Farelerde İçSel Kardiyak Pacemaking Kusurlarını Belirlemek için Sinoatrial Düğüm Ateşleme Hızının Mikroelekrod Dizisi Kaydı

Kalp, beyinden kaynaklananlar gibi hem kardiyak hem de dışsal etkiler tarafından yönetilen karmaşık bir organdır. Sinoatrial düğüm (SAN), kalp pili hücrelerini (sinoatrial hücreler veya SA hücreleri olarak da adlandırılır) memeli kalp atışının başlatılmasından ve sürekliliğinden sorumlu olan kalp pili hücrelerini barındıran tanımlanmış bir bölgedir^1,2. İç kalp atış hızı, kalp pili hücrelerinin diğer kardiyak veya nöro-humoral etkilerden etkilenmeden yönlendirdiği hızdır, ancak insanlarda ve elektrokardiyogramlar gibi canlı hayvanlarda geleneksel kalp atış hızı önlemleri kalp üzerindeki hem kalp pilini hem de sinirsel etkileri yansıtır. SA hücreleri üzerindeki en dikkat çekici sinirsel etki, vücudun fizyolojik gereksinimlerini karşılamak için ateşleme kalıplarını sürekli olarak modüle eden otonom sinir sisteminden³. Bu fikri destekleyen, hem sempatik hem de parasempatik projeksiyonlar SAN⁴yakınında bulunabilir. İntrinsic kardiyak sinir sistemi (ICNS), ganglionlu pleksilerin, özellikle sağ atriada, SAN^5,6aktivitesini içselleştirdikleri ve düzenledikleri bir başka önemli sinirsel etkidir.

Kalp pilimleme açıklarını anlamak klinik olarak önemlidir, çünkü işlev bozukluğu birçok kardiyak bozukluğun altında yatan ve diğer komplikasyonların riskine katkıda bulunabilir. Hasta sinüs sendromu (SSS), uygun tempo yapımını engelleyen sinoatriyal düğümün işlev bozukluğu ile karakterize bir hastalık kategorisidir^7,8. SSS sinüs bradikardi, sinüs duraklamaları, sinüs arrest, sinoatrial çıkış bloğu ve alternatif bradyarrythmias ve tachyarrhythmias⁹ ile sunulabilir ve artan embolik inme riski ve ani ölüm^8,10gibi komplikasyonlara yol açabilir. Ani kardiyak ölüm riski artan ve ventriküler fibrilasyon ile işaretlenmiş bir kardiyak bozukluk olan Brugada sendromu olanlar, komorbid SAN disfonksiyonu varsa aritmojenik olaylar için daha fazla risk altındadır^11,12. Sinoatriyal disfonksiyonun kalbin ötesinde fizyolojik sonuçları da olabilir. Örneğin, SSS'nin serebral hipoperfüzyon nedeniyle bir hastada nöbetleri tetiklediği gözlenmiştir¹³.

Sinoatriyal tempo yapma açıklarını tanımlamak için, otonom sinir sisteminin veya humoral faktörlerin etkisi olmadan SAN'ın aktivitesi ölçülerek içsel kalp atış hızlarının belirlenmesi gerekir. Klinik olarak, bu farmakolojik otonomik blokaj¹⁴ile yaklaşık olarak kullanılabilir, ancak aynı teknik memeli modellerinde içsel kardiyak fonksiyon^15,16' yı incelemek için de uygulanabilir. Bu yaklaşım, katkıda bulunan sinirsel etkilerin büyük bir kısmını bloke ederken ve in vivo kardiyak muayeneye izin verirken, kalp üzerindeki tüm dışsal etkileri tamamen ortadan kaldırmaz. Hayvan modellerinde içsel kardiyak fonksiyonu incelemek için kullanılan bir başka araştırma tekniği, tipik olarak elektrogramlar, volta veya epikardiyal multielekrod dizileri^{17 , 18 , 19,20}kullanılarak ölçümler içeren Langendorff perfüzyonlu kalpler kullanılarak izole edilmiş kalp kayıtlarıdır. Bu teknik kalbi vücuttan çıkarmayı içerdiğinden kardiyak fonksiyona daha spesifik olsa da, ölçümler hala içsel kalp atış hızı ölçümlerini etkileyebilecek mekano-elektrikli otoregülatör mekanizmalardan etkilenebilir²¹. İzole kalp kayıtları da ICNS 5^,6,^22,23aracılığıyla otonom düzenlemeden etkilenebilir. Ayrıca, kalp fonksiyon ölçümleri için kritik olan kalbin fizyolojik olarak ilgili bir sıcaklığını korumak, izole kalp yaklaşımlarında zor olabilir²⁰. SAN fonksiyonunu incelemek için daha doğrudan bir yöntem, SAN dokusunu özellikle izole etmek ve aktivitesini ölçmektir. Bu, SAN şeritleri (izole SAN dokusu) veya izole SAN kalp pili hücreleri^24,25aracılığıyla gerçekleştirilebilir. SAN çok küçük ve yüksek tanımlı bir bölge olduğu için her ikisi de yüksek derecede teknik eğitim gerektirir ve doğru yapılmazsa ayrışma hücrenin genel sağlığına zarar verebileceğinden hücre izolasyonu daha da büyük bir zorluk oluşturur. Ayrıca, bu teknikler bireysel kayıt mikroelektrodlarını kullanarak dokudan veya hücrelerden başarılı bir şekilde kayıt yapmak için uzman elektrofizyolojik beceriler gerektirir.

