Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tek Hücreli ve Gerçek Zamanlı Çözünürlükle Primer Nöronal Kültürde Nöronal Sağkalımı İncelemek İçin Ölçeklenebilir Bir Yöntem

1.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62759

⸱

26 Temmuz 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cortical Circuits in Health and Disease, Centro de Investigación Príncipe Felipe

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, gerçek zamanlı veya sabit materyalde hücresel çözünürlüğe sahip primer kortikal nöronlarda sitotoksik stres üzerine nöronal sağkalımı araştırmak için basit, güçlü ve çok yönlü bir metodoloji sunuyoruz.

Özet

Nöronal kayıp, inme, Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı dahil olmak üzere birçok nöropatolojinin merkezinde yer alır. Sitotoksik stres üzerine nöronal sağkalım sürecini incelemek için farklı yöntemler geliştirilmiştir. Çoğu yöntem, tek hücre çözünürlüğüne izin vermeyen veya karmaşık ve maliyetli metodolojiler içeren biyokimyasal yaklaşımlara dayanmaktadır. Burada sunulan, nöronal sağkalımı incelemek için çok yönlü, ucuz ve etkili bir deneysel paradigmadır. Bu yöntem, nöronların seyrek floresan etiketlemesinden ve ardından canlı görüntüleme ve otomatik nicelemeden yararlanır. Bu amaçla, nöronlar floresan belirteçleri eksprese etmek için elektroporasyona tabi tutulur ve hücre yoğunluğunu kolayca düzenlemek ve sağkalımı artırmak için elektroporasyonlu olmayan nöronlarla birlikte kültürlenir.

Elektroporasyon ile seyrek etiketleme, basit ve sağlam bir otomatik miktar tayini sağlar. Ek olarak, floresan etiketleme, spesifik moleküler yolları incelemek için ilgilenilen bir genin birlikte ekspresyonu ile birleştirilebilir. Burada, nörotoksik bir model olarak bir inme modeli, yani uygun fiyatlı ve sağlam bir ev yapımı hipoksik odada gerçekleştirilen oksijen-glikoz yoksunluğu (OGD) testi sunuyoruz. Son olarak, yarı otomatik veri işleme için görüntü analizi için IN Cell Analyzer 2200 veya açık kaynaklı ImageJ kullanılarak iki farklı iş akışı açıklanmaktadır. Bu iş akışı, farklı deneysel toksisite modellerine kolayca uyarlanabilir ve yüksek verimli tarama için ölçeklendirilebilir. Sonuç olarak, açıklanan protokol, canlı görüntülemede belirli genlerin ve yolakların rollerini test etmek ve yüksek verimli ilaç taraması için uygun olabilecek, ulaşılabilir, uygun fiyatlı ve etkili bir in vitro nörotoksisite modeli sağlar.

Giriş

Nöronal bozuklukların incelenmesi, genetik, moleküler ve hücresel analizlere uygun deneysel modeller gerektirir. Birincil kortikal nöronlar, nöronal sağkalım ve toksisiteyi incelemek için çok güçlü bir modeldir 1,2,3,4. Uygun koşullar altında, birincil nöronlar aşamalı olarak sinaptik temaslar geliştirecek ve olgun nöronların ayırt edici özelliklerini sunacaktır. Bu nedenle, bu model, nöronların fizyolojisini modellemede ölümsüzleştirilmiş hücre dizilerinden daha güvenilirdir ve manipülasyonlara hayvan modellerinden daha uygundur. Bununla birlikte, hücre dizileriyle karşılaştırıldığında, birincil kortikal nöronların transfekte edilmesi zordur ve nispeten kırılgandır. Ayrıca, kortikal nöronların karmaşık morfolojisi, yüksek yoğunluklu kültürlerde görüntüleme ve analizi zorlaştırabilir. Tersine, düşük yoğunluklu birincil nöronal kültürlerin analiz edilmesi daha kolaydır ancak daha kırılgan olma eğilimindedir.

