Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Gen Ekspresyonunun Ölçülmesi için Biyofilmler İçinde Pseudomonas aeruginosa'dan Toplam RNA İzolasyonu

2.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62755

⸱

24 Eylül 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 3Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 4Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

Bu makalede

Özet

Bu protokol, yüksek verimli dizileme için oda slaytlarında büyütülen Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerinden RNA'yı izole etmek için bir yöntem sunar.

Özet

Pseudomonas aeruginosa , kistik fibrozis (KF) hastalarının hava yollarında enfeksiyonlara neden olan fırsatçı bir bakteriyel patojendir. P. aeruginosa , bir ekzopolisakkarit matrisi tarafından korunan biyofilmler oluşturma yeteneği ile bilinir. Bu matris, mikroorganizmaların antibiyotik tedavisi de dahil olmak üzere dış etkenlere karşı daha dirençli olmasını sağlar. Araştırma için en yaygın biyofilm büyütme yöntemlerinden biri mikrotitre plakaları veya odacıklı slaytlardır. Bu sistemlerin avantajı, çoklu büyüme koşullarının test edilmesine izin vermeleridir, ancak dezavantajları, RNA ekstraksiyonu için sınırlı miktarda biyofilm üretmeleridir. Bu makalenin amacı, yüksek verimli dizileme için yeterli kalite ve miktardaki küçük miktarlarda biyofilmden toplam RNA'nın nasıl çıkarılacağına dair ayrıntılı, adım adım bir protokol sağlamaktır. Bu protokol, bu biyofilm sistemleri içinde gen ekspresyonunun incelenmesine izin verir.

Giriş

Kistik fibrozis (KF) hastalarında akciğer enfeksiyonları ve protez ile ilişkili enfeksiyonlar gibi kronik bakteriyel enfeksiyonların çoğu, biyofilmler içindeki organizmaların büyümesi ile karakterizedir. Biyofilmler1 , esas olarak polisakkaritler2'den oluşan bir matris içinde yer alan bakteri topluluklarıdır. Biyofilmlerdeki bakteriler yavaş büyüyen, metabolik olarak uykuda ve anaerobik, hipoksik koşullarda olabilir. Biyofilmler, antibiyotik penetrasyonunun azalması, ilaç akış pompalarının ekspresyonunun artması ve hücre bölünmesinin azalması gibi faktörler nedeniyle antibiyotiklere daha dirençlidir3. Bu ve diğer nedenlerden dolayı, büyük bir araştırma ilgisi vardır.

KF hastalarında kronik Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonları gibi kalıcı enfeksiyonları doğru bir şekilde incelemek için, biyofilm oluşumu ile görülen büyüme koşullarının in vitro olarak doğru bir şekilde yansıtılması gerekir. Yaygın, yüksek verimli bir yöntem, bunları oda slaytlarında veya mikrotitre plakalarında büyütmek ve konfokal mikroskopi4 ile biyofilm oluşumunu izlemektir. Planktonik veya serbest yüzen bir biyofilm bakteri yaşam tarzına geçişte anahtar bir düzenleyicinin ikincil haberci olan döngüsel-di-GMP5 olduğu bilinmektedir. Artan döngüsel-di-GMP seviyeleri, biyofilm büyümesini destekleyen spesifik genlerin ekspresyonunu arttırır. Küçük kodlamayan düzenleyici RNA'lar ve çekirdek algılama da biyofilm oluşumunun düzenlenmesinde önemli roller oynar5. Ekstrakte edilmiş bakteriyel RNA'yı dizileyerek biyofilm gen ekspresyonunu ölçmek zor olabilir. Örneğin P. aeruginosa, biyofilmlerde önemli miktarlarda üretilen üç ekzopolisakkarit (Psl, Pel ve aljinat) üretir 6,7. Bu polisakkaritler, RNA ekstraksiyonu ve saflaştırılmasına müdahale edebilir ve bu da düşük seviyelerde bakteri mRNA8 içeren saf olmayan preparatlara yol açabilir. Ticari olarak temin edilebilen RNA ekstraksiyon kitleri, planktonik bakteri kültürlerinden yüksek kaliteli RNA üretebilir, ancak biyofilm kültürleri 9,10,11 ile de çalışmayabilir. Biyofilmler için işe yaradığını iddia eden birkaç ticari RNA ekstraksiyon kiti vardır ve bunlardan birini bu yöntemle kullanırız.