Bu protokolde, içsel kalp atış hızı ölçümleri elde etmek için bir mikroelektod dizisi (MEA) kullanarak SAN in vitrosunu kaydetme tekniğini açıklıyoruz. Bu yaklaşım, yoğun elektrofizyolojik becerilerden yoksun araştırmacılar için son derece spesifik elektrofizyolojik kayıtları erişilebilir hale getirme avantajına sahiptir. MEA'lar daha önce birincil kardiyomiyosit kültürlerinde kardiyomiyosit fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır^{26,27,28,29,30,31,32}, kalp tabakaları^{33,34,35,36,37,38,39}ve doku bütün binekler^{40, 41,42,43,44,45,46,47}. SAN dokusu^41,42'dekialan potansiyellerini incelemek için daha önce de çalışma yapılmıştır. Burada, murine içSEL SAN atış hızlarını kaydetmek ve analiz etmek için MEA'yı kullanmak için bir metodoloji sunuyoruz. Ayrıca, voltaj kapılı bir K⁺ kanal engelleyici olan 4-aminopyridinin (4-AP) etkilerini gösteren bir örnek deney sağlayarak ilaçların SAN iç ateşleme oranları üzerindeki farmakolojik etkilerini test etmek için bu tekniğin nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz. Tanımlanmış anatomik yer işaretlerini kullanarak, diğer yöntemlerde gerekli olan geniş doku diseksiyonlarını veya hücre izolasyonlarını yapmak zorunda kalmadan SAN'ı doğru bir şekilde kaydedebiliriz. MEA maliyet-yasaklayıcı olsa da, kayıtlar çok çeşitli klinik ve fizyolojik araştırma uygulamalarında kullanılabilecek son derece spesifik ve güvenilir pacemaking önlemleri sağlar.

Burada açıklanan tüm deneysel prosedürler, Güney Metodist Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandığı şekilde Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin (NIH) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Kayıt için multielekrod dizisinin (MEA) kaplanması

1. 25 mM borat tamponu yapın.
   1. 0.953 g Na₂B₄O₇·10 H₂O'nu 80 mL damıtılmış suda çözün.
   2. pH'ı HCl ile 8,4'e ayarlayın ve ardından 100 mL'lik son hacme damıtılmış su ekleyin.
2. %0,1 stok polietilenimin (PEI) çözeltisi yapın.
   1. %1 PEI çözeltisi yapmak için 4,9 mL damıtılmış suya %50 (w/v) PEI'nin 100 μL'sini ekleyin.
   2. 25 mM borat tamponunun 9 mL'sine %1 PEI çözeltisinin 1 mL'sini ekleyerek% 1 PEI çözeltisini borat tamponunda% 0.1'e seyreltin.
3. Pipet ~1 mL% 0.1 PEI çözeltisinin mikroelektoz dizisi (MEA) kabına, böylece elektrotlar tamamen kaplanır (Şekil 1A ve 1B).
   NOT: MEA'nın mikroelekrodları tipik olarak platin siyah veya karbon nanotüpten oluşur ve poliimid (veya akrilik) ile yalıtılır; her iki malzeme de hidrofobiktir. MEA'yı PEI gibi katyonik bir polimerle kaplayarak, hidrofobik MEA yüzeyi daha hidrofilik hale getirilir ve doku örneklerinin MEA yüzeyiyle daha iyi temas etmesini sağlar (Şekil 1A1).
4. Buharlaşmayı azaltmak için MEA kabını termoplastik filmle örtün ve MEA'yı oda sıcaklığında bir gece bırakın (Şekil 1C).
5. PEI çözeltisini bir pipet kullanarak MEA kabından epire edin, elektrotlara zarar verebilen elektrot ızgarasına dokunmamaya dikkat edin ve ardından damıtılmış suyla ≥4 kez durulayın (Şekil 1D).
6. PEI kaplı MEA'yı 1-2 mL ultra saf su altında saklayın ve gerektiğinde 4 °C'de termoplastik filmle kapatın. Alternatif olarak, kaplamalı MEA'yı ultra saf suyla dolu bir behere batırarak saklayın (Şekil 1E).
   NOT: PEI kaplama işleminin ilk kullanımından önce MEA için yalnızca bir kez gerçekleştirilmesi ve her kayıt oturumundan sonra MEA'nın ultra saf suya batırılmış olarak depolanması gerekir.

2. Doku diseksiyonu için eksiksiz Tyrode çözümünün hazırlanması

1. Diseksiyon için 1.000 mL komple Tyrode çözümü yapın; ilk olarak, 800 mL ultra saf suya 8.1816 g NaCl ekleyin.
2. Çözeltiye aşağıdaki miktarda kimyasal ekleyin: 0.4025 g KCl; 0.1633 g KH₂PO_4; 1.1915 g HEPES; 0.9999 g glikoz; 0.0952 g MgCl_2; 0.2646 g CaCl₂·2H₂O.
3. NaOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın ve ardından toplam hacim 1.000 mL olana kadar ultra saf su ekleyin.
   NOT: Komple Tyrode çözeltisinin son bileşimi aşağıdaki olacaktır (mM):140 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 KH₂PO₄, 5 HEPES, 5.55 glikoz, 1 MgCl₂, 1.8 CaCl₂.