Tüm bunları hesaba katan bu makale, nöronal sağkalımı modellemek ve araştırmak için uygun maliyetli, çok yönlü ve ölçeklenebilir bir in vitro iş akışı sunmaktadır (Şekil 1). Bu protokolün kilit noktaları şunlardır: i) canlı hücrelerin seyrek etiketlenmesine ve görüntülenmesine izin vermek için nöronların bir floresan işaretleyici ile in vitro elektroporasyonu yöntemi; ii) farklı sitotoksisite modellerinde çok yönlülüğü; ve iii) yarı otomatik veya otomatik analiz.

Elektroporasyon sistemi (Malzeme Tablosuna bakınız), kitleri ve özel çözeltileri içermeyen açık ve ucuz bir prosedür sağlar 4,5,6. Ayrıca, bu yöntem, elektroporasyonlu olmayan hücrelerle elektroporasyonlu olarak karıştırılarak, transfekte edilmiş nöronların optimal bir dönüşüm verimliliğini ve yoğunluğunu elde etmek için kolayca uyarlanabilir. Naif (elektroporasyonsuz) nöronlarla ko-kültür, düşük yoğunluklu kültürlere kıyasla elektroporasyonlu hücrelerin canlılığını önemli ölçüde artırır. Ayrıca, elektroporatlı nöronların ayarlanabilir yoğunluğu ile seyrek etiketlemeyi mümkün kılar ve tutarlı bir gen ekspresyonu seviyesini korur. Sağkalım deneylerinde elektroporasyonlu nöronların %3-5'ini hedeflemek önemlidir.

Seyrek etiketlemeye sahip olmak, hücrelerin iyi ayrılması ve kolayca ayırt edilebilmesi nedeniyle görüntü analizinin otomasyonunu esasen kolaylaştırır. Özellikle, bu deneysel paradigma, farklı sitozolik floresan belirteçleri (örneğin, camgöbeği floresan proteini, kırmızı floresan proteini (RFP), yeşil floresan proteini (GFP)) ile birlikte elektropore edilmiş nöronları aynı anda birlikte kültürleyerek birden fazla genin test edilmesi için uyarlanabilir. Diğer sitotoksisite deneylerine benzer şekilde (ör., propidyum iyodür veya laktat dehidrojenaz), burada açıklanan deney, nöronal ölüme hücre zarının yırtılmasının eşlik ettiği gerçeğine dayanmaktadır. Bu, sitozolik proteinlerin difüzyon yoluyla salınmasına ve sonuç olarak GFP floresan kaybına neden olur.

İnme in vitro modeli, yani OGD modeli, nörotoksisite 7,8,9'un bir örneği olarak sunulmaktadır. Bu protokol, birincil nöronların yapay bir beyin omurilik sıvısına benzer, ancak oksijen ve glikozdan yoksun bir tuz tamponuna maruz bırakılmasını gerektirir. Bu model nörotoksik strese bir örnek olarak sunulmuş olsa da, aynı iş akışı ile farklı sitotoksik koşullar test edilebilir 8,9. Son olarak, seyrek etiketleme, otomatik görüntüleme analizinin kolayca geliştirilmesini sağlar. Burada, daha küçük bir kurulumda standart immünofloresan ve ImageJ analizine dayalı bir protokol oluşturulmuştur. Daha sonra, bu iş akışı, orta ve yüksek verimli modlarda canlı görüntülemede otomatik bir analize izin veren bir hücre görüntüleme sistemi kullanılarak uyarlandı ve ölçeklendirildi. Sonuç olarak, bu makale, canlı görüntüleme ve otomatik niceleme kullanarak farklı deneysel toksisite modellerinde nöronal sağkalımı incelemek için esnek, uygun fiyatlı ve ölçeklenebilir bir metodoloji sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanların kullanıldığı tüm prosedürler, enstitünün biyoetik hayvan komitesi tarafından denetlenmeli ve yerel düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Burada sunulan prosedürler, yetkilendirilen makam tarafından onaylanmıştır ve İspanya ve Avrupa'daki düzenlemelere uygundur.