Bu el yazmasında, P. aeruginosa biyofilmlerinin oda slaytlarında büyütülmesi ve yüksek verimli dizileme12,13 için bakteriyel mRNA'nın çıkarılması için prosedürleri açıklıyoruz. KF'li hastalardan alınan balgam örneklerinden toplanan klinik izolatları kullanarak, bu yöntemlerin farklı büyüme özelliklerine sahip izolatlar için kullanılabileceğini gösterdik. Önceki yayınlarla karşılaştırıldığında, bu protokol, bakteriyel biyofilm gen ekspresyonununincelenmesinde daha iyi başarı sağlamak için ayrıntılı olarak açıklanmıştır 11,14,15,16.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İnsan deneklerden balgam örneklerinin toplanması ve işlenmesi için Araştırma Etik Kurulu (REB) gereklidir. Bu çalışma Hasta Çocuklar Hastanesi (REB#1000019444) tarafından onaylanmıştır. Araştırma Etik Kurulu (REB) insan deneklerden balgam örneği toplamak ve saklamak zorundadır. Bu çalışmalar Hasta Çocuklar Hastanesi REB # 1000058579 tarafından onaylanmıştır.

1. Biyofilm oluşumu

  1. Bu çalışmada kullanılan KF hastalarının balgam örneklerinden elde edilen Pseudomonas aeruginosa izolatlarını gece boyunca 37 °C inkübatörde Luria Broth (LB) agar plakaları üzerinde büyütün.
    NOT: Tek bakteri kolonileri elde etmek için uygun çizgi tekniği önemlidir. Plakayı döndürürken çizgilenmek, bakteri hücrelerini yeterince seyreltir, böylece tek koloniler büyüyebilir.
    1. Plakanın yaklaşık 1 / 4'ü kaplanana kadar taze bir LB plakasının üst ucunda zikzak şeklinde bir aşılama döngüsü kullanarak bakterileri çizgileyin.
    2. Plakayı yaklaşık 60° döndürün. Yeni bir aşılama döngüsü alın ve zikzak desenini tekrarlayarak çizgili alandan bir kez ve plakanın ikinci, temiz bir alanına geçirin.
    3. Adım 1.1.2'yi plakanın üçüncü bir alanına yeni bir halka ile tekrarlayın. Kuluçka makinesine yerleştirirken kapağı değiştirin ve plakayı ters çevirin.
  2. Bir agar plakasından (tek bir bakteri suşu içeren) tek bir bakteri kolonisi seçmek için steril bir aşılama halkası kullanın ve 5 mL steril LB ortamı ile doldurulmuş bir kültür tüpünü aşılayın. Her seferinde yeni bir döngü kullanarak, aynı plakadan 5 mL LB ortamı ile doldurulmuş iki ek kültür tüpünü aşılayın.
  3. Farklı bakteri suşları için aynı aşılama prosedürünü tekrarlayın. Kültürleri gece boyunca 37 ° C'de 220 RPM'de çalkalayarak büyütün.
    NOT: Tek bir bakteri suşu içeren her agar plakası, 3 bağımsız kültür tüpünü aşılamak için kullanılır. Üç tüp, bir suş için üç kopya halinde biyolojik kopyaları temsil eder ve ayrı numuneler olarak muamele edilir. Bu, RNA'nın tek bir kültür tüpünden 3 kez çıkarılmasını gerektiren teknik kopyalardan farklıdır.
  4. 50 μL'lik bir gece kültürünü 4.95 mL yeni LB ortamı içeren yeni bir kültür tüpüne aktararak gece boyunca kültürlerin 1:100 dilüsyonunu hazırlayın.
  5. Seyreltilmiş kültürleri 37 ° C'de 220 RPM'de çalkalayarak veya OD600 0.1 veya daha yüksek olana kadar 3 saat daha büyütün. OD600'de bir spektrofotometrede hücre yoğunluklarını ölçün.
  6. 1.7 mL'lik yeni bir mikrofüj tüpünde, taze LB ile toplam 1.5 mL hacimde OD600'ü 0.1 ila 0.1 (erken log fazı) ayarlayın.
  7. Ters çevirerek hafifçe karıştırın. Ayarlanmış her kültürün 300 μL'sini, slayt başına 2 farklı numune elde etmek için 8 oyuklu bir oda slaytının 4 oyuğuna aktarın (Şekil 1).
  8. Slaytları rahatsız edilmeden gece boyunca 24 saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için, slaytları küçük bir plastik tepsiye nemli bir kağıt havlunun üzerine yerleştirin.