3. Oksijenli Tyrode'un çözümünü kayıt için hazırlama

1. Tyrode'un çözümünden 500 mL yapın; 400 mL ultra saf suya 4.003 g NaCl ekleyin.
2. Çözeltiye aşağıdaki miktarlarda kimyasal ekleyin: 0.651 g NaHCO₃; 0.042 g NaH₂PO₄; 0.132 g CaCl₂·2H₂O; 0.149 g KCl; 0.0476 g MgCl_2; 0.999 g glikoz.
3. pH'ı HCl ile 7,4'e ayarlayın ve ardından toplam hacim 500 mL olana kadar ultra saf su ekleyin.
4. Kayda başlamadan önce çözeltiyi oda sıcaklığında en az 30 dakika karbojen ile oksijene edin.
   NOT: Tyrode çözeltisinin son bileşimi aşağıdaki olacaktır (mM): 137 NaCl, 15.5 NaHCO₃, 0.7 NaH₂PO₄, 1.8 CaCl₂, 4 KCl, 1 MgCl₂, 11.1 glikoz. Bu Tyrode'un çözümü, Komple Tyrode'un diseksiyon için kullanılan çözümünden biraz farklı bir bileşime sahiptir.

4. Farmakolojik modülasyon için 4-aminopyridin (4-AP) çözeltisinin hazırlanması

1. 4-AP'nin 1 mM çalışma çözümünü yapın; Adım 3'ten 200 mL'ye 18,82 mg 4-AP ekleyin.
2. Deneyden önce 4-AP çözeltisini en az 30 dakika oksijene uzatın.

5. Petri kabının diseksiyon için hazırlanması

1. Silikon elastomer bileşenlerini, tabanın kürleme maddesine 10:1 oranında (ağırlığa göre) karıştırın.
2. 60 mm çapında bir Petri kabına ~15 mL silikon elastomer karışımı dökün.
3. Elastomer'in kullanmadan önce oda sıcaklığında 48 saat kürlemesine izin verin.
   NOT: Silikonlu Petri kabı gelecekteki diseksiyonlar için yeniden kullanılabilir.

6. Sinoatriyal düğümün (SAN) diseksiyon

1. SAN diseksiyonu için heparinize Komple Tyrode'un çözümünü hazırlayın.
   1. 40 mL'lik Tam Tyrode çözeltisine 400 μL heparin (1.000 USP/mL) ekleyin ve 37 °C'lik su banyosunda ısıtın.
2. Fareye intraperitoneally olarak 200-300 μL heparin (1000 USP / mL) enjekte edin ve hayvanın 10 dakika oturmasına izin verin.
3. Heparinize fareyi aşırı dozda izotilaz ile ötenazi.
   1. Fareyi delikli plastik bir tüpün içindeki bir filtre kağıdına 200-300 μL sıvı izofluran ekleyerek üretilen izofluran buharlarını içeren küçük bir cam odaya yerleştirin.
      NOT: İzofluran cilt tahrişi neden olabilir ve cilt yoluyla da emilebilir, sıvı doğrudan fareye temas olmamalıdır. Bu nedenle, izofluran ıslatılmış mendil, uygulama için delikli bir tüpe yerleştirilir.
   2. Hareketin ve nefes alma çabasının durdurulması ve bir parmak sıkışma refleksinin olmaması ile ölümü doğrulayın. Ölüm genellikle odaya yerleştirildiden sonra yaklaşık 1-2 dakika sürer.
      NOT: Ölüme genellikle idrara çıkma eşlik edilir.
4. Fareyi pençeleri uzatılmış bir diseksiyon tahtasına bir geri zeka konumuna getirin ve pençeleri 1 inç uzunluğunda, 23 kalibrelik şırınga iğneleri kullanarak tahtaya sabitlayın. Daha sonra cerrahi makas kullanarak ve köklerdeki kürkü keserek göğüs kafesinin tabanının çevresindeki kürkü çıkarın.
   NOT: Diseksiyon panosu için polistiren soğutucu kapaklar kullanılabilir.
5. Cildi bir hemostatla tutarken, göğüs kafesinin tabanının hemen altındaki deride sol costal kemerden sağ costal kemere kadar enine bir kesi yapmak için cerrahi makas kullanın (Şekil 3A).
6. Peritonun cerrahi makasla açılmasını kesin ve karaciğeri diyaframdan dikkatlice ayırın, aşırı kanamaya neden olacak karaciğeri çentiklememeye dikkat edin (Şekil 3B). Torasik boşluğu ortaya çıkarmak için toraks boyunca diyaframı inkübe edin (Şekil 3C-D).
7. Cerrahi makas kullanarak, kalbi açığa çıkarmak için göğüs kafesinin yanal duvarlarını costal kemerlerin kenarlarından köprücük kemiğine kadar kesin, kalbe zarar vermemek için dikkatli olun (Şekil 3D). Daha sonra göğüs kafesini omuza sabitlemek için 23 kalibrelik bir şırınga iğnesi kullanın, yerinde ve cerrahi alanın dışında tutun.
8. Sıcak (37 °C) heparinize Komple Tyrode çözeltisini nemli tutmak için kalbe damlatmak için bir transfer pipeti kullanın.
   NOT: Kalbin kurumasına izin vermeyin.
9. Akciğerleri ekstra ince Graefe apartmaları ile tutarak ve ameliyat makası ile nefes borusunun koparak çıkarın (Şekil 3E).
10. Ekstra ince Graefe önlükleri ile kalbin tepesini tutun ve cerrahi makasla aort ve venae kavaeyi keserek çıkarın. Kalbi kürlenmiş silikon elastomer (Şekil 4A) içeren bir Petri kabına aktarın ve kalbi 2-3 mL sıcak (37 °C) heparinize Komple Tyrode çözeltisi ile yıkamak için bir transfer pipet kullanın.
    NOT: SAN'ı içeren sağ aryanın hassas arka duvarına ve bağlı sağ atriyal damarlara zarar vermemeye dikkat edin. Kalbi Komple Tyrode'un çözeltisi ile yıkamak kalbin kurumasına engel olur, ancak diseksiyon sırasında görünürlüğü bozacağı için kalbi çözeltiye tamamen batırmaz.
11. Kalbi deneycinin sağında sağ atriyumla ve deneycinin sol kulakçıkla yönlendirin.
    NOT: İskemiye bağlı yaralanmaları önlemek için SAN dokusunun diseksiyonu hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
12. Kalbin tepesini bir diseksiyon pimi ile yemeğe takın. Daha sonra, dumont #2 laminektomi tokaları ile alt vena kava tutarken, sağ atriyumdaki konumlarını bulmak için alt ve üstün vena kavasından 22 G'lik bir şırınga iğnesi yerleştirin, bu da SAN'ın yaklaşık konumunu tanımlar (alt ve üstün vena kava arasındaki doku yamasında bulunur (Şekil 4B).
13. Küçük diseksiyon pimleri kullanarak, sol ve sağ atriyal ekleri yemeğe sabitlayın.
    1. Sol atriyal apandisiti Dumont #2 laminektomi tokaları ile tutarken, yerinde tutmak için sol atriyal ekten bir diseksiyon pimi koyun.
    2. Dumont #55 tokaları ile doğru atriyal uzantıyı tutarken, yerinde tutmak için sağ atriyal ekten bir diseksiyon pimi koyun.
       NOT: İstenirse sol ve sağ atriyal ekleri tutmak için aynı tip tostikinler kullanılabilir.
14. Venae cavae'yi kapsayan şırınga iğnesini çıkarın.
15. Kalpten kan açığa çıkarmak için Castroviejo makasını kullanarak ventriküller boyunca enine bir kesi yaparak kalbin tepesini (yani alt yarısını) çıkarın (Şekil 4C). Daha sonra, bir transfer pipet ile sıcak (37 °C) heparinize Komple Tyrode çözeltisi ekleyerek kalbi yıkayın.
16. Castroviejo makasını kullanarak atriyoventriküler septum boyunca kesiği atria'dan daha yakın tutun. Atria ventriküllerden ayrılana kadar atriyoventriküler septum boyunca kesmeye devam edin.
17. Sol atriyumu çıkarmak için interatrial septum boyunca kesin.
18. Düz bir şekilde döşenmesi için sağ atriyumun çevresine diseksiyon pimleri yerleştirin (Şekil 4D). Castroviejo makasını kullanarak atriyumdan kalan yağları, damarları veya dokuyu çıkarın.
19. San'ı sağ atriyumda bulun, bu yönde yaklaşık olarak üstün vena kava (üstte), alt vena kava (altta) ve cristae terminali (solda) ile sınırlanmıştır (Şekil 4D).
    NOT: Crista terminalis, sağ atriyal ek ile SAN arasında koyu kas sırtı olarak görünür. Genellikle SAN arteri SAN boyunca geziniyor görülebilir (Şekil 4D).