1. Birincil nöronal kültür

NOT: Tüm adımlar, steril koşulları korumak için steril malzemeler ve solüsyonlar kullanılarak kültür başlığının içinde gerçekleştirilir.

  1. Poli-L-lizin (PLL) kaplama
    1. Lamelleri (CV'ler, 15 mm) gece boyunca (o/n) bir orbital çalkalayıcıda %70 etanolde yıkayın.
      NOT: Yörünge çalkalayıcının hızı, CV'yi nazikçe hareket ettirmek için yeterli olmalı, ancak CV'lere zarar vermemek veya çizilmesini önlemek için çok hızlı olmamalıdır. Spesifik RPM, çalkalayıcının modeline bağlı olarak değişecektir. CV'ler etanolde uzun süreler (aylar) saklanabilir.
    2. Etanolü çıkarın ve her biri 10 dakika boyunca deiyonize su ile iki kez yıkayın.
    3. CV'leri 100 mm'lik bir Petri kabında (yaklaşık 13 CV / plaka) oda sıcaklığında (RT) kurumaya bırakın. CV'lerin birbirine veya plakanın kenarlarına temas etmediğinden emin olun.
      NOT: Kuru CV'ler RT'de uzun süreler (aylar) boyunca saklanabilir.
    4. 5 mg / mL PLL stok çözeltisini suda hazırlayın, alikotlar yapın ve -20 ° C'de saklayın. Stok çözeltisini 1x PBS'de 0.1 mg / mL'lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltin.
      NOT: 1 mg / mL PLL'ye kadar daha yüksek konsantrasyonlar test edilebilir.
    5. CV'lerin yüzeyini kaplamak için minimum PLL hacmini ekleyin ( Tablo 1'deki en uygun PLL hacimlerine bakın). Bir damlacık oluşumunu kolaylaştırmak için PLL çözeltisini damla damla ekleyin.
      NOT: İmmünofloresan için nöronların CV'ler üzerine kaplanması gereklidir. Hızlandırılmış görüntüleme için (örneğin, IN Hücresi için), hücreler CV'ler olmadan doğrudan kuyu üzerine kaplanır, çünkü CV'ler hızlandırılmış çekim sırasında hareket edebilir. Bu durumda, her bir kuyucuğun yüzeyini kaplamak için minimum miktarda PLL ekleyin.
YüzeyPLL hacmi (mL)
Lameller 15 mm0.2
Lameller 13 mm0.18
96 kuyulu plaka0.07
24 kuyulu plaka0.3
6 kuyulu plaka2
60 mm plaka4.5

Tablo 1: Yüzey alanına göre optimum poli-L-lizin hacimleri.

  1. 37 °C'de en az 1 saat inkübe edin.
    NOT: Kuluçka süresi o/n kadar uzun olabilir.
  2. CV'lerden PLL'yi çıkarın. CV'leri her biri 10 dakika boyunca deiyonize su ile iki kez yıkayın. CV'leri RT'de kurumaya bırakın.
    NOT: PLL çözeltisi yeniden kullanım için 4 °C'de saklanabilir (maksimum 3 kez).
  3. Kurutulmuş CV'leri bir Petri kabında 4 °C'de (7-10 güne kadar) saklayın veya kaplama ortamı ile kuyucukların içine yerleştirin ( Tablo 2'deki bileşime ve Tablo 3'teki çalışma hacimlerine bakın). Kaplama ortamını doğrudan 12 oyuklu plakaların kuyularına ekleyin (Tablo 3).
    NOT: Nöronlar, fetal sığır serumunun (FBS) kalitesine çok duyarlıdır. Hücrelerin daha sağlıklı göründüğü partiyi belirlemek için farklı FBS partileri test edilmelidir. İyi bir miktar FBS tanımlandıktan sonra, büyük miktarda elde edilmesi ve -80 ° C'de saklanması önerilir. Bu protokol diğer CV ve plaka türleri için uyarlanabilir ( Tablo 3'teki farklı çalışma hacimlerine bakınız).
Kaplama Ortamı
MEM42.5Ml
% 10 At serumu veya FBS*5Ml
%30 glikoz (%0,6 nihai konsantrasyon)1Ml
PS (penisilin, 10000 U/mL; streptomisin, 10 mg/mL);0.5Ml
Elektroporasyon ortamı
Opti-MEM
Nöronal Ortam
Nörobazal ortam48.5Ml
B-27 Uzay Aracı1Ml
Glutamax 200 mM0.125Ml
PS (penisilin, 10000 U/mL; streptomisin, 10 mg/mL);0.5Ml
OGD Orta (Tasca, et al. 2014)
CaCl21Mm
Kartal5Mm
NaCl (Doğal)137Mm
KH2PO40.4Mm
Na2HPO40.3Mm
MgCl20.5Mm
MgSO40.4Mm
HEPES ÜNİVERSİTESİ25Mm
NaHCO34Mm

