Küçük Molekül Bileşiklerinin Hızlı ve Nicel Tespiti için Yanal Akış İmmünokromatografik Şeridinin Geliştirilmesi

Membran bazlı yanal akış immünokromatografik şeritler (ICSs) düşük maliyetli ve hızlı algılama için kullanışlı araçlardır. Taşıyıcı olarak nitroselüloz membran ve immün kromatografi hızlı tanı reaktiflerinin belirteçleri olarak kolloidal altın en sık kullanılan POCT (bakım noktası testi) yöntemidir ve projenin test kapsamı daha geniştir. Hamilelik sırasında izlemedeki orijinal uygulamalarından, kan pıhtılaşma durumu 1^,2, miyokard yaralanması³, veteriner hekimlik⁴, pestisit kalıntıları⁵, bulaşıcı hastalıklar⁶ve ilaç konsantrasyonlarını izlemek için kullanımları genişletilmiştir. İdrar, tükürük, tam kan, serum ve diğer vücut sıvıları dahil olmak üzere daha fazla örnek türü değerlendirilebilir^7,8,9.

Son yıllarda, hassas ve doğru, güvenilir ve spesifik olan HPLC, UPLC, LC-MS ve ELISA dahil olmak üzere bozuklukların tanısında biyobelirteçleri tespit etmek için çok sayıda yeni tahlil geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemler sofistike enstrümantasyon, karmaşık ön işleme ve zaman alıcı tedaviler gerektirir⁹. Bu nedenle, tıbbi aktif bileşiklerin kendi kendine ve gerçek zamanlı tespiti için daha hızlı ve kullanışlı bir bakım noktası tanı stratejisi geliştirmek acildir^10,11.

ICS'lerin popülaritesi, özellikle yaygın testler için, profesyonellere veya ayrıntılı enstrümantal kurulumlara ihtiyaç duydukları için kullanım kolaylığından kaynaklanır¹². Başka bir deyişle, özel eğitimi olmayan kişiler şeritleri veya kendi kendine testleri çalıştırabilir¹³. Testin sonuçları 5 dakika içinde elde edilebilir, bu da saha incelemeleri için kullanılabileceği anlamına gelir¹⁴. Ayrıca, hesaplamalarımıza göre, şeritlerin maliyeti 1 RMB¹⁵'ten düşük olabilir , bu da testlerin¹⁶. Bu nedenle, ICS nispeten doğru, basit ve ucuz bir tek kullanımlık cihazdır. Kolloidal altın^{17,18 bazlı ICS'ler} hızlı COVID-19 tespitinde de uygulanmaktadır.

ICS prensibi sandviç ICS ve rekabetçi ICS olarak ayrılabilir. Şekil 1A, esas olarak tümör belirteçleri, enflamatuar faktörler ve insan koryonik gonadotropin (HCG, erken gebelik antijeni) dahil olmak üzere proteinler gibi makromoleküler maddeleri tespit etmek için kullanılan sandviç ICS'nin şematik bir diyagramıdır. Bu yöntemde antijenin farklı epitoplarını hedefleyen eşleştirilmiş antikorlar kullanılır ve yakalama antikorı test hattı olarak NC membranında kurutulur. Etiketli antikor konjuge ped üzerinde kurutulur ve kontrol hattı olarak ikincil antikor kullanılır.

Şekil 1B, esas olarak küçük molekül maddeleri tespit etmek için kullanılan rekabetçi ICS'nin şematik bir diyagramıdır (MWCO < 2000 Da). Kaplama antijeni test hattı olarak NC membran üzerine sabitlenir ve etiketli antikor konjuge ped üzerinde kurutulur. Algılama sırasında, numune ve etiketli antikor kılcal etki altında algılama hattından akar ve kaplanmış antijen, numunedeki serbest antijeni rekabetçi bir şekilde bağlar ve algılama hattında kırmızı bir renk geliştirir.

Son zamanlarda, doğal ürünlere karşı monoklonal antikor üretimi prosedürünü tanımladık¹⁹. Bu çalışmada, hızlı ve yerinde tespit için hazırlanan anti-SSD mA^20'ye dayanan yeni bir yanal akış immünoassay geliştirdik. Sonuçlar, immünokromatografi testinin doğal ürün türevi bileşikleri tespit etmek için vazgeçilmez ve kullanışlı bir araç olduğunu göstermektedir.