7. MEA sistemini kayıt için hazırlama

1. Tyrode'un çözeltisini (adım 3'ten itibaren) giriş çözelti şişesine (Şekil 5C) ekleyin ve karbojen gazı akışını açarak oksijen verin (Şekil 5A).
   NOT: Kayıt için kullanılan Tyrode'un çözümü, komple Tyrode'un diseksiyon için kullanılan çözeltisinden kompozisyon olarak biraz farklıdır.
2. Gazı nemlendirmek için kullanılan konik şişedeki kabarcıkları gözlemleyerek karbojen akışını doğrulayın (Şekil 5B) ve giriş çözelti şişesi (Şekil 5C) .
3. Peristaltik pompa giriş borularını (Şekil 5D) Tirot'un kayıt çözeltisine (Şekil 5C ) yerleştirin. Ardından, peristaltik pompa çıkış borularını toplama şişesine yerleştirin (Şekil 5I).
4. Peristaltik pompayı 25 rpm'ye ayarlayın, bu da 2 mL/ dk akış hızı verir ve pompayı çalıştırın. Tampon sızıntısı veya taşması için sistemi kontrol edin.
5. Sıcaklık kontrol cihazını farelerin fizyolojik sıcaklığı olan 37 °C'ye ayarlayın (Şekil 5E).

8. Kalp dokusunu MEA ızgarasına yerleştirme

1. Parçalanmış SAN dokusunu bir boya fırçası yardımıyla (Şekil 6A) diseksiyon Petri kabından MEA ızgarasına aktarın (Şekil 1A1).
   1. Ters bir mikroskop altında bakarken, dokuyu yumuşak bir boya fırçası ile hafifçe konumlandırın, böylece SAN bölgesi elektrot ızgarasını kaplar.
   2. Elektrot ızgarası üzerinde düz bir şekilde uzandığından emin olmak için dokuyu gerektiği gibi yeniden konumlandırın ve elektrotlarla iyi temas edin.
      NOT: Elektrot ızgarasına zarar vermemek için dokuyu hareket ettirmek için yumuşak bir boya fırçası gereklidir.
2. Doku doğru yerleştirildikten sonra, ağı dokunun üzerine yerleştirmek için kemik tokaları (veya herhangi bir kavisli toka) kullanın (Şekil 6A) . Daha sonra her şeyi yerinde tutmak için arp çapasını (Şekil 6A) mesh üzerine yerleştirmek için kemik tokalarını kullanın (Şekil 6B).
3. Tek tek elektrotların aktivitesinin kayıt sırasında anatomik konumlarıyla ilişkilendirilebilmesi için mea üzerindeki dokunun konumunun bir resmini çekin. Bu, bir akıllı telefonu ters mikroskop hedefine kadar tutarak veya ekli bir mikroskop kamerası kullanılarak yapılabilir.
   NOT: Fotoğrafı çektikten sonra MEA'nın yönü değiştirilmezse, sol üst elektrot kayıt sırasında ilk kanal (Ch1) olarak görünecektir.
4. MEA kabını konektör plakasına (Şekil 5F ve 6C)yerleştirin ve harp dilimi ankrajını bozmadan perfüzyon kapağını(Şekil 6C)MEA kabına dikkatlice yerleştirin. Perfüzyon kapağı bir laboratuvar bandı parçası kullanılarak daha da sabitlenebilir (Şekil 6C).
   NOT: Ayarlanabilir çözelti giriş ve çıkış borularına sahip olmanın yanı sıra, kapak ayrıca gaz teslimatı için bir bağlantı noktasına sahiptir (Şekil 6C). Ek olarak, referans elektrot halkası kapaktan geçer (Şekil 6C).
5. Dokunun elleçlemeden iyileşmesine ve kayıttan önce 15-20 dakika odaya alışmasına izin verin.

