etkileşime girerler ve düzenlerler. Bu çalışmanın odak noktası makrofaj fagositik aktivitesinin MSC düzenlemesidir. Makrofaj (MΦ) fagositozu, enfeksiyona doğuştan gelen bağışıklık sistemi yanıtının önemli bir parçasıdır ve MSC'nin bu yanıtı modüle ettiği mekanizmalar aktif olarak incelenmektedir. Burada sunulan, MSC ile ortak kültürdeyken pH'a duyarlı bir floresan molekülüne konjuge edilen opsonize olmayan zymosan parçacıklarının MΦ fagositozunu incelemek için bir yöntemdir. Fagositik aktivite arttıkça ve etiketli zymosan parçacıkları fagolyozomların asidik ortamına dahil edildikçe, pH'a duyarlı molekülün floresan yoğunluğu artar. Uygun ekscitasyon ve emisyon dalga boyları ile fagositik aktivite floresan spektrofotometre kullanılarak ölçülür ve kinetik veriler 70 dakikalık bir süre içinde göreceli floresan ünitelerde değişiklik olarak sunulur. Bu nicel verileri desteklemek için, fagositik aktivitedeki değişiklik dinamik görüntüleme kullanılarak görselleştirilir. Bu yöntemi kullanan sonuçlar, ortak kültürde MSC'nin hem naif hem de IFN-γ tedavi edilen MΦ'nin opsonize edilmemiş zymosan'ının MΦ fagositozunu artırdığını göstermektedir. Bu veriler, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin MSC düzenlemesi hakkındaki mevcut bilgi birikimine katkıda bulunur. Bu yöntem, alttaki hücresel ve moleküler mekanizmaları tam olarak tanımlamak için gelecekteki araştırmalarda uygulanabilir.
Giriş
Mezenkimal kök hücreler (MSC) bağ dokusu hücrelerine yol açan progenitör hücrelerdir. MSC yetişkin memeli dokularında bulunur ve kemik iliği1'denizole edilebilir. İmmünomodülatör özellikleri nedeniyle, bu hücreler yaygın olarak incelenir2. T hücrelerinin MSC regülasyonuna odaklanan ilk çalışmalar3,4,5,6, ancak daha yakın zamanda, doğuştan gelen bağışıklığın önemli bir hücresel bileşeni olan makrofaj hücrelerinin (MΦ) düzenlenmesi, 7 , 8 , 9,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Tüm orta hazırlık ve hücre kültürü teknikleri, laminer akışlı bir biyogüvenlik kabini kullanılarak aseptik koşullar altında gerçekleştirilir. Açıklanan tüm kültür kuluçka adımları, 37 °C, %5 CO2ve %95 nem atmosferini korumak için tasarlanmış bir inkübatör kullanılarak gerçekleştirilir.
1. Hücre kültürü
- Büyüme ortamının hazırlanması
- MSC ve LADMAC için, 500 mL yüksek glikoz DMEM'e 50 mL FBS ve 5 mL 100x antibiyotik / antimykotik karışım ekleyin.
- MΦ için, 500 mL FBS, 100 mL LADMAC durum ortamı (bölüm 1.2 adımlarını izleyerek hazırlanmış) ve 500 mL yüksek glikoz DMEM'e 5 mL 100x antibiyotik karışımı ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Her grup için ortalama ± SEM her zaman noktasında hesaplandıktan sonra, veriler Y ekseni ile Göreli Floresan Yoğunluğu ve X ekseni Zaman olarak çizgi grafik biçiminde sunulur. Tamamlayıcı Dosya 1, 96 kuyu plakasının elektronik tablo biçimindeki kinetik okumasından ham veri örneği sağlar.
Bu çalışmada, Şekil 3Ave Tablo 3'te sunulan en uygun sonuçlar, 1) MSC ile ortak kültürün makrofajın fagositik aktivitesini artırdığını, 2) IFN-y .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
PH'a duyarlı bir boyaya konjuge edilen biyopartiküller kullanılarak fagositozun analizi, geleneksel floresan etiketli parçacıklara göre avantajlı olduğu kanıtlanmış nispeten yeni bir araçtır12,19,20. Geleneksel floresan etiketli parçacıklarda, sadece uç nokta analizi mümkündür. Tespit, fagosit tarafından alınmamış parçacıkları yıkadıktan veya söndürtükten sonra floresan mikroskopi ve/veya spektroflorometri ile gerçekleştirilir. .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, NSF Büyük Araştırma Aracı mekanizması tarafından hibe sayıları 1626093 ve 1919583 altında desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 96 Kuyulu Siyah Polistiren Mikroplaka | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| %0.4 tripan mavisi çözeltisi | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL ve 50 mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj Tüpleri | ThermoFisher | 339653 | |
| 4 Kuyulu Odacıklı Kapak Camı, çıkarılabilir olmayan kuyular | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiyotik-Antimikotik (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Görüntüleme Sistemi | Zeiss | ||
| Sığır Serumu Albümini (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Hücre kaldırıcı | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Kültür şişeleri, doku kültürü ile muamele edilmiş, yüzey alanı 75 cm2, eğimli boyun, kapaklı, filtreli | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Fare MSC Hücre Hattı |
| DMEM, Yüksek Glikozlu | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Sığır Serumu, nitelikli, ısıyla inaktive | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemositometre | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Fare MΦ Hücre Hattı |
| LADMAC Hücre Hattı | ATCC | CRL-2420 | LADMAC hücreleri, büyüme faktörü koloni uyarıcı faktör 1'i (BOS-1) salgılar. |
| Canlı Hücre Görüntüleme çözümü | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Biyopartiküller Konjuge | ThermoFisher | P35365 | |
| Rekombinant Murin IFN-&gama; | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Moleküler Cihazlar | ||
| Steril Tek Kullanımlık Vakum Filtre Üniteleri, 250 mL, 0.2 & m | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Steril şırınga filtreleri, 0,2 mikrometre | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Doku kültürü ile muamele edilmiş kültür kapları, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Tripsin-EDTA (%0,05), fenol kırmızısı | ThermoFisher | 25300054 |
Kaynaklar
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