Şekil 1 İmmünromatografi testinin şematik şeması (A) Sandviç immünokromatografik test şeritleri. (B) Dolaylı rekabetçi immün kromatografik test şeritleri. Bu rakam Zhang ve ark.,2018²¹. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışmada yapılan tüm prosedürler Pekin Çin Tıp Üniversitesi Etik İnceleme Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay numarası 2017BZYYL00120).

1. Kolloidal Altının Hazırlanması ve Karakterizasyonu

NOT: Kolloidal altın sentezi için, kolloidal altın damarın iç duvarına kolayca adsorbe edildiği ve safsızlıklar nedeniyle çökeltmeye eğilimli olduğu için kolloidal altının sentezi ve depolanması için damar iyice temizlenmeli ve aside batırılmalıdır (40 mL damıtılmış su, 360 mL konsantre sülfürik asit, 20 g potasyum dikromat) veya yüzey geçişi işlemine tabi tutulmalıdır. Kolloidal altını sentezlemek için sitrik asit azaltma yöntemi kullanılmıştır.

1. Manyetik karıştırıcıyı açın ve şişeyi (250 mL) karıştırıcıya yerleştirin.
2. Sırasıyla% 4 altın klorür asit çözeltisi ve% 1 sodyum sitrat çözeltisi hazırlayın.
3. Yuvarlak bir alt şişeye 120 mL damıtılmış su ekleyin ve termostatik manyetik karıştırıcıda kaynamaya ısıtın.
4. Kaynamaya devam edin ve hızlı bir şekilde% 4 kloroaurik asit 0,5 mL ve% 1 sodyum sitrat 5 mL ekleyin.
5. Çözeltinin rengine uyun. Soluk sarı kloroaurik asit çözeltisi birkaç dakika içinde şarabı kırmızıya çevirir.
6. Çözelti renksizden şeffaf şarap kırmızısına dönüşene kadar 10 dakika ısıtmaya devam edin.
7. Termostatik manyetik mikserin gücünü kapatın, oda sıcaklığına soğutun ve karışımı temiz bir şişeye taşıyın. 4 °C'de saklayın.
8. Ultraviyole spektroskopi ve TEM görüntüleme ile AuNP'lerin boyutunu ve morfolojisini belirleyin.
   NOT: Sitrat sodyum ve kloroaurik asit oranı değiştirilerek çeşitli uygulamalar için farklı boyutlarda kolloid altın parçacıkları elde edilebilir.

2. AuNPs-mAb Konjuge Sentezi

NOT: Antikorlar elektrostatik adsorpsiyon ile kolloidal altına bağlanınce, proteinlerin ve kolloidal altının yüzeyindeki yükler bağlayıcı yoğunluğu doğrudan etkiler; bu nedenle, tampon pH değeri antikor-kolloidal altın konjuge stabilitesini etkileyen önemli bir faktördür. SSD ve anti-SSD mAb'ler bu protokolde örnek olarak kullanılır.