2. Biyofilm geri kazanımı

NOT: Her cam kaydırak sekiz ayrı kuyu içerir. Tek bir numune, havuzlanacak biyofilmlere sahip dört kuyudan oluşur17. Bu ekstraksiyon protokolü, biyofilmlerin bir seferde 2 kuyudan geri kazanıldığı 1 numune (4 kuyucuk) içindir. RNA ekstraksiyonları, bir boncuk çırpma adımı ve modifikasyonlarla birlikte sütun bazlı bir temizleme içeren ticari bir RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir. Reaktif hazırlama için üreticinin talimatlarını izleyin.

  1. Laminer akış başlığında, bir pipet ucu kullanarak ortamı 4 kuyudan 2'sinden yavaşça çıkarın. Slaytı 45°'lik bir açıyla eğin ve biyofilmlerin ayrılmasını önlemek için ortamı kuyucukların alt köşesinden pipetleyin.
  2. Slaytı eğik tutarak, boşaltılan iki kuyunun alt köşesine 300 μL RNaz içermeyen suyu nazikçe pipetleyerek planktonik hücreleri yıkayın. Suyu, adım 2.1'de açıklandığı gibi nazikçe pipetleyerek çıkarın. Mümkün olduğunca fazla su alarak yıkama adımını tekrarlayın.
  3. Tabanlarında biyofilm bulunan iki boşaltılmış kuyucuğun her birine 300 μL'lik bir RNA koruma reaktifi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Kuyucukların kırılmasını önlemek için hazne sürgüsünü bir cam plaka üzerine yerleştirin ve ardından biyofilm bakterilerini yeniden süspanse etmek için 2 kuyucuktaki biyofilmleri küçük, nükleaz içermeyen, steril bir metal spatula ile kazıyın. Aynı numuneden kalan 2 dokunulmamış kuyudan biyofilmler geri kazanılana kadar bekletin.
    NOT: Bir RNA koruma reaktifinin eklenmesi, aynı numunenin kalan iki kuyusunu işlerken, kazınmış oyuklardaki biyofilm numunelerinin ortam sıcaklığında stabilitesini sağlar. RNA koruma reaktifi, hücreleri parçalar ve nükleazları ve bulaşıcı ajanları etkisiz hale getirerek RNA'nın korunmasına neden olur.
  4. Bir numune için kalan 2 kuyucuktan biyofilmleri geri kazanmak için (hatırlatma: bir numune 4 kuyudan oluşur), LB ortamını kalan 2 yeni kuyudan adım 2.1'de açıklandığı gibi çıkarın. Planktonik hücreleri, daha önce olduğu gibi her iki yeni kuyudan RNaz içermeyen su ile yıkamak için adım 2.2'yi tekrarlayın.
  5. Adım 2.3'ün sonunda oluşturulan koruma reaktifinde kazınmış biyofilmler ile ilk 2 oyuğa geri dönün ve çok fazla kabarcık oluşturmamaya çalışarak 300 μL yeniden süspanse edilmiş biyofilmi kazınmış bir kuyudan karıştırmak için yavaşça pipetleyin.
    1. Kuyudaki tüm içeriği yeni yıkanmış, boşaltılmış kuyulardan birine aktarın. İkinci kazınmış kuyudan 300 μL yeniden süspanse edilmiş biyofilmi kalan, yeni yıkanmış, boşaltılmış kuyuya karıştırın ve aktarın.
      NOT: Biyofilmlerle yeni yıkanmış 2 kuyucuğa yeni RNA koruma reaktifi eklemek yerine, halihazırda koruma reaktifi içinde bulunan önceden kazınmış biyofilmleri bu yeni yıkanmış kuyucuklara aktarın. Bu, birleşik numune hacmini, ticari RNA ekstraksiyon kiti için giriş gereksinimlerini karşılayacak kadar düşük tutacaktır. Şematik için Şekil 1'e bakın.
  6. Biyofilm bakterilerini yeniden süspanse etmek için hazne sürgüsünü bir cam plaka üzerine yerleştirerek ve biyofilmleri 2 yeni kuyucukta küçük, nükleaz içermeyen, steril bir metal spatula ile kazıyarak biyofilmleri adım 2.3'teki gibi yeni kuyucuklarda kazıyarak tekrarlayın.
  7. 2 yeni kuyudan gelen tüm yeniden süspanse edilmiş biyofilmi tek bir RNaz içermeyen, düşük bağlı, 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde birleştirin. Toplam ~ 500 - 600 μL olması gereken hacmi ölçün.
    NOT: Bu ikinci yeni kuyu çiftinden elde edilen birleşik biyofilm süspansiyonu, bir numunenin orijinal 4 kuyusundan gelen tüm biyofilm malzemesini içerecektir.

