Methanojenik Saf Kültürlerden ve Çevre örneklerinden Poliglutamat Kuyruk Uzunluğunun Analizi için Cofactor _F420 Ekstraksiyonu

_F420, hem Archaea hem de ^{Bacteria1,2'nin} birincil ve ikincil metabolik süreçlerinde zorunlu iki elektronlu hidrit taşıyıcısı olarak işlev gören yaygın ancak genellikle ihmal edilen bir kofaktördür. _F420, 5 deazaflavindir ve yapısal olarak flavinlere benzer, böylece kimyasal ve biyolojik özellikleri NAD⁺ veya NADP ⁺ ile daha karşılaştırılabilir. İzoalloksiazin halkasının 5 pozisyonunda karbonlu azot ikamesi nedeniyle, güçlü bir redüktanttır, böylece -340 ^mV1,3 düşük standart redoks potansiyeli sergiler^. _F420, 5-deazaflavin halkası ve 2 fosfo-L-laktat bağlayıcıdan (_F420-0) oluşur. Moleküle (_F420-n+¹⁾4 n+1 glutamat monomerleri içeren bir oligaoglutamat kuyruk takılabilir.

Uzun zamandır, cofactor _F420 sadece Archaea ve Actinobacteria ile ilişkilendirilmiştir. Bu büyük ölçüde devrildi. Son analizler, _F420'nin phyla Proteobacteria, Chloroflexi ve potansiyel olarak Firmicutes'in çeşitli anaerobik ve aerobik organizmaları arasında dağılmayan toprak, göl ve insan bağırsağı gibi sayısız habitatta yaşadığını ortaya ^koydu1,5. 2019'da Braga ve ^ark.6, proteobacterium Paraburkholderia rhizoxinica'nın çeşitli habitatlarda yaygın olabilecek 2 fosfolactate kuyruk yerine 3 fosfolycerat içeren benzersiz bir _F420 türevi ürettiğini gösterdi. Archaea etki alanında, _F420 metanojenik7, metanotrofik8,9 ve sülfat azaltıcı ^{siparişler10} dahil olmak üzere çeşitli soylarda bulunmuştur ve Thaumarchaeota11'de üretilmesi beklenmiştir. _F420 en iyi hidrojenotrofik ve methylotrofik metanogenezde temel bir redoks koenzim olarak bilinir. _F420'nin (_F420H2) azaltılmış formu, metilennetetrahydromethanopterin (metilen-H4MPT, Mer) ve metilen-H4MPT12,13'ün azaltılması için bir elektron donörü olarak işlev görse de işlev ^görsedir. Sitokrom içeren metanojenlerin _H2 bağımsız elektron taşıma yollarında elektron taşıyıcı olarak da ^{kullanılabilir12,14}. Ayrıca, _F420'nin oksitlenmiş formu, metanojenlerin mikroskobik olarak tespitini kolaylaştıran 420 nm'de eksize edilen karakteristik bir mavi-yeşil floresan vardır (Şekil 1). Düşük redoks potansiyeli nedeniyle, _F420 (i) aksi takdirde recalcitrant veya toksik organik bileşiklerin geniş bir spektrumunun eksojen azaltılmasını kolaylaştırır, (ii) streptomisitlerde (phylum Actinobacteria) tetrasiklin ve linkozarit antibiyotiklerinin veya fitokoksinlerin sentezi ve (iii) mikobakterilerde oksidatif veya nitrosatif strese veya diğer elverişsiz durumlara karşı direnç (phylum Actinobacteria)^1,5,15, 16,17,18,19,20,21,22. Sonuç olarak, _F420 bağımlı oksidoreductases, endüstriyel ve farmasötik amaçlar için ve kontamine ortamların biyo-işletimi için biyokatalistler vaat ^ediyor1,23. Bu son bulgulara rağmen, kofaktör _F420'nin kesin rolleri Actinobacteria veya diğer bakteriyel phyla'da hala marjinal olarak bilinmektedir.