1. Kavrama pH'ının değerlendirilmesi
   1. Sekiz tüpe 100 μL NaCl çözeltisi (%10 m/v) ekleyin.
   2. AuNP çözümlerini pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ve 12'de 0,1 M K 2 CO₃ile_ayarlayın.
   3. NaCl içeren sekiz tüpe 100 μL kolloidal altın çözeltisi (pH ayarlı 5-12) ekleyin.
   4. Karıştırmadan sonra çözeltilerin birkaç dakika bekletin. Her tüp çözeltisinin renk değişimini gözlemleyin ve kırmızı kalan tüpü kaydedin.
   5. AuNP-mAb konjugelerini hazırlamak için optimum pH değeri olarak en az K₂CO₃ ilavesi ve kararlı çözelti rengi ile pH değerini seçin.
      NOT: Prob AuNP'ler tarafından yok edilebileceğinden pH ölçer kullanmayın.
2. Antikor miktarının değerlendirilmesi
   1. Sekiz tüpe 100 μL NaCl çözeltisi (%10 m/v) ekleyin.
   2. Her tüpe optimum pH ile 100 μL kolloidal altın çözeltisi ekleyin.
   3. Yukarıda belirtilen sekiz tüpe monoklonal antikor çözeltilerini (protein konsantrasyonu 0.1 mg/mL-3.2 mg/mL) ekleyin.
   4. Karıştırmadan sonra çözeltilerin birkaç dakika bekletin. Her tüp çözeltisinin renk değişimini gözlemleyin ve kırmızı kalan tüpü kaydedin.
   5. AuNP-mAb konjugelerini hazırlamak için optimum mAb miktarı olarak en düşük mAb konsantrasyonuna ve kararlı çözelti rengine sahip antikor miktarını seçin.
3. Resüspenzyon tamponunu hazırlayın: 1 M Tris-HCl (pH 8.8), %1 (w/v) BSA, %0.5 (v/v) Ara 20 ve %1 (v/v) PEG 20000 ekleyin ve iyice karıştırın.
4. AuNP-mAb konjuge sentezi
   1. 10 mL kolloidal altın çözeltisi alın ve çözeltiyi en uygun pH değerine ayarlamak için_0,1 M K₂CO 3 kullanın.
   2. SSD mAb'leri uygun konsantrasyonlarda yavaşça ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika çalkalayın.
   3. Karışımı 83 x g 'da (1.000 rpm) 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Safsızlıklar veya çökelmiş kolloidal altın içeren çökelticiyi çıkarın.
   4. Karışımı 4 °C'de 30 dakika boyunca 8.330 x g'da (10.000 rpm) santrifüjleyin. Üstnatantı atın ve çökelti kolloidal altın-mAb konjugesidir.
   5. Yağışı dağıtmak için resüspenzyon tamponunu ekleyin.

3. Şeridin Montajı

NOT: Daha sonraki akış immünoassayları için, membran malzemesinin seçimi ve ön işlem, araştırılması gereken testi doğrudan etkileyecektir. İmmünromatografik şerit bir örnek ped, bir konjuge ped, bir nitroselüloz (NC) membran, bir emici ped ve bir PVC levhadan oluşur (Şekil 1). Membran malzemesi stereomikroskop ile kontrol edilmeli ve inhomogeneity ortadan kaldırılması için değerlendirilmelidir.

1. NC membranını, kartın emme ucunun kenarından 2 cm uzaklıktaki bir PVC tahtaya yapıştırın.
2. NC zarına (üst kenardan 2 cm) damla yönünde (1 mm genişliğinde) SSD-BSA (2 mg/mL) ekleyin ve NC zarına (alt kenardan 2 cm ayrı) keçi anti-mouse IgG (1 mm genişliğinde) damla yönünde ekleyin. Eklenen protein miktarını kontrol edin.
3. Emici pedi NC membran üzerindeki PVC levhaya takın ve NC membranıyla 2 mm örtün.
4. Cam elyaf membranı AuNPs-mAb konjuge çözeltisine batırın. Islak zarı 37 °C'de bir inkübatörde kurulayın.
5. Cam elyaf membranını 5 cm uzunluğunda ve 2 cm genişliğinde kırpın ve konjuge ped olarak kullanın.
6. Önceden tedavi edilmiş konjuge pedi NC zarın altına yapıştırın. NC membran ile örtünme uzunluğu 0,1 cm olmalıdır.
   NOT: Cam elyaf membran, proteinleri bağlama ve serbest bırakma konusunda güçlü bir yetebeye sahiptir.
7. Füzyon 3 membranı 1,8 cm uzunluğunda ve 3,5 cm genişliğinde kırpın ve örnek ped olarak kullanın.
8. Örnek pedi PVC tahtaya yapıştırın ve konjuge ped ile 2 mm örtüştürün.
9. Monte edilen kağıt tahtayı bir kesme makinesi kullanarak 3,5 mm genişliğinde şeritler halinde kesin ve toplu laminasyon sistemi kullanarak sıkıştırın.
10. Son olarak, test şeritlerini kabuğun içine yerleştirin, kurutucu içeren alüminyum bir folyo torbaya kapatın ve ışıktan uzak saklayın. ICS'ler şimdi toplandı.
    NOT: Yukarıdaki laboratuvar prosedürüdür. Üretimde altın püskürtme ekipmanları ve çapraz zar aletleri altın püskürtmek ve T ve C hatlarını yapmak için kullanılır.