Tablo 2: Kullanılan farklı ortamların bileşimi.

Kuyu ve plakaların yüzey alanıÇalışma Hacmi
96 kuyulu plaka0.32cm20.1Ml
24 kuyulu plaka1.9cm20.5Ml
12 oyuklu plaka3.8cm21Ml
6 kuyulu plaka9.5cm22.5Ml
60 mm plaka21.5cm26Ml

Tablo 3: Farklı tipteki plakaların yüzey alanı ve çalışma hacimleri.

  1. Nöronal kültürün hazırlanması
    1. Kaplama ortamını, nöronal ortamı ve elektroporasyon ortamını (Tablo 2'deki bileşime bakınız) hücre inkübatörünün içinde kısmen açılmış bir şişede en az 2 saat önceden ısıtın (37 ° C) ve dengeleyin (% 5 CO2 atmosferinde). 1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini (HBSS) bir su banyosunda 37 °C'de önceden ısıtın.
    2. Elektroporasyon parametrelerini önceden ayarlayın (Tablo 4).
ELEKTROPORASYON KOŞULLARI: Gözenek Nabzı
UzunlukVAraND. OranPo -larite
2 ms17550210artı
ELEKTROPORASYON KOŞULLARI: Transfer Nabzı
UzunlukVAraND. OranPo -larite
502050540artı/eksi

Tablo 4: NEPA21 için elektroporasyon ayarları.