3. Toplam RNA izolasyonu ve kalite değerlendirmesi

NOT: RNA ekstraksiyonu, biyofilmler üzerinde çalıştığını iddia eden ticari bir RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir. Münferit bileşenler, mümkünse Malzeme Tablosuna dahil edilmiştir. Her bir saflaştırma adımının arkasındaki mekanizmaların açıklamaları mümkün olduğunda sağlanır.

  1. Tüpte toplam 750 μL'ye yetecek kadar RNA koruma reaktifi ekleyin. Tüm hacmi 0,1 ve 0,5 mm boncuklar içeren 2 mL'lik bir boncuk çırpma lizis tüpüne aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız). Bir boncuk çırpıcıda maksimum hızda 2 1/2 dakika çırpın.
    NOT: 0,1 mm ve 0,5 mm yüksek yoğunluklu boncukların yanı sıra bir boncuk çırpıcı üzerinde yüksek hızlı karıştırma kombinasyonu, mikrobiyal hücre duvarlarının tam homojenizasyonunu sağlar.
  2. Boncukları peletlemek için 16.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, böylece herhangi bir boncuk transferini en aza indirin, bu da adım 3.3'ü kolaylaştıracaktır. Sesi ölçün.
  3. Eşit hacimde RNA lizis tamponu (~ 450 μL) ekleyin ve iyice karıştırın. 800 μL'ye kadar numuneyi, herhangi bir boncuk transferinden kaçınarak, bir toplama tüpündeki bir silika kolonuna aktarın ve 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. DNA sütuna bağlıyken RNA'yı içerdiği için akışı kaydedin.
    NOT: RNA lizis tamponu, hücreleri parçalamak için guanidinyum tiyosiyanat ve deterjan N-lauroylsarcosine içerir. Guanidinyum tiyosiyanat, aynı zamanda nükleazları inaktive eden ve spin kolonunda bulunan silika varlığında DNA'nın silika18'e bağlanmasını destekleyen kaotropik bir ajandır. Etanolün yokluğu, RNA'nın değil, DNA'nın silika spin-kolonuna19 tercihli bağlanmasına izin verir. Adım 3.3'ün amacı, genomik DNA'yı bağlamak ve çıkarmaktır. Akış kısmında bulunan RNA'yı korumak istiyoruz.
  4. Daha fazla numune kalırsa, sütunu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve numunenin geri kalanıyla yeniden yükleyin. 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. RNA ile akışı koruyun ve ilk alikot ile birleştirin.
  5. Kombine akış hacmini ölçün ve eşit hacimde %100 etanol ekleyin ve iyice karıştırın. 800 μL'ye kadar çözeltiyi bir toplama tüpündeki yeni, ikinci bir silika spin kolonuna aktarın ve 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
    NOT: RNA'yı içeren kaotropik tuz çözeltisine etanol ilavesi, RNA'nın silika spin-kolonuna19 bağlanmasını arttırır.
  6. 800 μL>lik çözeltiler için, döndürme kolonunu yeniden yükleyin ve tüm çözelti döndürülene kadar santrifüjleyin. Her dönüşten sonra akışı atın.
  7. Kolona 400 μL yıkama tamponu ekleyin ve tuzların bir kısmını çıkarmak için 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
  8. DNaz I reaksiyon karışımını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve kalıntı DNA'yı çıkarmak için kolon içi DNaz işlemini gerçekleştirin.
  9. 1 U / μL'lik bir çözelti yapmak için liyofilize DNaz I'i 275 μL RNaz içermeyen suda yeniden süspanse edin. Hafifçe ters çevirerek karıştırın.
  10. 5 μL seyreltilmiş DNaz I'i sağlanan 75 μL DNaz sindirim tamponu ile birleştirin. Ters çevirerek hafifçe karıştırın.
  11. Hazırlanan çözeltinin 80 μL'sini doğrudan kolon matrisinin üzerine ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
  12. Kolona 400 μL RNA hazırlık tamponu ekleyin ve 30 saniye boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin. Akışı atın.
  13. Kolona 700 μL RNA yıkama tamponu ekleyin ve santrifüjleme işlemini tekrarlayın. Akışı atın.
  14. 400 μL RNA yıkama tamponu ekleyin ve artık tamponu tamamen çıkarmak için sütunu 2 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Kolondaki yabancı maddeleri temizlemek için 2 farklı yıkama adımı vardır. Hazırlık tamponu, artık proteinleri uzaklaştırmak için etanol ile karıştırılmış zayıf bir kaotropik tuz içerir. Daha sonra, yıkama tamponu, tuzları uzaklaştırmak için etanol yıkamaları yapmak için kullanılır. RNA 19,20'nin verimli bir şekilde elüsyonuna izin vermek için kalan etanol çıkarılmalıdır.
  15. Kolonu dikkatlice yeni, düşük bağlamalı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  16. 50 μL RNaz içermeyen suyu doğrudan kolon matrisine ekleyin ve 5 dakika inkübe edin. RNA'yı elüte etmek için 1 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
  17. PCR inhibitörlerini çıkarmak için ek temizlik için, yeni bir toplama tüpüne bir PCR inhibitör filtresi yerleştirin. Sağlanan inhibitör hazırlama çözeltisinden 600 μL ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
  18. Filtreyi yıkamak için 8.000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Yıkanmış filtreyi yeni bir düşük bağlamalı mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  19. Ayrıştırılan RNA'yı adım 3.13'ten yıkanmış filtreye aktarın ve 3 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: RNA hemen kullanılabilir veya -80 °C'de saklanabilir.
  20. Yüksek hassasiyetli bir florometrik sistem21 kullanarak RNA'nın konsantrasyonunu belirleyin.
    NOT: Bu sistemler, ilgilenilen hedefe özgü çözeltide küçük bir miktar RNA'nın hassas bir şekilde ölçülmesine izin verir.
    1. RNA kalitesinin bir ölçüsü olan bir RIN (RNA bütünlük numarası) sağlayabilen otomatik bir elektroforez sistemi kullanarak RNA'nın kalitesini değerlendirin22,23.