4. Nicel Algılama

1. Kromatografi işlemini gözlemlemek için numune deliğine 50 μL numune çözeltisi bırakın.
   NOT: Emici ped tarafından yönlendirilen kılcal etkinin bir sonucu olarak, numune çözeltisi şeridin diğer ucuna taşınır. Numune çözeltisi konjuge pedine ulaştığında, numunedeki SSD (antijen), ped üzerine önceden yüklenmiş AuNPs-mAb ile reaksiyona sokar. Çözelti taşındığında ve T hattına ulaştığında, SSD'siz AuNPs-mAb, T-line'da kırmızı bir renk olarak gösterilen SSD-BSA (antijen taşıyıcı protein konjuge) tarafından seçici olarak yakalanabilir. Daha sonra, çözüm, AuNPs-mAb'nin bölgedeki keçi fare karşıtı IgG tarafından yakalandığı C çizgisine taşınır, böylece C çizgisinde kırmızı bir renk olarak görünür.
2. Şeritleri taşınabilir bir şerit okuyucu ile analiz edin. Makine, test hattının kontrol hattına (T/C) oranını sağlayabilir.
3. ICS testinin özgüllüğünü, hassasiyetini, tekrarlanabilirliğini ve kararlılığını değerlendirin.
   NOT: Nitel algılama altında, bir kırmızı çizgi pozitif bir sonucu (kontrol çizgisi) gösterir. İki kırmızı çizgi negatif bir sonucu gösterir (test ve kontrol çizgileri). Denetim satırı yoksa, test geçersiz kabul edilir.

Kolloidal altının karakterizasyonu
Hazırlanan kolloidal altın çözeltileri bordo kırmızıydı. AuNP'lerin morfolojisini ve şeklini belirlemek için TEM analizleri kullanılmıştır (Şekil 2A-D). Şekil 2A ve Şekil 2B, parçacıkların polihedral şekilli ve düzgün bir şekilde dağıtıldığını ortaya koymaktadır. AuNP'lerin ortalama çapı yaklaşık 14 nm(Şekil 2C) olarak bulunmuştur. AuNP'lerin yüksek çözünürlüklü TEM (HRTEM) görüntüsü Şekil 2D ve Şekil 2E'degösterilmiştir. Tek bir AuNP'den alınan HRTEM görüntüsü, 0,117 nm aralıklı sürekli bir saçak deseni gösterir. Beş altın kolloidal çözeltinin UV-vis emilim zirveleri 518 nm, 521 nm, 524 nm, 534 nm ve 540 nm olarak belirlendi ve bu da azalan sodyum sitrat ile parçacık boyutunun biraz arttığını gösterdi (Şekil 2F).

Şekil 2 Kolloidal altının karakterizasyonu. (A) AuNP'lerin TEM görüntüsü (100.000× büyütme). (B) AuNPs TEM görüntüsü (500.000× büyütme). (C) AuNP'lerin boyut dağılımı. TEM görüntüsünde görüldüğü gibi, AuNP'lerin çapları 10 nm ile 18 nm arasında değişmektedir ve ortalama çapı yaklaşık 14 nm'dir. (D, E) AuNPs yüksek çözünürlüklü TEM (HRTEM) görüntüsü. Tek bir AuNP'den alınan HRTEM görüntüsü, 0,117 nm aralıklı sürekli bir saçak deseni gösterir. (F) 10 nm ile 18 nm arasında değişen farklı AuNP'lerin UV-vis emilim spektrumları. Bu rakam Zhang ve ark.,201821. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Dipsticklerin değerlendirilmesi
ICS'nin Hassasiyeti
ICS'nin hassasiyetini belirlemek için, çeşitli SSD konsantrasyonlarını (150.000, 60.000, 12.000, 2400, 480 ve 96 ng/mL) standart örnekleri tespit etmek için immünokromatografik şeritler kullanılmıştır (Şekil 3A). Kontrol olarak çift damıtılmış su kullanıldı. Nicel deneyde, şeritler bir JY1502GS taşınabilir ICS okuyucu (Şekil 3B-C) tarafından tarandı. Doğrusal regresyon denklemi y = −0.113ln(x) + 1.5451 idi ve korelasyon katsayısı (R2) 0.983 idi (Şekil 3D). 96 ng/mL ila 150 μg/mL arasında iyi doğrusallık gösterdi. IC50 değeri 10.39 μg/mL idi. Nicel deneyde, en uygun test süresinin 10 dk olduğu öne sürüldü.