  1. Beyin diseksiyonu ve E15 post-koitumda CD-1 fare embryolarının çıkarılması
    1. Hamile kadını sedasyon olmadan servikal çıkık ile sakit edin. Göbeği% 70 etanol ile sterilize edin; Karnı keskin bir makasla kesin ve açın.
    2. Uterusu çıkarın ve soğuk 1x HBSS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Ortak forseps ile hücre kültürü başlığının içinde buzun üzerinde bırakın.
    3. Forseps ve makas yardımıyla rahimden bir embriyo çıkarın ve makas kullanarak tek bir kesi ile başını çıkarın.
    4. Başı tutun ve forsepsleri (örneğin, Dumont ince forseps) göz yörüngesine yerleştirin.
    5. İğneyi (30 G iğne şırıngası) bıçak olarak kullanarak, bregmayı kesin ve başın arka kısmını kırın.
    6. Kesiden dikey olarak bregmaya keskin forseps sokun ve ön bölgenin ince deri tabakasını kırın. Kortekse zarar vermeden iki yarım küre arasındaki uzunlamasına çatlağı takip etmek için forsepsi çekin.
    7. Beyni kafadan çıkarmak için küçük forsepsleri ön kısımdan arka kısma doğru 45°'lik bir açıyla kullanın.
    8. Beyni stereomikroskop altında buz gibi 1x HBSS ile 3,5 cm'lik bir Petri kabına taşıyın.
  2. Kortekslerin diseksiyonu
    NOT: Nöronal kültür protokolü, Dotti ve Banker10 tarafından tarif edilen prosedürden uyarlanmıştır.
    1. Talamusu tutmak için Dumont forsepslerini (11 cm) ve her yarım kürenin korteksini orta beyinden ayırmak için 45 ° açıyla eğilmiş bir iğne kullanın. Korteksin diğer dokuların izlerini göstermediğinden emin olun; Meninksleri çıkarmak için keskin forseps kullanın.
      NOT: Meninksler beyni saran ince elastik bir zar oluşturur ve kırmızı renklerinden dolayı kolayca tanınırlar. Zikzak şeklinde yumuşak hareketler yapmak meninkslerin giderilmesine yardımcı olacaktır. Kültür için toksik oldukları için tüm meninkslerin çıkarıldığından emin olun.
    2. Temiz korteksi buz gibi 1x HBSS içeren 3,5 cm'lik temiz bir Petri kabına taşıyın ve buzun üzerine yerleştirin.
  3. Ayrıştırma
    1. Her korteksi ikiye bölün ve bir sonraki adımda tripsinin etkisini kolaylaştırmak için forseps veya keskin bir iğne (30 G) kullanın.
    2. Parçaları, bir P1000 pipeti kullanarak (ucun 3-4 mm'sini kesin) 15 mL'lik bir tüpte oda sıcaklığında 7 mL tripsin-EDTA tamponuna aktarın. Pipet ucundan serbest bırakmadan önce ucun dibine batmalarını bekleyin. Eğerek karıştırın.
    3. 37 °C'de 12 dakika su banyosunda inkübe edin. Her 4-5 dakikada bir eğerek karıştırın.
      NOT: Kuluçka süresi 12 ila 15 dakika arasında değişebilir.
    4. Dokunun yerçekimi ile batmasına izin verin ve tripsini dikkatlice çıkarın. Dokuyu 8 mL 1x HBSS ile iki kez yıkayın ve eğerek hafifçe çalkalayın. 1x HBSS'yi bir P1000 pipeti kullanarak, ancak kesilmemiş bir pipet ucu kullanarak dikkatli bir şekilde çıkarın.
    5. Dokuyu 5 mL kaplama ortamı ile bir kez yıkayın. Eğerek çalkalayın. Bir P1000 pipeti kullanarak kaplama ortamını dikkatlice çıkarın.
    6. 1,5 mL kaplama ortamı ekleyin. Ortamı tüpün altından aspire ederek ve maksimum 8-12 kez duvarların üzerinden nazikçe serbest bırakarak bir P1000 pipet kullanarak karışımı mekanik olarak ayırın.
    7. 50 mL'lik bir tüp üzerine yerleştirilmiş steril bir hücre süzgecinden (70 μm) süzün. Tüpe 10 mL veya istenen başka bir hacimde kaplama ortamı ekleyin.
    8. Hücre sayma odasına 5 μL hücre süspansiyonu ekleyin, 5 μL tripan mavisi (a/h% 0.4) ekleyin ve hücreleri sayın.
    9. Hücreleri plakalayın (bkz. bölüm 1.6), 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde elektroporasyon için istenen sayıda hücreye (örneğin, 106 hücre) sahip olmak için yeterli miktarda hücre süspansiyonu aktararak. Hücreleri 250 × g'da 5 dakika santrifüj edin. Bölüm 1.6'ya ilerleyin.
  4. Kaplama hücreleri
    1. Kaplama ortamını içeren her bir oyukta adım 1.5.7'den itibaren santrifüjlenmemiş hücre süspansiyonunun istenen yoğunluğunu plakalayın.