4. Ribozomal RNA tükenmesi ve yüksek verimli dizileme

  1. Bakteriyel rRNA tükenmesi ve RNA yönlü kütüphane hazırlığı için RNA'ları Toronto Üniversitesi'ndeki (Toronto, Kanada) (https://www.cagef.utoronto.ca/) Genom Evrimi ve İşlevi Analiz Merkezi (CAGEF) genom merkezine gönderin (bkz.
    NOT: Bakteriyel rRNA tükenmesi,24'ün çıkarılması için 5S, 16S ve 23S rRNA'ları hedefler.
  2. Ticari bir rRNA bakteri tükenme kiti kullanarak rRNA'ları tüketin. 10 ng - 1 μg bozulmamış veya kısmen bozulmuş toplam RNA girmek için protokolü izleyin.
  3. Her kitaplığa bağlı farklı indekslere sahip bir RNA yönlü kitaplık hazırlık kiti kullanarak RNA dizileme kitaplıkları oluşturun.
  4. Her RNA kütüphanesinin eşmolar miktarlarını bir araya getirin ve 100 baz çift uçlu okuma25 ile yüksek verimli dizileme gerçekleştirin.

5. Sıralama okumalarının kalite değerlendirmesi

NOT : Ücretsiz, açık kaynaklı platform Galaxy27 aracılığıyla ücretsiz olarak kullanılabilen FastQC26 programını kullanarak sıralama okumalarının kalitesini kontrol edin.

  1. https://usegalaxy.org/'a gidin. Giriş Yap veya Kaydol menüsüne tıklayın ve kimlik bilgileriyle giriş yapın veya bir hesap oluşturun.
  2. Sayfanın sol üst köşesinde, Araçlar menüsü altında yer alan Veri Yükle bağlantısına tıklayın ve fastq.gz sıralama dosyalarını yükleyin. Dosya adlarının sayfanın sağ tarafında, Geçmiş panelinin altında görünmesini bekleyin.
  3. Programların listesini görüntülemek için Araçlar menüsü altında FASTQ Kalite Kontrolü'nü seçin. Ekranın orta panelini dolduracak olan FastQC'yi seçin.
  4. Mevcut geçmişinizden kısa okuma verileri altında, açılır menüden yüklenen fastq.gz dosyalarını seçin.
  5. Programı çalıştırmak için Yürüt'ü seçin.
  6. Sonuçları Geçmiş panelinin altında görüntüleyin (Tablo 2).
    NOT: Galaxy'nin nasıl kullanılacağı hakkında daha ayrıntılı talimatlar için https://galaxyproject.org/support/ adresindeki destek sayfasını ziyaret edin.

6. Sıralama okumalarının haritalanması

NOT : Listelenen, RNA-seq verileri için adaptör kırpma ve okuma eşlemesi için temel bir boru hattıdır. Adaptör dizileri, Trimmomatic28 kullanılarak okumalardan kırpılır. Kırpılmış okumalar, BWA 30 ve Samtools 31 kullanılarak NCBI'den (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)29'danelde edilen P. aeruginosa PAO1 referans genomuna (NC_002516.2) eşlenir. Basitlik için, bir çift okuma PA_1.fq ve PA_2.fq olarak adlandırılır; Kırpılacak bağdaştırıcı okuma dosyasına adapter.fa adı verilir; ve PAO1 referans dizisi PAO1.fasta olarak adlandırılır. Tüm araçlar açık kaynak kodludur ve UNIX/LINUX ortamında çalışır. Bu komutları uygulamak için UNIX/LINUX'un temelleri hakkında bilgi sahibi olmanız şiddetle tavsiye edilir.