9. Kayıt için veri toplama protokolünü ayarlama

NOT: Aşağıdaki adımda, spontan beat kaydı için yazılım protokolünün açılması ve kayıt koşullarının tanımlanması açıklanmaktadır. Bu adımların özellikleri, kullanılan belirli yazılıma bağlı olarak değişebilir, ancak genel anahat aynı kalmalıdır.

1. Amplifikatörü açın (Şekil 5G) ve bilgisayardaki yazılımdaki kayıt için bir iş akışı ayarlayın (Şekil 5H).
   1. Yazılımı açın ve İş Akışı'nı tıklatın.
   2. Yeni Klasör Aç 'ıseçin.
   3. Şablonlardan klasörünü açın.
   4. 64MD1-1920X1080 'i seçin (masaüstünüzün çözünürlüğüne bağlı olarak).
   5. QT klasörünü açın.
   6. Spontan kayıt klasörünü açın.
   7. Beat_recording.moflo şablon seçin ve açın (Şekil 7A).
2. İstenilen kayıt koşullarına göre izleme sayısını, izleme süresini, izleme aralığını, giriş voltajını, örnekleme hızınıvb.
   NOT: Beat frekansı ve ara veri toplama için genellikle 2,9 mV giriş aralığı voltajı, 1-Hz yüksek geçiş filtresi, 1000 Hz düşük geçiş filtresi ve 20 kHz örnekleme hızı kullanın.
3. Deneyin ilaç uygulama öncesi ve sonrası gibi farklı aşamalarını veya koşullarını işaretlemek için, istediğiniz gösterimleri eklemek için Ek Açıklamalar sekmesine tıklayın (Şekil 7C).
4. Toplanacak verilerin dosya hedefini belirtmek için Depolamayı Etkinleştir kutusunu seçin ve Dosya adı değiştirici kutusuna istediğiniz dosya adını girin.

10. Kaydı gerçekleştirmek ve veri toplamak

1. Kaydı başlatmak için edinme yazılımının en üst menü çubuğundaki Kaydet ve Yürüt düğmesini tıklatın. İzlemeler arasında 2 dakika aralıklarla 1 dakika süreyle 10 izleme için veri alın.
2. Bu ilk izlerden, kayıt kanallarının çoğunun ≥ 0,5 mV sinyal genlikleri ve aynı ani aralıklarla sergilediğini doğrulayarak kaydedilen dalga formlarının sağlıklı ve yüksek kaliteli bir doku hazırlığı ile tutarlı olduğunu doğrulayın (Şekil 8).
   NOT: Anatomik konumlarına karşılık gelen bireysel mikroelekrodların aktivitesinin ve dalga formlarının ilk değerlendirmesi, dokuyu MEA'ya konumlandırdıktan sonra elde edilen resme atıfta bulunularak yapılabilir.
3. İlaçların doku üzerindeki etkilerini ölçmek için, en üstteki menü çubuğundaki duraklat düğmesine tıklayarak ilk temel verileri aldıktan sonra kaydı duraklatın.
   NOT: Deneyin ilaç yanıt aşaması, Ek Açıklamalar sekmesine tıklayarak ve yukarıda açıklandığı gibi istenen gösterim eklenerek kayıtta not edilebilir (Şekil 7C).
4. Pompayı duraklatın ve pompa giriş borularını normal kayıt çözümünden Tyrode'un istenen ilacı içeren çözeltisine geçirin.
   NOT: Örnek deneyde, Tyrode'un çözeltisi 1 mM 4-aminopyridin (4-AP) ile kullanılmıştır.
5. Pompayı yeniden başlatın ve tekrar veri toplamaya başlamak için kaydı duraklatın.
6. İlaçla aşılanan Tyrode'un çözeltisi dokuya ulaştıktan sonra, temel kayıtlar için daha önce olduğu gibi 10 iz kaydedin.
   NOT: İlaç kayıt odasına infüze olurken izlerin stabilize etmesi biraz zaman alacaktır. İlacın etki mekanizması kayıt stabilitesini de etkileyebilir. Geri dönüşümlü etki mekanizmalarına sahip ilaçlar için, aktivitenin sağlıklı dokunun bir göstergesi olan taban çizgisi seviyelerine geri yüklenmesini onaylamak için bir yıkama süresi de kaydedilmelidir.
7. Kayıtları sonuçlandırmak için Durdur'a tıklayın.
8. İlk kayıt kurulum prosedüründen sonra dokunun kayması durumunda mea üzerindeki dokunun mikroskop altında konumlandırılmasının son bir resmini çekin.