_F420 biyosentezi için en az üç yol vardır2,6,24. Başlangıçta, biyosentez yolu 5-deazaflavin biyosentez ve 2 fosfolactate metabolizma dalı olarak ayrılır. _F420 molekülünün reaktif kısmı, tirozin ve 5-amino-6-ribitylamino-2,4(1H, 3H)-pyrimidinedione substratları kullanılarak FO-synthase yoluyla sentez edilir. Sonuç riboflavin seviyesi kromofor _FO'dur. Şu anda kabul edilen laktat metabolizması dalında, L-laktat bir L-laktat kinaz (CofB) tarafından 2 fosfo-L-laktata ile fosforilasyon edilir; 2-fosfor-L-laktat, sırayla, 2-fosfor-L-laktat guanylyltransfeaz (CofC) tarafından L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine guanylated edilir. Bir sonraki adımda, L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine, _F420-02'yi oluşturmak için 2 fosfo-L-laktat transferaz (CofD) ile _FO'ya ^bağlanır. Son olarak, _F420-0:ɣ-glutamil ligaz (CofE) enzimi glutamat monomerlerini _F420-0'a bağlar ve son kofaktör6'yı değişen sayılarda ^{oluşturur23,25}. Farklı organizmalar, ekli glutamat kalıntılarının sayısında farklı desenler gösterir ve metanojenler için mikobakterilere göre daha kısa kuyruklar bulunur2,25,26. Genellikle, metanojenler kuyruk uzunluklarını iki ila üç arasında gösterir, asetoklastik metanojende beşe kadar, Methanosarcina sp., Mycobacterium sp.'de bulunan kuyruk uzunlukları ise beş ila yedi glutamat kalıntısı arasında değişmektedir2,25,26,27. Bununla birlikte, son bulgular, uzun zincirli _F420'nin kısa zincirli _F420'den daha yüksek bir benzeğe sahip _F420 bağımlı oksitodikozlara bağlandığını göstermiştir; ayrıca, bağlı uzun zincirli _F420, substrat benzeşimini arttırır, ancak ilgili enzimlerin ciro oranını ^azaltır23.

Kofaktör _F420'nin tespiti genellikle floresansına dayanır. Böylece, oligo glutamat türevleri ters faz (RP)-^HPLC27,28 kullanılarak ayrıldı. Son zamanlarda, Ney ve arkadaşları RP-HLPC'deki ayrımı başarıyla artırmak için negatif yüklü glutamat kuyruğu için iyon eşleştirme reaktifi olarak tetrabutylammonium hidroksit ^{kullandılar5}. Burada, sadece saf kültürlerden _değil, aynı zamanda farklı çevresel örneklerden (yani topraklar ve digester çamuru) numunelerin hazırlanması, sonraki liziz, ekstraksiyon, saflaştırma, ayırma ve koordinasyon için bir yöntem sunuyoruz.

NOT: Kofaktör _F420'nin ekstraksiyonu ve analizi, numune lizisi, katı faz ekstraksiyonu (SPE) ile kofaktör ön saflaştırma ve floresan algılamalı iyon eşleştirilmiş-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) ile kofaktör algılama dahil olmak üzere üç adımlı bir süreçtir. Başlamadan önce, malzemeleri ve reaktifleri Tablo 1'de belirtildiği gibi hazırlayın.

1. Örnek liziz

1. Uygun tüplere (örneğin, 50 mL konik tüpler) 5 g'a kadar numune ekleyin.
2. Numunelere 5 mL lizis tamponu (2x stok çözeltisi, Tablo 1) ekleyin.
3. 0,5 g·mL-1'lik son konsantrasyona ulaşmak için damıtılmış su ile ¹⁰ mL'lik son hacme getirin.
4. 20 s için seyreltilmiş örnekleri girdap.
5. 121 °C'de 30 dakika otoklav.
6. Orman toprağı gibi kuru numuneler için, seyreltilmiş numuneyi otoklavladıktan ve girdapladıktan sonra damıtılmış su ile 20 mL'lik son hacme getirin.
   DİkKAT: Otomatik kapanma sırasında sıcaklık artışı tüplerin patlamasına neden olabilir.

2. Katı fazlı ekstraksiyon (SPE) ile kofaktör F _420'nin ön saflaştırılması

NOT: SPE'nin tüm adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilir

1. Numuneleri oda sıcaklığına kadar soğutun.
2. Otomatik kapatılmış numuneleri 11.000 x g'da 5 dakika santrifüj edin.
3. 100 mg zayıf anion karışık mod polimerik sorbent ile dolu 5 mL SPE sütunları hazırlayın.
4. Anion eşanjörü 3 mL metanol ile koşullandırılmıştır (durum çözeltisi, Tablo 1).
5. Anion eşanjörü 3 mL damıtılmış su ile dengelenin (denge çözeltisi, Tablo 1).
6. Santrifüjlü lisattan SPE sütununa 9,0 mL'ye kadar süpernatant yükleyin.
7. Safsızlıkları 5 mL 25 mM amonyum asetatla yıkayın (SPE yıkama çözeltisi 1, Tablo 1).
8. Safsızlıkları 5 mL metanol ile yıkayın (SPE yıkama çözeltisi 2, Tablo 1).
9. _F420 kofaktörini 1,0 mL elution tamponunda (Tablo 1) elüte edin.
   NOT: Taze elution tamponu hazırlayın. Uygulanan vakum ve elution tamponunun yüksek buhar basıncı nedeniyle, elüsyon hacimleri numuneden numuneye farklılık gösterebilir. Tüm numunelerde aynı son hacmin sabitlenebilmesi için, toplama kaplarının elution öncesi ve sonrası tartılması ve etkili elüasyon hacminin hesaplanması önerilir. Elution tamponu eklenerek farklılıkları dengeleyin.