  1. UNIX/LINUX'ta bir pencere açın.
  2. Java, Trimmomatic, BWA ve Samtools'u yükleyin.
  3. Dosyanın bulunduğu klasöre gidin trimmomatic-0.39.jar.
  4. Şu komutu yazarak okumalardan tüm bağdaştırıcı dizilerini kesin:
    Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP: adapters.fa
    NOT: Yalnızca adaptör dizileri kaldırılır. Okumalar kalite için kırpılmamıştır32.
  5. PAO1.fasta başvuru dosyasını aynı klasöre taşıyın.
  6. BWA'yı kullanarak referansı şu komutla indeksleyin:
    Bwa endeksi PA01.fasta
  7. Aşağıdaki 4 komutu yazarak eşleştirilmiş okumaları referans genomla eşleyin. Her komutu bir öncekinin işi bittikten sonra yazın.
    Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
    Samtools görünümü -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
    Samtools sıralama PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
    Samtools dizini PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
  8. Şu komutu yazarak eşleme istatistiklerini görüntüleyin:
    Samtools flagstat PA_R1R2_sorted.bam
    NOT: İstatistiklerin 3. satırı , referans genomla eşleşen okumaların oranını bildirir.
  9. Sırasıyla aşağıdaki 2 komutla33 ortalama okuma derinliğini ve kapsama alanını hesaplayın:
    Samtools Derinlik -A PA_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; s+=$3}END{print s/c}'
    Samtools Derinlik -A PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; if($3>0) total+=1}END{print (toplam/c)*100}'

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yönteme genel bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Daha önce P. aeruginosa biyofilmlerini büyütmek için 8 oyuklu odacıklı slaytlar kullandık ve daha sonra bunları farklı zaman noktalarında konfokal mikroskopi ile incelemeden önce antibiyotiklere maruz bıraktık12,13. Bu yöntem, tedavi sonrası gen ekspresyonu değişikliklerini incelemek için bu sistemde yetiştirilen biyofilmlerden doğrudan toplam RNA'yı çıkarmak için kullanılabilir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Toplam RNA, 17 farklı bakteriyel biyofilm örneğinden üç kopya halinde başarıyla ekstrakte edilir ve toplam 51 örnek elde edilir. Kırk dokuz RNA kütüphanesi bir araya getirilir ve başarılı bir şekilde dizilenir. Genel olarak, bu, numunelerin yarısından fazlasının düşük bolluk ve optimal kalitenin altında olduğu düşünülse de, kalite kriterlerimizi %96'lık bir başarı oranıyla doğrulamaktadır 34,35,36,37....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir açıklaması yoktur.

