Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Nöronlarda, mikrotübül yönelimi, genellikle karışık oryantasyona sahip artı uçlu mikrotübüllere ve dendritlere sahip aksonları tanımlamak için önemli bir değerlendirici olmuştur. Burada, C. elegans'taki dokunmatik nöronların gelişimi ve yenilenmesi sırasında mikrotübül dinamiklerini ve büyümesini etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıklıyoruz. Mikrotübül uçlarının genetik olarak kodlanmış floresan muhabirlerini kullanarak aksonal mikrotübülleri görüntüledik. Aksotomi sonrasında akson rejenerasyonunu başlatan mikrotübül davranışındaki lokal değişiklikler bu protokol kullanılarak ölçülebilir. Bu test, çeşitli hücresel süreçlerde mikrotübül dinamiklerinin düzenlenmesini araştırmak için diğer nöronlara ve genetik geçmişlere uyarlanabilir.
Giriş
Nöronlar dendritler, hücre gövdeleri, aksonlar ve sinapslar gibi özel bölmelere sahip ayrıntılı bir mimariye sahiptir. Nöronal sitoskeleton mikrotübüller, mikrofilamentler ve nörofilamentlerden oluşandır ve farklı organizasyonları nöronal bölmeleri yapısal ve işlevsel olarakdestekler 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Yıllar içinde mikrotübül or....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Muhabir gerginliği: Kültür ve bakım
NOT: PLM nöronlarındaki mikrotübül dinamiklerini ve oryantasyonunu ölçmek için, dokunmatik nörona özgü promotör mec-4(juIs338 alele) 18,25,26altında EBP-2::GFP'yi ifade eden solucan suşunu kullandık. Bu suş için standart solucan kültürü ve bakım yöntemleri kullanıyoruz27.
- Nematod Büyüme Ortamını (3,0 g/L sodyum klorür, 2,5 g/L pepton, 20,0 g/L agar, 10 mg/L kolesterol (10 mg/mL'lik bir stok çözeltisinden seyreltil....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Temsili bir örnek olarak, PLM nöronlarının sabit durumundaki ve yenileyici aksonlarındaki EBP kuyruklu yıldızlarının in vivo gözlemini tanımladık. PLM nöronları, bir sinaps ve kısa bir posterior işlem oluşturan uzun bir ön işlemle solucanın kuyruk bölgesinde bulunur. PLM nöronları epidermisin yakınında ön-arka yönde büyür ve solucanlardaki nazik dokunma hissinin sorumlusudur. Basitleştirilmiş yapıları ve görüntüleme ve mikrocerrahiye karşı alametleri nedeniyle PLM nöronları mikrotübül sitoskeleton29
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mikrotübül dinamiklerini anlamak, yıllar boyunca sitoskeletal araştırma alanında önemli bir odak noktası olmuştur. Mikrotübüller, sürekli dinamik dengesizlik süreci ile birlikte çekirdeklenme ve felakete uğrar44,45,46,47. Bu bilgilerin çoğu, serbest vs polimerize tübulinin ışık saçılım okumaları, floresan tübulinden mikrotübül büyüme tahlillerivb.<.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Teşekkürler
