Burada, gerçek zamanlı veya sabit materyalde hücresel çözünürlüğe sahip primer kortikal nöronlarda sitotoksik stres üzerine nöronal sağkalımı araştırmak için basit, güçlü ve çok yönlü bir metodoloji sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
* These authors contributed equally
Burada, gerçek zamanlı veya sabit materyalde hücresel çözünürlüğe sahip primer kortikal nöronlarda sitotoksik stres üzerine nöronal sağkalımı araştırmak için basit, güçlü ve çok yönlü bir metodoloji sunuyoruz.
Nöronal kayıp, inme, Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı dahil olmak üzere birçok nöropatolojinin merkezinde yer alır. Sitotoksik stres üzerine nöronal sağkalım sürecini incelemek için farklı yöntemler geliştirilmiştir. Çoğu yöntem, tek hücre çözünürlüğüne izin vermeyen veya karmaşık ve maliyetli metodolojiler içeren biyokimyasal yaklaşımlara dayanmaktadır. Burada sunulan, nöronal sağkalımı incelemek için çok yönlü, ucuz ve etkili bir deneysel paradigmadır. Bu yöntem, nöronların seyrek floresan etiketlemesinden ve ardından canlı görüntüleme ve otomatik nicelemeden yararlanır. Bu amaçla, nöronlar floresan belirteçleri eksprese etmek için elektroporasyona tabi tutulur ve hücre yoğunluğunu kolayca düzenlemek ve sağkalımı artırmak için elektroporasyonlu olmayan nöronlarla birlikte kültürlenir.
Elektroporasyon ile seyrek etiketleme, basit ve sağlam bir otomatik miktar tayini sağlar. Ek olarak, floresan etiketleme, spesifik moleküler yolları incelemek için ilgilenilen bir genin birlikte ekspresyonu ile birleştirilebilir. Burada, nörotoksik bir model olarak bir inme modeli, yani uygun fiyatlı ve sağlam bir ev yapımı hipoksik odada gerçekleştirilen oksijen-glikoz yoksunluğu (OGD) testi sunuyoruz. Son olarak, yarı otomatik veri işleme için görüntü analizi için IN Cell Analyzer 2200 veya açık kaynaklı ImageJ kullanılarak iki farklı iş akışı açıklanmaktadır. Bu iş akışı, farklı deneysel toksisite modellerine kolayca uyarlanabilir ve yüksek verimli tarama için ölçeklendirilebilir. Sonuç olarak, açıklanan protokol, canlı görüntülemede belirli genlerin ve yolakların rollerini test etmek ve yüksek verimli ilaç taraması için uygun olabilecek, ulaşılabilir, uygun fiyatlı ve etkili bir in vitro nörotoksisite modeli sağlar.
Nöronal bozuklukların incelenmesi, genetik, moleküler ve hücresel analizlere uygun deneysel modeller gerektirir. Birincil kortikal nöronlar, nöronal sağkalım ve toksisiteyi incelemek için çok güçlü bir modeldir 1,2,3,4. Uygun koşullar altında, birincil nöronlar aşamalı olarak sinaptik temaslar geliştirecek ve olgun nöronların ayırt edici özelliklerini sunacaktır. Bu nedenle, bu model, nöronların fizyolojisini modellemede ölümsüzleştirilmiş hücre dizilerinden daha güvenilirdir ve manipülasyonlara hayvan mode....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Hayvanların kullanıldığı tüm prosedürler, enstitünün biyoetik hayvan komitesi tarafından denetlenmeli ve yerel düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Burada sunulan prosedürler, yetkilendirilen makam tarafından onaylanmıştır ve İspanya ve Avrupa'daki düzenlemelere uygundur.