11. Kayıt sonrası kurulumun temizlenmesi

1. MEA'yı temizleyin.
   1. Kaydı bitirdikten sonra, 1 mL mikropipette kullanarak kayıt solüsyonunu MEA kabından hafifçe çıkarın.
      NOT: Onlara zarar verebilecek MEA elektrotlarına temas etmemeye dikkat edin.
   2. Mesh ve arp ankrajını kemik kümesleri (veya kavisli kümesleri) ile çıkarın. Daha sonra, mea yüzeyinden dokuyu yerinden çıkarmak için bir boya fırçası kullanın, her zaman tek tek mikroelekrodlara dokunmamaya dikkat edin.
   3. Bir yıkama şişesi kullanarak, MEA kabını yaklaşık 3 ila 4 kez ultra saf suyla hafifçe durulayın.
   4. Temizlenmiş MEA'yı ultra saf suya batırılmış olarak 4 °C'de saklayın.
2. Peristaltik pompadaki maksimum hız ayarını kullanarak ultra saf suyu en az 5 dakika çalıştırarak sistem borularını durulayın.
   NOT: Mantar büyümesini önlemek için temizlik sonrası borunun içinde su veya tampon çözeltisi bırakılmamalıdır.

12. SAN beat frekansını ölçmek için MEA kayıtlarının analiz edilmesi

1. Kaydedilen kayıtlı veri dosyasını analiz yazılımının "Beat_frequency_analysis" şablonunda açın (Şekil 9) .
2. Oynat düğmesine tıklayın ve veri kümesini görselleştirmek ve uygun analiz parametreleri atamak için tüm kaydın çalışmasına izin verin.
   1. İzleme başına ortalama veya zaman başına ortalama olarak görüntülense de, verilerin istenen görüntüleme biçimi için binning penceresini seçin (Şekil 10A).
   2. Analize dahil edilecek kanalları seçin ve otomatik dalga biçimi tepe tanımlaması için istenen genlik maxima veya genlik minima eşik değerlerini ayarlayın (Şekil 10B).
      NOT: Bu adımda analiz için tek bir kanal, kanalların bir kombinasyonu veya 64 kanalın tümü seçilebilir (Şekil 9). Seçilen eşik değerleri dalga biçiminin maksima ve minima değerlerine çok yakınsa, bazı dalga formu zirveleri analiz yazılımı tarafından tanımlanamayabilir.
   3. Analize dahil edilecek ani artış öncesi ve sonrası süre miktarını ayarlayın.
      NOT: 50 ms ön çivi ve 100 ms ani artış sonrası ayarlar genellikle iyi çalışır (Şekil 10B).
3. Analiz koşullarını ayarladıktan sonra, veri kümesini yeniden çalıştırın ve analiz parametrelerinin ani ayıklama için uygun olduğunu onaylamak için Oynat düğmesine tekrar tıklayın.
4. Analiz için, hem deneyin temel döneminde hem de uyuşturucuya maruz kalma döneminde kanalların çoğunda her iz için kararlı dayak oranı gösteren en kararlı üç ardışık izi tanımlayın (Şekil 10A).
5. Analiz için başlangıç ve bitiş izlemelerini belirtin ve analiz edilecek her izlemenin süresini girin (Şekil 9).
6. Analize başlamadan önce, hem Dakika başına vuruş kaydet hem de Aralama aralığını kaydet ( Şekil10B) için etkinleştir kutularını seçin.
7. Dosya adı değiştirici kutusuna istediğiniz dosya adını girin (Şekil 10B). Beat frekansı ve aralama aralığı için analiz edilen veriler ASCII (metin) biçiminde kaydedilir.
   NOT: Farklı koşulları (taban çizgisi ve ilaç yanıtı gibi) analiz etmek için her koşul için ayrı ayrı çalıştırılmalıdır.
8. Analizi başlatmak için üst sekme çubuğundaki Yürüt ve Kaydet düğmesini tıklatın.
9. Diğer uygulamaların verilerini vermek için Dakika başına vuruş kaydet ve Ara aralık kaydet (Şekil 10B)kutularını seçin. Dosya adı değiştirici kutusuna istediğiniz dosya adını girin (Şekil 10B) ve çözümlenen verileri seçili klasördeki ASCII metin biçiminde kaydetmek için Kaydet'i tıklatın.

Dokunun 15 dakika boyunca çanağa alışmasına izin verdikten sonra, 10 bir dakikalık izler kaydedilir. Şu anki protokolümüz bir saatten fazla bir süredir aktivite kaydediyor, ancak burada gösterilmeyen yayınlanmamış verilerde ≥4 saat boyunca kararlı atış düzenleri kaydettik. Deneysel bir hazırlık veri toplama için iyiyse, her kayıt kanalı belirli bir kanal için tekdüze şekilde tutarlı ve eşit aralıklı yinelenen dalga formları (yani sivri) sergilemelidir (Şekil 11D). Bu dalga şekilleri, içsel kalp hızı aktivitesini yansıtan bireysel kalp atışlarına karşılık gelir. Ara aralıklar, depolarizasyonun başlangıç yerine göre konumlarındaki küçük farklılıklar nedeniyle kanallar arasında mükemmel bir şekilde hizalanmasalar bile her kanal için aynı olmalıdır (Şekil 8). Belirli bir kanal için dalga formlarının şekli tutarlı olmasına rağmen, dalga formlarının şekli elektrodun dokudaki konumuna bağlı olarak kanallar arasında değişecektir (Şekil 8). Dokunun elektrotla temas derecesi de genlik gibi dalga biçimi özelliklerini etkileyebilir. Bununla birlikte, hazırlık tatmin ediciyse, kanalların çoğunluğu için genlik maksima en az 0,5 mV olmalıdır. Kaydedilen 10 iz arasından, yukarıda açıklanan kalite kriterlerini en iyi karşılayan ardışık üç kanal, aşağıda açıklanan daha fazla analiz için seçildi. Şekil 10A, ardışık üç iz için kararlı vuruş frekansı (üst panel) ve ara aralık (orta panel) örneğini gösterir. Doğru veri toplamayı engelleyecek olası doku hasarı olduğu için bu kriterlere uymayan dokular kaydedilmemelidir. Şekil 11'de, gürültüden(B)veya kararsız(C)etkilenerek olmayan (A) olmayan kötü ayıklanmış ani artış desenleri örnekleri gösterilmektedir.