Teşekkürler

Yazar katkıları: P.W., Y.Y. ve V.W. çalışmanın kavramsallaştırılmasında yer aldı. K.G., L.J., A.M. ve P.W. laboratuvar protokollerini optimize etti. KG için finansman, BioTalent Canada aracılığıyla Öğrenci İşe Yerleştirme Programı sübvansiyonu ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Agilent 2100 BiyoanalizörAgilentG2939BABiyomoleküllerin otomatik elektroforezi
Agilent RNA 6000 pico kitiAgilent5067-1513oluşturmak için yüksek hassasiyetli RNA elektroforez çipi
Zymo ResearchD7001-1-50Nükleik asit saflaştırma kitinin bir parçası olarak satılan bir guanidinyum tiyosiyanat ve N-Lauroylsarcosine bazlı lizis tamponu
DNA/RNA Hazırlık TamponuZymo ResearchD7010-2-10DNA ve RNA'nın saflaştırılması için kullanılan bir guanidin HCl ve etanol tamponu
DNA/RNA KalkanıZymo ResearchR1100-50DNA ve RNA koruma/koruma reaktifi
DNA/RNA Yıkama TamponuZymo ResearchD7010-3-6DNA ve RNA'nın saflaştırılması için kullanılan bir tuz ve etanol tamponu
DNBSEQ G-400RSMGIG-400RSYüksek verimli sıralayıcı
MGIEasy RNA Yönlü Kitaplık Hazırlık SetiMGI1000006386Toplam RNA'dan MGI yüksek verimli dizileme platformları için kitaplıklar oluşturun.
Mini-Beadbeater-96BioSpec1001Yüksek enerjili, yüksek verimli hücre bozucu
NEBNext rRNA Tükenme Kiti (bakteri)New England BiolabsE7850XBakteriyel rRNA'nın verimli ve spesifik tükenmesi (5S, 16S, 23S)
Nunc Lab-Tek II hazneli kızak sistemiThermo Fisher Scientific154534Çıkarılabilir kuyulu 8 oyuklu odacıklı kaydırak
Qubit FlorometreThermo Fisher ScientificQ33238DNA, RNA ve proteinler için Florometre
Qubit RNA HS Test KitiThermo Fisher ScientificQ32852RNA konsantrasyonunu ölçmek için yüksek hassasiyetli florometrik test
Spin-Away FiltreleriZymo ResearchC1006-50-FÖncelikle genomik DNA'yı bağlamak veya çıkarmak için kullanılan silika bazlı spin sütunu
Steril aşılama döngüleri, 1 uLSarstedt86.1567.050Mikroorganizmaların manipülasyonu için steril, tek kullanımlık aşılama döngüleri
ZR BashingBoncuk Lizis tüpleriZymo ResearchS6003-50Biyolojik numunelerin homojenizasyonu için 0,1 ve 0,5 mm boncuk lizis matrisi içeren 2 mL tüpler
Zymo Spin IIICG SütunlarıZymo ResearchC1006-50-GDNA ve RNA'nın saflaştırılması için silika bazlı spin kolon
Zymo-Spin III-HRC FiltreleriZymo ResearchC1058-50Polifenolik bileşikler, hümik/fulvik asitler, tanenler, melanin vb. gibi inhibitörleri çıkarın.
Zymobiomics DNA/RNA Miniprep kitiZymo ResearchR2002DNA ve RNA ikili ekstraksiyon kiti
Zymobiomics HRC Hazırlık solüsyonuZymo ResearchD4300-7-30PCR inhibitörlerini çıkarmak için Zymo-Spin III-HRC Filtreleri ile birlikte kullanılmak
RIN DNA/RNA Lizis Tamponu üzere