1. Birincil nöronal kültür
NOT: Tüm adımlar, steril koşulları korumak için steril malzemeler ve solüsyonlar kullanılarak kültür başlığının içinde gerçekleştirilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu protokol inme için in vitro bir model oluşturmayı amaçlamaktadır. Bireysel elektropore nöronların tanınmasına izin verecek yeterli bir nöronal yoğunluk elde etmek önemlidir. Kaplamadan sonraki nöronal kültürün aşaması da çok önemlidir. Kültürdeki nöronların olgunlaşması ilerleyicidir. Büyüme faktörlerine, nörit büyümesine, bağlanabilirliğe ve elektrofizyolojik aktiviteye bağımlılık, aşamaya bağlı olarak büyük ölçüde değişecektir. 4-6 günlük bu spesifik koşullarda in vitro, nöritler iyi uzamış olmasın.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu protokol, in vitro bir inme modellemenin etkili bir yolunu gösterir. Bu amaca ulaşmak için, elektroporasyon sistemi NEPA215 kullanarak kortikal nöronların seyrek etiketlenmesini önerdik. Bu, kitleri veya belirli cihazları kullanan diğer sistemlere kıyasla protokolün minimum işletme maliyetiyle özelleştirilmesine izin veren açık bir sistemdir. Naif ve elektroporatlı nöronların karışık kültürü, düşük yoğunluklu nöronal kültüre kıyasla daha fazla esneklik.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Carlos Dotti'ye nöronal kültür konusundaki uzmanlığını paylaştığı için teşekkür ederiz. Ayrıca, Avrupa FEDERER fonu tarafından desteklenen Centro de Investigación Principe Felipe'nin (CIPF) Cytomics Core Facility'sinden Alicia Martínez-Romero'ya da teşekkür ederiz. Proje, İspanya Ekonomi ve Rekabet Edebilirlik Bakanlığı tarafından (SAF2017-89020-R) reaktifler, malzemeler ve YDC ve PF maaşları için desteklenmektedir. PF ayrıca RyC-2014-16410 hibesi ile de desteklenmektedir. CGN ve PF, Generalitat Valenciana'dan Conselleria de Sanitat ve AGM (ACIF/2019/015) tarafından desteklenmektedir. Ángela Rodríguez Prieto, İspanya Bilim, Yenilik ve....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10 cm petri kapları | FISHER SCIENTIFIC, S.L. | 1130-9283 | |
| 3,5 cm petri kapları | Sterilin | ||
| 75 cm2 şişesi | Corning | 430641U | |
| B-27 | Yaşam Teknolojileri | 17504-044 | |
| Hücre kültürü plakaları | Corning kuruluşu Costar® | 3513 | |
| Hücre inkübatörü | Thermo Electron Corporation | Model 371 | |
| Hücre süzgeci 70 ve mikro; m | Falcon | 352350 | |
| Soğuk ışıklar | Schott | 223488 | KL 1500 LCD |
| Lameller (15 mm) | Marienfeld | 111530 | |
| CU500 Küvet Odası | Nepa Gene | ||
| CU600 Küvet Stand Tutucu | Nepa Gene | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich Quimica, SL | D9542-10MG | 1:2000 |
| DMSO | Panreac | A3672 | |
| Dumont İnce Forseps | FST | 11254-20 | |
| Dumont İnce Forseps | FST | 11252-00 | |
| EC-002S NEPA Elektroporasyon Küvetleri, 2 mm boşluk | Nepa Gen Filtresi | ||
| süzgeci | Falcon | 352350 | |
| İnce Makas-Keskin-Kör | FST | 14028-10 | |
| İnce Makas-ToughCut r | FST | 14058-09 | |
| GFP tavuk IgY | Aves Labs | GFP-1010 | 1:600 |
| Glikoz | Sigma | 68769-100ml | |
| GlutaMAX-I Takviyesi 200 mM 100 mL | Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HBSS | Thermofisher | 14175-095 | https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html |
| Hepes 1 M | ThermoFisher | 15630-080 | |
| At Serumu | İnvitrojen | 26050088 | |
| MEM | Thermofisher | 11095080 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080 |
| Mikroskop lamı (polilizin) | VWR | 631-0107 | Boyut: 25 x 75 x 1 mm |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich Quimica, Sl | 81381-250G | |
| İğneler sarı, 30 gauge | BD Microlance ve ticaret; 3 | 304000 | |
| NEPA21 elektroporatör | Nepa Gene | ||
| Neubauer odası | Blau Marka | 717805 | |
| Nörobazal Orta | ThermoFisher | 21103-49 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Paraformaldehit (PFA),% 95 | Sigma-Aldrich Quimica, SL | 158127-500G | Kullanım çözümü: %4 |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Fazzari ve diğerleri, Nature, 2010 | için Plazmid | ||
| (Penisilin, Streptomisin) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Stereomikroskop | DÜNYA HASSASİYET CİHAZLARI | ||
| Şırıngalar | BD Plastipak 1ml | 303176 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Quimica, S. L. | MDL numarası: MFCD00128254 | Noniyonik |
| Tripsin-EDTA | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tüpler 15 mL | Fisher | 05-539-4 | |
| Tüpler 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Tupperware | - | Vidalı kapaklı hermetik tupperware. SP Berner - Koniklik 1 L Redondo con Rosca. Herhangi bir eşdeğer hermetik Tupperware herhangi bir süpermarkette satın alınabilir. | |
| Su banyosu | SHELDON LABORATUVAR MODEL 1224 | 1641951 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu makale yayımlandı
Video yakında