Rakamlarda görüntülenen örnek veriler 45 günlük erkek wildtype Black Swiss (Tac:N:NIHS-BC) faresinden toplanmıştır. Şekil 9 ve Şekil 10'da gösterilen analiz prosedürü, iç ateşleme hızını ayıklamak ve Şekil 12A'dagörülebilen taban çizgisi ani artışlarını görüntülemek için kullanılmıştır. Ateşleme hızı, üç izin her birinden 60.000 ms'lik ortalama orandır, ancak Şekil 12A'daki ani artış deseni, tek bir izden 5 sn temsili sıçrama gösterir. Otomatik analiz yazılımı kullanılarak, seçilen üç izin 64 kanalın tamamında iç ateşleme hızı (yani vuruş frekansı) örnek verilerimizde yaklaşık 320 bpm olarak bulunmuştur(Şekil 12A). Genel olarak, wildtype fareler için kayıtlarımızda yaklaşık 290-340 bpm'lik bir değer aralığı gözlemliyoruz. Ateşleme hızı, hazırlık kalitesini değerlendirmek için ikincil bir yöntem olarak da kullanılabilir. Kararsız veya 300 bpm'den önemli ölçüde düşük oranların analiz için iyi olma olasılığı daha düşüktür. Bu değerler, yaklaşık 300-500 bpm25,48,49aralığında içsel kalp atış hızlarını bildiren hem izole kalp hem de tek hücre kayıtları ile karşılaştırılabilir. Bu nedenle, MEA kayıt tekniği, içsel kalp atış hızının güvenilir ve doğru önlemlerini üretebilir.

MEA sisteminin bir avantajı, farmakolojik etkileri test etmek için ilaç ajanlarının kolay uygulanmasına izin etmesidir. Örnek deneyde, 1 mM 4-AP'nin ateşleme hızı üzerindeki etkilerini test ettik, bu da VOLTAJ kapılı K+ kanallarının ablukasının SA hücrelerinde eylem potansiyeli repolarizasyonunu bozduğu bilindiğinden SAN aktivitesini yavaşlatmalıdır24,50. Şekil 12B, 4-AP'nin tanıtılmasının interspike aralıklarını beklendiği gibi artırdığını göstermektedir. Bu uzun süreli ani artış aralığı, beat frekansında 320 bpm'den 210 bpm'ye bir düşüşe karşılık gelir. 4-AP yönetimini takip eden bu atış hızı, izole edilmiş dokunun tek elektrot kayıtlarını kullanarak 4-AP'nin SAN ateşleme hızı üzerindeki etkilerini inceleyen önceki bir çalışmaya benzer. Bu çalışma, 4-AP50varlığında yaklaşık 190 bpm'lik bir ateşleme oranı ölçtü. Bu nedenle, MEA sistemi, ilaç müdahalelerinin içsel kardiyak fonksiyon üzerindeki farmakolojik etkilerini test etmek için uygun ve değerli bir araç olarak kullanılabilir.