İlk destek ve çalışmada kullanılan suş için Yishi Jin ve Andrew Chisholm'a teşekkür ederiz. OP50 bakteriyel suş, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetics Center'dan (CGC) ticari olarak yararlanmıştır. Dharmendra Puri'ye deneysel prosedürlerin standardizasyonu için de teşekkür ederiz. Çalışma, Ulusal Beyin Araştırma Merkezi'nin temel hibesi (Biyoteknoloji Bölümü tarafından desteklenmektedir, Hindistan Govt. ), DBT/Wellcome Trust India Alliance Erken Kariyer Hibesi (Grant # IA/E/18/1/504331) S.D.'ye, Wellcome Trust-DBT India Alliance Intermediate Grant (Grant # IA/ I/ 13/ 1 / 500874) A.G.-R'ye ve Bilim ve M....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| CZ18975 solucan suşu | Yishi Jin lab | CZ18975 | Anindya Ghosh-Roy |
| Agarose | Sigma | A9539 | tarafından üretilmiştir Montaj solucanları |
| Lamel (18 mm x 18 mm) | Zeiss | 474030-9010-000 | Montaj solucanları |
| Isıtma bloklu kuru banyo | Neolab | Montaj | |
| solucanları Cam kaydıraklar (35 mm x 25 mm) | Mavi Yıldız | Montaj solucanları | |
| Polistiren boncuk çözeltisi (minimum yüzey aktif madde içeren sulu ortamda 4.55 x 10^13 partikül / ml) | Polysciences Inc. | 00876 | Montaj solucanları |
| Test tüpleri | Montaj solucanları | ||
| OP50 bakteri suşu | Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) | OP50 | Solucan işleme |
| 60mm petri plakaları | Praveen Scientific | 20440 | Solucan işleme |
| Aspiratörü/Kılcal | VWR | 53432-921 | Solucan işleme |
| İnkübatörü | Panasonic | MIR554E | Solucan işleme |
| Platin tel | Solucan işleme | ||
| Floresan eki ile Stereomikroskop | Leica | M165FC | Solucan işleme |
| %0.3 Sodyum Klorür | Sigma | 71376 | Nematod Büyüme Ortamı |
| %0.25 Pepton | TM Ortamı | 1506 | Nematod Büyüme Ortamı |
| 10mg/mL Kolesterol | Sigma | C8667 | Nematod Büyüme Ortamı |
| 1mM Kalsiyum klorür dihidrat | Sigma | 223506 | Nematod Büyüme Ortamı |
| 1mM Magnezyum sülfat heptahidrat | Sigma | M2773 | Nematod Büyüme Ortamı |
| %2 Agar | TM Ortamı | 1202 | Nematod Büyüme Ortamı |
| 25mM Monobazik Potasyum dihidrojen fosfat | Sigma | P9791 | Nematod Büyüme Ortamı |
| 0.1M Monobazik Potasyum dihidrojen fosfat | Sigma | P9791 | 1X M9 tampon |
| 0.04M Sodyum klorür | Sigma | 71376 | 1X M9 tampon |
| 0.1M Amonyum klorür | Fisher Scientific | 21405 | 1X M9 tampon |
| 0.2M Dibazik Disodyum hidrojen fosfat heptahidrat | Sigma | S9390 | 1X M9 tampon |
| Cam şişeler | Borosil | Tampon depolama | |
| 488 nm lazer | Zeiss | Görüntüleme | |
| 5X objektif | Zeiss | Görüntüleme | |
| 63X objektif | Zeiss | Görüntüleme | |
| Kamerası | Fotometri | Evolve 512 Delta | Görüntüleme |
| Eğirme Diski ünitesi için bilgisayar sistemi | HP | Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz | Görüntüleme |
| Epifloresan mikroskobu | Zeiss | Observer.Z1 | Görüntüleme |
| Halojen lamba | Zeiss | Görüntüleme | |
| Cıva Ark Lambası | Zeiss | Görüntüleme | |
| Dönen Disk Ünitesi | Yokogawa | CSU-X1 | Görüntüleme |
| ZEN2 yazılımı | Zeiss | Görüntüleme | |
| Görüntüsü J (Fiji Sürüm) | Görüntü analizi ve işleme | ||
| : Adobe Creative Cloud | , Adobe | Görüntü analizi ve işleme | |
| Görüntü Analizi için bilgisayar sistemi | Dell | , Intel, ® Çekirdek ve ticaret; i7-9700 CPU 3.00GHz | Görüntü işleme/Gösterim |
Kaynaklar
- Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
- Tas, R. P., Kapitein, L. C.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