      NOT: Bu protokolde, 12 oyuklu bir plakaya 100.000 ila 200.000 hücre / kuyu ekildi. Referans olarak, deneysel değişkenliği hesaba katmak için deneysel koşul başına en az 3 CV plakalayın. Tipik bir deneysel ortam, CV başına 4-5 alanın görüntülenmesini gerektirebilir (örneğin, 20x'lik bir objektif kullanarak, her alanın ~ 1,3 mm2 genişliğinde olması beklenir).
    2. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı hücre kültürü başlığındaki tüm ana yönlerde hareket ettirin.
  5. Elektroporasyon
    NOT: Diğer transfeksiyon sistemleri kullanılabilir. Bu protokolde kullanılan NEPA21 sistemi "açık sistem" olma avantajına sahiptir. Protokol kullanıcı tarafından değiştirilebilir ve elektroporasyon için kullanılan özel küvetlerin transfeksiyonu için özel reaktifler gerektirmez. Bu protokol 5'ten değiştirildi.
    1. Adım 1.5.9'dan devam edin. Hücre peletini 15 mL'lik bir tüpte 5 mL elektroporasyon ortamı ile yeniden süspanse edin. Tüpü 250 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    2. Adım 1.7.1'i tekrarlayın. Elektroporasyon küvetlerinin her birinde 106 hücre / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için elektroporasyon ortamı ile yeniden süspansiyon edin. Hücreleri küvette istenen miktarda DNA ile karıştırın.
      NOT: GFP ekspresyonu için, milyon hücre başına 3 μg plazmit kullanılmıştır. Yüksek değişkenlik nedeniyle, her plazmit için optimal konsantrasyonun test edilmesi önerilir. Milyon hücre başına 2 ila 24 μg arasında plazmit test edilmiştir. Çeşitli plazmitler, bir çift transfeksiyon gerçekleştirmek için aynı küvette birleştirilebilir. Ko-transfeksiyon durumunda, çoğu GFP eksprese eden hücrenin ilgilenilen geni birlikte eksprese etmesini sağlamak için ilgilenilen geni GFP'ye kıyasla fazla transfekte edin (örneğin, 3: 1 test edilmesi gereken optimal bir orandır).
    3. Küveti küvet haznesine yerleştirin (Şekil 2). Önceden ayarlanmış programı yürütmek için Başlat düğmesine basın ( Tablo 4'teki elektroporasyon koşullarına bakın). Ölçümler çerçevesinde görüntülenen akım ve joule değerlerini kaydedin.
      NOT: Kullanıcı belirli koşulları değiştirebilir. Örneğin, voltajın düşürülmesi transfeksiyonun verimliliğini azaltabilir, ancak nöronal sağkalımı artırabilir.
    4. Küveti hazneden çıkarın. Elektroporasyondan hemen sonra küvete 500 μL kaplama ortamı ekleyin ve numuneyi küvetten bir pipet kullanarak 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
      NOT: Ortam ilavesi ne kadar hızlı olursa, hücre hasarını önlemeye yardımcı olduğu için elektroporasyondan sonra hayatta kalma o kadar iyi olur.
    5. Her kuyucuğunda istenen sayıda elektroporasyonlu hücre plakalayın.
      NOT: 12 oyuklu bir plakada 20.000 ila 100.000 hücre arasında plaka. Koşullara bağlı olarak, elektroporasyonlu hücrelerin sadece% 5-10'u hayatta kalabilir. Kesin sayı kullanıcı tarafından test edilmeli ve uyarlanmalıdır.
    6. Standart koşullarda (37 °C,% 5 CO2, doymuş nem) 2-4 saat inkübe edin.
      NOT: Kuluçka döneminden sonra hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Kültür sağlıklıysa, çoğu hücre yüzeye yapışmış ve görünür nörit uzantılarını filizlendirmeye başlamış olacaktır.
    7. Kaplama ortamını nöronal ortama değiştirin (sırasıyla Tablo 1 ve Tablo 2'deki hacimler ve bileşim).
  6. Hücrelerin bakımı
    1. Ortamı yenilemek için, ortamın yarısını çıkarın ve 7 günlük kültürden sonra eşit hacimde taze önceden dengelenmiş ortam ekleyin.
    2. Kültürün 10. gününde, hacmin yarısını glutamin takviyesi olmadan taze nöronal ortamla değiştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Bu adımı 10. günden sonra her gün tekrarlayın.
      NOT: 10 günlük kültürden sonra hücreler kendi kendine glutamat üretir.