Şekil 1: Mikroelekrod dizisinin (MEA) kullanılmadan önce kaplanması. (A) MEA, merkezde 64 mikroelekrod ızgara dizisine sahip küçük bir plastik tabak ve çevrenin etrafındaki dört referans elektrotdan kare bir desende oluşur. (B) MEA'yı kaplamak için 1 mL PEI tampon ilavesi. (C) Mea kabını oda sıcaklığında bir gecede inkübasyon için termoplastik filmle örtmek. (D) PEI tamponunu MEA kabından emiş, ardından damıtılmış su ile en az dört durulama. (E) Kaplanmış MEA probunun kurumasını önlemek için ultra saf su altında depolanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Sinoatriyal düğüm (SAN) diseksiyonu için kullanılan aletler. Protokolün diseksiyon kısmı sırasında aşağıdaki aletler kullanılır: (i) Silikon elastomer ve küçük diseksiyon pimli petri kabı; (ii) Plastik transfer pipet; (iii) Castroviejo makası, 4 numara"; (iv) Kesme işlemleri için cerrahi makas (düz); (v) Dumont #2 Laminektomi kürsüleri; (vi) Dumont #55. (vii) Ekstra ince Graefe asaları; (viii) Hemostatlar (kavisli). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kalbin çıkarılması. (A) Göğüs kafesinin hemen altındaki deride sol costal kemerden sağ costal kemere kadar enine kesi. (B) Periton kesiği. (C,D) Torasik boşluğu açığa çıkarmak için toraks boyunca diyaframın kesisi. (E) Akciğerlerin eksizyonunun ardından kalbin çıkarılması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Sinoatriyal (SAN) düğümün diseksiyonu. (A) Vücuttan çıkarıldıktan sonra Petri kabında kalbin görünümü. (B) Şırınga iğnesinin sağ kulakçıktaki alt vena kava (IVC) ve üstün vena kava (SVC) yoluyla yerleştirilmesi. Kalbin tepelerindeki pim de gösterilir. (C) Kanı serbest bırakmak için kalbin tepenin (yani alt yarısının) eksizyonu. Atriyal eklerdeki pimler de gösterilir. (D) Diseksiyon sonunda sağ atriyumun SAN bölgesinin son görünümü. Kutulu bölge SAN'ın yaklaşık konumuna karşılık gelir. SAN arteri, SAN'dan dikey yönde geçerken de hafifçe görülebilir. Kısaltmalar: AO, aort; CT, crista terminali; IVC, alt vena kava; LA, sol atriyum; RA, sağ atriyum; RAA, sağ atriyal ek; SAN, sinoatriyal düğüm; SVC, üstün vena kava. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Mikroelekrod dizisinin (MEA) kayıt sistemi kurulumunun şeması. Aşağıdaki bileşenler sistemi içerir: (A) gaz silindiri (karbojen: % 95 O2/% 5 CO2); (B) gazı nemlendirmek için damıtılmış su ile konik şişe; (C) Tyrode'un MEA kabına giriş sağlayan çözelti şişesini kaydetmek; (D) MEA kabına ve MEA çanağına çözelti pompalamak için peristaltik pompa; (E)sıcaklık regülatörü; (F) MEA çanaktan sinyal alan MEA konektör plakası; (G) amplifikatör; (H) bilgisayar; (I) MEA çanaktan kullanılmış atık çözeltisi için toplama şişesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: SA nodal dokusunun MEA üzerine konumlandırılması. (A) Dokunun konumlandırılmasında kullanılan aletler: (i) 1,5 mm ızgara boyutuna sahip mesh, (ii) arp çapası, (iii) kemik tokaları, (iv) boya fırçası. (B) Dokunun MEA üzerine yerleştirilmesi. Sarı kutu, ağ altındaki sinoatriyal düğüm bölgesinin yaklaşık alanını gösterir ve MEA çanasında tutturuldu. (C) Alan potansiyeli kaydı için MEA çanağının konektör plakasına kapalı doku ile düzenlenmesi: (i) kayıt çözümü için giriş; (ii) gaz girişi (karbojen); (iii) çözelti için çıkış; (iv) mikroelekrod konnektör plakası; (v) perfüzyon kapağı; (vi) kapağa bağlı referans elektrot halkası; kapağı tutmak için bant. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Yazılımdaki veri toplama protokolünü ayarlama. (A) 64 kanalın tümünde düzenleme gösteren kayıt şablonu örneği. (B) Kayıt koşulları için yazılım giriş özelliklerine bir örnek. (C) Kayıt sırasında ilaç etkilerini ölçmek gibi Yeni Aşamanın nasıl ekleneceğini gösteren Ek Açıklamalar menüsüne bir örnek. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Dokuların farklı aktivite dalga formlarını gösteren farklı bölgeleri. Farklı kanallarda farklı şekillere ve genliklere sahip dalga formlarını gösteren örnek ekran görüntüsü. Ancak, tüm kanallar aynı ara aralıkları ve ateşleme frekanslarını gösterir. Kırmızı kutunun içindeki kanallar, dokunun SAN bölgesine yerleştirilen elektrotlara yaklaşık olarak karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Beat frekans analizi şablonu. Beat frekans analizi şablonundaki 64 kanalın tümünü gösteren örnek şablon. Raw Veri Dosyasını Yeniden Yürütme girişi, çözümleme penceresinin giriş özelliklerine bir örnek gösterir. Bu örnekte, analiz için 5 ila 7 izlemeleri seçilmiştir ve her izleme için analiz süresi 60.000 ms olarak belirlenmiştir.

Şekil 10: Ani ekstraksiyon için analiz parametrelerinin tanımlanması. (A) Tek bir kanalın seçilen 3 izlemesi için temsili analiz şablonu sonuçları. Üst panel, seçilen üç izleme için vuruş sıklığını görüntüler (veri noktalarının üç tanımlı gruplandırması) ve her nokta belirli izleme sırasında vuruş sıklığı için 10 s ortalamayı temsil eder. Orta panel, seçilen üç izleme (veri noktalarının üç tanımlı gruplandırması) için ani artış aralığını görüntüler ve her veri noktası, ardışık iki ani artış arasındaki ani artış aralığını temsil eder. Sol alt panel, üçüncü izlemenin son 5 s'si için seçilen temsili ayıklanmış sivri uçları gösterirken, sağ alt panel sol alt paneldeki 5'lerce ayıklanmış sivri uç grubundan türetilen ayıklanmış bir dalga biçimi gösterir. (B) 3 iz için dayak sıklığının analizinde kullanılan parametreleri gösteren analiz penceresinin genişletilmiş görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11: Belirli bir kanal için iyiye karşı kötü veri ayıklamayı gösteren temsili rakam. Hatalı veri ayıklama: (A) Ayıklanan ani artışların yokluğu; (B) Gürültü sinyalleri ile çıkarılan sivri; (C) Kararsız ayıklanmış sivri uçlar. (D) Gürültü sinyalleri olmadan sabit ayıklanmış sivri gösteren iyi veri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 12: 1mM 4-Aminopyridine (4-AP) temel ve sonrasındaki kayıtlar). (A) Tek bir mikroelektoddan temel kayıt, WT kalbinde 320 bpm kararlı ateşleme frekansı olan dalga formlarını gösterir. (B) 4-AP'nin idaresini takiben, ateşleme frekansı 210 bpm kararlı bir hıza yavaşlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.