Kaynaklar

  1. Beaudoin, T., Waters, V. Infections With Biofilm Formation: Selection of Antimicrobials and Role of Prolonged Antibiotic Therapy. The Pediatric Infectious Disease Journal. 35 (6), 695-697 (2016).
  2. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
  3. Folsom, J. P., et al. Physiology of Pseudomonas aeruginosa in biofilms as revealed by transcriptome analysis. BMC Microbiology. 10, 294(2010).
  4. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  5. Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 791-808 (2013).
  6. Colvin, K. M., et al. The Pel and Psl polysaccharides provide Pseudomonas aeruginosa structural redundancy within the biofilm matrix. Environmental Microbiology. 14 (8), 1913-1928 (2012).
  7. Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183 (18), 5395-5401 (2001).
  8. Cury, J. A., Koo, H. Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms. Analytical Biochemistry. 365 (2), 208-214 (2007).
  9. Francavilla, M., et al. Extraction, characterization and in vivo neuromodulatory activity of phytosterols from microalga Dunaliella tertiolecta. Current Medicinal Chemistry. 19 (18), 3058-3067 (2012).
  10. Atshan, S. S., et al. Improved method for the isolation of RNA from bacteria refractory to disruption, including S. aureus producing biofilm. Gene. 494 (2), 219-224 (2012).
  11. Franca, A., Melo, L. D., Cerca, N. Comparison of RNA extraction methods from biofilm samples of Staphylococcus epidermidis. BMC Research Notes. 4, 572(2011).
  12. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. The Journal of Visusalized Experiments. (47), e2481(2011).
  13. Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model. The Journal of Visusalized Experiments. (118), e54819(2016).
  14. Cockeran, R., et al. Biofilm formation and induction of stress response genes is a common response of several serotypes of the pneumococcus to cigarette smoke condensate. The Journal of Infection. 80 (2), 204-209 (2020).
  15. Bisht, K., Moore, J. L., Caprioli, R. M., Skaar, E. P., Wakeman, C. A. Impact of temperature-dependent phage expression on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. npj Biofilmsand Microbiomes. 7 (22), (2021).
  16. Harrison, A., et al. Reprioritization of biofilm metabolism is associated with nutrient adaptation and long-term survival of Haemophilus influenzae. NPJ Biofilms and Microbiomes. 5 (1), 33(2019).
  17. Sousa, C., Franca, A., Cerca, N. Assessing and reducing sources of gene expression variability in Staphylococcus epidermidis biofilms. BioTechniques. 57, 295-301 (2014).
  18. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
  19. Coppin, C. Re: How do silica based RNA spin columns only bind RNA and not DNA. , Available from: https://www.researchgate.net/post/How_do_silica_based_RNA_spin_columns_only_bind_RNA_and_not_DNA/60b017bffa5c4151cac1c/citation/download (2021).
  20. Kennedy, S. A complete guide to how nucleic extraction kits work. , Available from: https://bitesizebio.com/13516/how-dna-extraction-rna-miniprep-kits-work/ (2021).
  21. Qubit RNA HS Assay Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FQubit_RNA_HS_Assay_UG.pdf&title=VXNlciBHdWlkZTogUXViaXQgUk5BIEhTIEFzc2F5IEtpdHM (2015).
  22. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN) - Standardization of RNA Quality Control (Application report # 5989-1165EN). , Available from: https://www.agilent.com/cd/library/applications/5989-1165EN.pdf (2016).
  23. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  24. Culviner, P. H., Guegler, C. K., Laub, M. T. A Simple, Cost-Effective, and Robust Method for rRNA Depletion in RNA-Sequencing Studies. mBio. 11 (2), (2020).
  25. MGIEasy RNA Directional Library Prep Set User Manual verA2. MGI Tech Co. , Available from: https://en.mgi-tech.com/products/reagents_info/14/ (2020).
  26. Andrews, S. FastQC: A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  27. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
  28. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina Sequence Data. Bioinformatics. , (2014).
  29. NCBI Resource Coordinators. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), (2016).
  30. Li, H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM. arXiv. , (2013).
  31. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), (2009).
  32. Liao, Y., Shi, W. Read trimming is not required for mapping and quantification of RNA-seq reads at the gene level. NAR Genomics and Bioinformatics. 2 (3), (2020).
  33. Penir, S. Calculating Mapping Statistics from a SAM/BAM file using SAMtools and awk. , Available from: https://sarahpenir.github.io/bioinformatics/awk/calculating-mapping-stats-from-a-bam-file-using-samtools-and-awk/ (2019).
  34. Haile, S., et al. Evaluation of protocols for rRNA depletion based RNA sequencing of nanogram inputs of mammalian total RNA. PLoS ONE. 14 (10), 0224578(2019).
  35. Schuierer, S., et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 18 (442), (2017).
  36. Shanker, S., et al. Evaluation of Commercially Available RNA Amplification Kits for RNA Sequencing Using Very Low Input Amounts of Total RNA. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), (2015).
  37. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10, 623-629 (2013).
  38. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology. 17 (13), (2016).
  39. Illumina, Inc. Coverage depth recommendations. , Available from: https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/plan-experiments/coverage.html (2021).
  40. What is a good sequencing depth for bulk RNA-Seq. ECSEQ Bioinformatics. , Available from: https://www.ecseq.com/support/ngs/what-is-a-good-sequencing-death-for-bulk-rna-seq (2019).
  41. Bedre, R. Sequencing coverage and breadth of coverage. , Available from: https://www.reneshbedre.com/blog/sequencing-coverage.html (2021).
  42. Dotsch, A., et al. The Pseudomonas aeruginosa transcriptome in planktonic cultures and static biofilms using RNA sequencing. PLoS One. 7 (2), 31092(2012).
  43. Chen, Y., et al. Population dynamics and transcriptomic responses of Pseudomonas aeruginosa in a complex laboratory microbial community. npj Biofilms and Microbiomes. 5 (1), (2019).
  44. Thoming, J. G., et al. Parallel evolutionary paths to produce more than one Pseudomonas aeruginosa biofilm phenotype. NPJ Biofilms and Microbiomes. 6, 2(2020).
  45. Soares, A., et al. Understanding ciprofloxacin failure in Pseudomonas aeruginosa biofilm: persister cells survive matrix disruption. Frontiers in Microbiology. 10, 2603(2019).
  46. Whiteley, M., et al. Gene expression in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 413, (2001).
  47. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1, (2006).
  48. Liu, Y., Zhou, J., White, K. P. RNA-seq differential expression studies: more sequence or more replication. Bioinformatics. 30 (3), (2014).
  49. Wieczorek, D., Delauriere, L., Schagat, T. Methods of RNA Quality Assessment. , Available from: https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment/ (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Biofilm RNA İzolasyonuToplam RNA EkstraksiyonuBiofilm OluşumuEkzopolisakkarit MatrisiMikrotiter Plaka BiofilmleriYüksek Verimli SekanslamaBakteriyel PatojenKistik Fibrozis

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.