2. Hipoksik odanın inşası

  1. Bu amaçla vidalı kapaklı herhangi bir hermetik kap veya eşdeğer bir sızdırmazlık sistemi kullanın (Şekil 3A). Plastik kabın duvarına iki delik açın ve her birine plastik bir tüp yerleştirin. Kabın hava geçirmez şekilde kapatılması için bunları silikonla kapatın (Şekil 3).
    NOT: Burada, hazneyi inşa etmek için vidalı kapaklı silindirik plastik bir kap (1 litre boyutunda) kullanılmıştır. Konteynerin, deney için gereken CV'leri barındıracak kadar büyük olduğundan emin olun. Aynı alanda daha fazla CV'yi tedavi etmek için plastik platformlar üst üste istiflenebilir (Şekil 3A).
  2. Köpürme haznesini hazırlamak için (bkz. 3.2), tüpten biraz daha küçük bir matkapla herhangi bir standart mekanik matkap kullanarak bir şişenin kapağına bir delik açın ve delikten şişeye plastik bir tüp sokun. Hermetik sızdırmazlığı korumak için deliği parafilm ile kapatın (Şekil 3B).
  3. Kabı ve şişeyi %70 etanol ile sterilize edin ve kullanmadan önce bir döngü boyunca ultraviyole ışıkla ışınlayın.

3. Oksijen-glikoz yoksunluğu (OGD)

NOT: OGD protokolü Tasca ve ark.7'den uyarlanmıştır.

  1. OGD çözeltisini daha önce antibiyotiklerle takviye edilmiş fosfat çözeltisi (Tablo 2) ile hazırlayın.
    NOT: Her 35 mm'lik plaka için 5 mL kullanın; 100 mm'lik bir plaka için 10 mL kullanın.
  2. OGD çözeltisini köpürme haznesinin içine ekleyin (Şekil 3B) ve bir su banyosunun içine yerleştirin (zaten 37 °C'de önceden ısıtılmış). Şişeyi nitrojen kaynağına bağlayın (N2, %100).
    NOT: OGD çözeltisi tampon olarak HEPES içerdiğinden, CO2 gerektirmediğini lütfen unutmayın. OGD çözeltisi bir bikarbonat tamponlama sistemine dayanıyorsa, hipoksik çözeltiyi ve hazneyi doyurmak için %5 CO2 ve% 95N2 kullanın.
  3. OGD çözeltisini hafifçe köpüren nitrojenle doyurun. Çözeltiyi 20-30 dakika hafif köpüren bir durumda bırakın.
  4. Şişeyi hemen hücre kültürü başlığına aktarın ve 35 mm'lik plakalara oksijensiz 5 mL OGD çözeltisi veya 100 mm'lik kültür plakalarına 10 mL ekleyin.
  5. Kültürlenmiş hücrelerin bulunduğu CV'leri OGD ile plakalara taşıyın. Plakaları örtmeden, hipoksi odasına taşıyın ve sıkıca ama dikkatli bir şekilde kapatın.
    NOT: Adım 3.4 ve 3.5 mümkün olan en kısa sürede tamamlanmalıdır. Kontrol CV'lerini (normokside Nöronal Ortam) inkübatörün içindeki kuyu plakalarında tutun. Alternatif olarak, hipoksi ve glikoz yoksunluğunun etkilerini daha seçici bir şekilde incelemek için kontrol nöronlarını glikoz (10 mM) ile takviye edilmiş normoksik OGD ortamına maruz bırakın.
  6. Nitrojen sistemini hipoksi odasına bağlayın ve tüplerin açık olduğunu kontrol edin. Hazneyi N2 ile 2-3 bar basınçta birkaç dakika doyurun (örneğin, 2-3 dakika; 1 bar = 750 mmHg) (Şekil 3C).
    NOT: OGD solüsyonunu birden fazla zaman noktası arasında 15 dakika boyunca tekrar köpürtmeyi unutmayın.
  7. Azot basıncını 1.3-1.5 bar'a düşürün ve hipoksi odasının her iki tüpünü de kapatın (Şekil 3C). Hazneyi inkübatörde gereken süre boyunca (örn. 60 dakika) 37 °C'de,% 5 CO2'de bırakın.
    NOT: OGD süresi, deney durumuna ve araştırma hedeflerine bağlı olarak ayarlama gerektirebilir. Kısa bir inkübasyon süresi (örneğin, 30 dakika) hafif hipoksiyi simüle eder. İki saatlik OGD genellikle nöronlara karşı çok serttir. Çalışmaya başlamadan önce 45 ila 90 dakikalık bir OGD süresinin test edilmesi önerilir. Tabii ki, OGD'nin süresi, OGD'den iyileşmeden sonra toplam sağkalımı ve nöronal ölümün göreceli başlangıcını etkileyecektir. Amaç nöronal ölümü gerçek zamanlı olarak analiz etmekse, daha etkili bir analiz için OGD'den iyileşmeden birkaç saat sonra hücre ölümüne neden olacak OGD koşullarına ulaşmayı hedefleyin.
  8. Hazneyi açın ve CV'leri kurtarma için orijinal çok kuyulu plakalarına taşıyın. Bu adımdan sonra iki alternatifi göz önünde bulundurun: 1) küçük ölçekli deneyler için, immünofloresan ve görüntü analizi için bölüm 4'e geçin; 2) Yüksek içerikli tarama için, hücre analizöründe (veya eşdeğer platformda) analiz için bölüm 5'e geçin.
    NOT: Canlı görüntüleme, farklı deney noktalarının gerçek zamanlı olarak izlenmesine izin verdiği için daha esnek bir yaklaşım sağlar.