Şekil 3 SSD için yanal akışlı immünoassay karakterizasyonu. (A) ICS kullanılarak test edilen farklı SSD konsantrasyonları içeren standart çözümler için sonuçların fotoğrafları. (B) Eşleşen kolloidal altın taramasının fotoğrafı. (C) Kolloidal altın nicel alet tarafından taranan test ve kontrol hatlarının yoğunluk desenleri. (D) ICS kullanarak SSD tayini için standart icELISA eğrisi. Regresyon denklemi y = −0.113ln(x) + 1.5451 dir ve korelasyon katsayısı (R2)0.983'tür. Bu rakam Zhang ve ark.,201821. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ICS'nin Özgüllüğü
SSD benzeri bileşiklerle çapraz reaktivite değerlendirilerek ICS'nin özgüllüğü test edildi. Tablo 1, ICS'nin SSD ile ilgili bileşiklerle çapraz reaktivitesini göstermektedir. ICS'nin SSa ile sadece düşük çapraz reaktiviteye sahip olduğu ve hazırlanan ICS'nin yüksek özgüllüğe sahip olduğunu gösteren SSc, SSb1 veya SSb2 (Tablo 1) dahil olmak üzere diğer bileşiklerle çapraz reaksiyon göstermediği açıkça görülebilir.

Tablo 1. ICS ve icELISA ile ölçülen bileşiklerin çapraz reaktivitesi.  ICS'nin özgüllüğü ICS (a) ve icELISA (b) tarafından değerlendirildi. Bu tablo Zhang ve ark.,201821.

Kurtarma oranı
Tablo 2'degösterildiği gibi, ortalama iyileşme oranı% 102.05 idi (ortalama ± SD, n = 3). Doğruluğu ve tutarlılığı temelinde, bu test biyolojik numunelerde SSD'nin belirlenmesi için yeterince güvenilirdi.

Tablo 2. SSD'nin geri kazanım oranı.   Veriler, her bir SSD konsantrasyonundaki triplikat örneklerinden elde edilen ortalama ± SD'dir. İyileşme yüzdesi şu şekilde hesaplandı: kurtarma (%) = ölçülen tutar/tutar 0 ×. Bu tablo Zhang ve ark.,201821.

ICS testinin stabilite analizi
ICS'nin stabilitesini değerlendirmek için, 8 ve 16 hafta boyunca depolanan test şeritleri test edildi ve yeni hazırlanan şeritlerle karşılaştırıldı. Tablo 3, negatif ve pozitif numuneler için saklanan ve yeni hazırlanan şeritlerin sonuçlarının esasen değişmediğini, ICS'nin en az birkaç ay oda sıcaklığında saklanabileceğini ve büyük ölçekli tanıtım ve uygulama için uygun olduğunu göstermektedir.

Tablo 3. SSD analizi için kullanılan ICS arasındaki varyasyonlar.   aDeğerler, üretimden 1 gün sonra kullanılan 3 farklı şeritte üç taraflı numuneler için varyans katsayılarını gösterir. b Değerler, 4 hafta boyunca depolandıktan sonra kullanılan 3 farklı şeritte üç taraflı numuneler için varyans katsayılarını gösterir. c Değerler, 8 hafta boyunca depolandıktan sonra kullanılan 3 farklı şeritte üç taraflı numuneler için varyans katsayılarını gösterir. Bu tablo Zhang ve ark.,201821.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.