Canlı hücrelerdeki bireysel makropinozomlarda pH, oksidatif olaylar ve protein sindirimi ölçümü için protokolleri açıklıyoruz. Çift florofor oranmetrik mikroskopiye ve nüfusa dayalı tekniklere göre sunduğu avantajlara vurgu yapılır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Çift Florofor Oranımetrik Mikroskopi kullanılarak Makropinozomların pH, Redoks Kimyaları ve Bozunabilir Kapasitesinin Ölçülmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Son yıllarda makropinositoz alanı hızla artmıştır. Makropinositoz, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin organizma homeostaz ve bağışıklığı koruduğu merkezi bir mekanizma olarak ortaya çıkmıştır. Aynı zamanda ve homeostatik rolünün aksine, kanser ve viral enfeksiyonlar da dahil olmak üzere çeşitli patolojileri de yönlendirebilir. Diğer endositoz modlarının aksine, makropinozomların olgunlaşmasını incelemek için geliştirilen araçlar az gelişmiş kalır. Burada protokol, erken ve olgunlaşan makropinozomların lümen içindeki redoks ortamını incelemek için yeni geliştirilen araçları açıklar. pH'ın değerlendirilmesinde ratiometrik floresan mikroskopisi, reaktif oksijen türlerinin üretimi ve canlı hücrelerdeki bireysel makropinozomların lümeni içindeki bozunma kapasitesi için metodolojiler açıklanmıştır. Tek organel ölçümler, genellikle nüfusa dayalı yaklaşımlarla kaybedilen mekansal heterojenliği ortaya çıkarma avantajı sunar. Prob seçimi, enstrümantasyon, kalibrasyon ve tek hücreli ve popülasyon tabanlı yöntemler de dahil olmak üzere çift florofor oranmetrik mikroskopinin temel ilkelerine vurgu yapılır.
Giriş
Makropinositoz, makropinozomlar1,2adı verilen membran bağlı sitoplazmik organellere büyük miktarlarda hücre dışı sıvı alımını ifade eder. Amip Diktyostelium sppgibi serbest yaşayan tek hücreli organizmalar tarafından gerçekleştirilen son derece korunmuş bir süreçtir. 3, yanı sıra antozooans4 ve metazoans2. Çoğu hücrede makropinositoz indüklenen bir olaydır. Hücre yüzeyi reseptörlerinin ligasyonu, fırfırlar olarak adlandırılan aktin tahrikli plazma membran uzantılarının çıkıntısını teşvik eder. Bu fırfırların bir kısmı, bazı kötü a....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hücrelerin hazırlanması
- Raw264.7 hücrelerini 37 °C'de ve %5 CO2 ila %70 oranında RPMI'de %10 ısı inaktive serum ile desteklenmiş olarak büyütün.
- Testten bir gün önce, tohum Raw264.7 hücreleri 96 kuyu plakasında kuyu başına 5 x10 4 hücre yoğunluğunda. Her kuyunun 100 μL büyüme ortamı içerdiğinden emin olun. 96 kuyu plakasının siyah kenarları ve görüntüleme için cam tabanlı olduğundan emin olun.
NOT: Burada görüntüleme için 96 kuyu plakası kullanılmıştır. 96 kuyu plakaları, daha büyük görüntüleme odalarına göre daha az miktarda hücre ve reaktif kullanılmasına izin verir. Bununla birlikte, canlı hücreleri görüntülemek için ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Makropinozom pH'ı ölçerken, asitleşme dinamiklerinin ölçülemediği bir süre vardır. Bu süre dektran yükleme aşamasına (Şekil 2C ve Şekil 3C, D'dekigri kutu) karşılık gelir ve kullanılan hücre tipine bağlı olarak değişir. Yükleme aşamasının uzunluğu (i) hücrelerin makropinositik aktivitesi ve (ii) kullanılan aletin hassasiyetine göre değişir. Bu sürenin her deneyin başlangıcında hem floresan hem de TMR kanalları için 4:1'den büyük bir sinyal:gürü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Makrofajlarda, fibroblastlarda ve hatta Diktinostelium spp'de makropinositik alımın hem düşük hem de yüksek verimli ölçümleri için bir dizi protokol olmasına rağmen. 3,7,31,32,33, bu dinamik bölmelerin ışık biyokimyasını ölçmek için çok az girişimde bulunulmuştır. Bunun nedeni, diğer endosik bölmelerden kaçınırken makropinosomal bölmeye verimli bir şe.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Calgary Üniversitesi'ne desteği için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Robin Yates'e reaktiflere, ekipmanlara ve faydalı tartışmalara erişim için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Siyah duvarlı 96 kuyulu plaka | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dekstran-amino 70 kDa | İnvitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbümin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dekstran 70 kDa | İnvitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nijerin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 hücreleri | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI ortamı | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Konfokal Mikroskop | Leica | - | |
| TRITC-dekstran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Çanak | Ibidi | 81156 |
Kaynaklar
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766(2017).
- Williams....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