3. Cofactor _F420'nin tespiti

1. Fırını 40 °C'ye ve floresan dedektörünü 420 nm yok olma dalga boylarına ve 470 nm emisyon dalga boylarına ayarlayın. A ve B mobil aşamalarını kullanarak degrade modu ile ayırmayı elde edin (Tablo 1): 0-3 dk: % 26 B; 3-24 dk: %26-%50 B; 24-25 dk: %50 B; 25-27 dk: %50-%26 B; 27-35 dk: 0,75 mL·^dk-1 akış hızında %26 B.
   NOT: Sütunu en az %74 mobil faz A ve %26 mobil faz B'nin 3 sütun hacmiyle temizlenerek numune enjekte etmeden önce sütun koşullarının dengesini garanti edin (Tablo 1).
   1. 0,22 μm gözenek boyutuna sahip bir PTFE filtresi kullanarak SPE'den elde edilen örnekleri HPLC şişelerine filtreleyin.
      NOT: Gözenek boyutu 0,22 μm olan PTFE filtreleri önerilir.
   2. Kofaktör _F420 bileşimini ve konsantrasyonunu analiz etmek için HPLC sistemine 50 μL eluted numune enjekte edin.
      NOT: Bu protokolde nicel standart kullanılmadıkça, numunelerin ve varyantların pik alanla karşılaştırılması gerekir.

Her ikisi de termofilik metanojenik Arkea olan Methanosarcina thermophila ve Methanoculleus thermophilus'un saf kültürleri, daha önce açıklandığı gibi uygun medyada yetiştirildi29,30. Metanosarcina thermophila için metanol enerji kaynağı olarak kullanılırken, H2/CO2'de Metanoculleus thermophilus yetiştirildi. Büyüme mikroskobik değerlendirme ile kontrol edilirken, aktivite daha önce açıklandığı gibi gaz kromatografisi ile metan (CH4) ölçümü ile incelendi31. Sunulan protokole göre kofaktör F420'nin çıkarılması için saf kültürler kullanılmıştır. Buna ek olarak, bir mezofilik biyogaz reaktör çamurundan (atık su arıtma tesisi, Zirl, Avusturya; çamur parametreleri ile ilgili ayrıntılar için lütfen 32' ye bakın), tarımsal olarak kullanılan bir çayırdan (Innsbruck, Avusturya) ve orman toprağından (Lans, Avusturya) alınan çevresel örnekler, kofaktör F420'nin çıkarılması ve analizi için 2020 sonbaharında alınmıştır.

Saf kültürlerin büyümesi mikroskopi ile doğrulanmıştır (Şekil 1), üretilen CH4 14 günlük inkübasyon sırasında gaz kromatografisi ile analiz edilmiştir (veriler gösterilmemektedir). Saf kültürlerden kofaktör F420 ekstraksiyonunun verimliliği farklı parçalama stratejileri uygulanarak test edildi: 0.5-1.0 mm seramik atımlar kullanarak beat-beat, ultrasonik tedavi ve 121 ° C ve 1.2 bar basınç (otoklavlama) kullanarak basınç sıcaklığı parçalanması. Maksimum ekstraksiyon verimliliği, protokol bölümünde açıklandığı gibi bir tampon uygulanan basınç-sıcaklık tedavisi kullanılarak belirgin hale geldi ve böylece sonraki tüm deneyler için daha fazla uygulandı (Şekil 2). Ekstraksiyon verimliliği testleri, iyi büyüyen bir Methanoculleus termofilus kültürünün farklı hacimlerinin standart olarak eklenmesiyle gerçekleştirildi. Ayrıca, farklı örneklerin ve varyantların karşılaştırılması kromatogramlardan tepe alanına dayanıyordu.

Daha sonra, hücre özleri katı fazlı ekstraksiyon (SPE) prosedürüne tabi tutuldu. Bu amaçla farklı iyon eşanjörleri test edilmiştir. Zayıf bir anion karışık mod polimerik sorbent'in, elüasyondan sonra en yüksek miktarda kofaktör F420 verdiği ortaya çıktı. Ek olarak, farklı elution tamponları ve yıkama çözeltileri test edildi ve yıkama tamponu olarak 25 mM amonyum asetat ve bir elüasyon tamponu olarak metanolde NH3 karışımı için en iyi sonuçları gösterdi. Elution adımından metanol, vakum sıcaklığında bir işlemle su ile elüasyondan sonra değiştirilebilir.

Cofactor F420'nin HPLC analizi, sunulan çalışma sırasında elde edilen sistem yapılandırması için en iyi sonuçları elde eden farklı C18 sütunları ile bir NX C18 sütunu ile test edildi. Referans amacıyla F420 türevlerinin farklı glutamat kuyruk uzunluğuna sahip bilinen bir dağılımını içeren bir standart kullanılmıştır. Bu standart Avustralya Ulusal Üniversitesi'nden Prof. Colin Jackson tarafından nazikça sağlanmıştır. Glutamat kuyruk uzunluğunun analizi, kofaktör F420'nin genel konsantrasyonunda ve metanojenik saf kültürlerin ve çevre örneklerinin F420 kuyruk uzunluğu dağılımında farklılıklar olduğunu ortaya koydu (Şekil 3).

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.