4. Standart immünofloresan ve ImageJ ile analiz

NOT: Kurtarma süresi, koşullara bağlı olarak 1 ila 24 saat arasında değişebilir.

  1. Nöronları 1x PBS ile 10 dakika boyunca yıkayın.
    NOT: Görüntüleri ilerletmenin ve analiz etmenin birkaç yolu olduğundan bu adım isteğe bağlıdır.
  2. Nöronları RT'de 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Her yıkamada 10 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın.
    NOT: Paraformaldehit toksik olduğundan, kimyasal bir başlık altında çalışın.
  3. 10 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 içeren 1x PBS ekleyerek nöronları geçirgen hale getirin. Hücreleri 1x PBS ile hızlı bir şekilde yıkayın. Yıkama adımını her yıkamada 10 dakika boyunca iki kez tekrarlayın.
  4. CV'lere 350 μL bloke edici solüsyon (% 2 sığır serum albümini içeren 1x PBS) ekleyin ve en az 30 dakika bekletin. Birincil antikor (AB) stoğunu (30 saniye boyunca 5 × g ) döndürün ve gerekli seyreltmede bloke edici çözelti ile karıştırın, ör., 1:600'de anti-GFP.
    1. Lamelleri nemlendirilmiş bir odada (nemi korumak ve buharlaşmayı önlemek için suya batırılmış mendil içeren bir kutu) parafilme aktarın. CV'lerin boyutuna bağlı olarak, her CV'ye dikkatlice 60 veya 80 μL primer antikor seyreltmesi ekleyin ve hücrelerin antikorla temas halinde olduğundan emin olun. CV'leri o/n'yi 4 °C'de inkübe edin.
      NOT: CV yüzeyinin tamamını kaplayacak şekilde CV yüzeyinde bir damlacık oluşturulmalıdır. Antikor solüsyonunu CV'lere pipetlerken hücreleri rahatsız etmekten kaçının. İnkübasyon süresi RT'de 2 saate düşürülebilir.
  5. CV'leri 1x PBS ile parafilm üzerinde 10 dakika boyunca yıkayın. Yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
  6. İkincil AB'yi, örneğin Alexa 488 (1:500) ve 4 ",6-diamidino-2-fenilindolü (DAPI, 1: 2.000) bloke edici çözelti içinde seyreltin. CV'lerin boyutuna bağlı olarak, hücrelere 60-80 μL'lik bir ikincil AB çözeltisi damlası ekleyin. CV'leri RT'de karanlıkta 1 saat inkübe edin. İkincil AB ve DAPI'yi nöronlardan 1x PBS ile 10 dakika boyunca yıkayın ve bu adımı iki kez tekrarlayın.
  7. CV'leri immünofloresan analizi için montaj ortamına ( Malzeme Tablosuna bakın) monte edin ve kuruduktan sonra karanlıkta 4 °C'de saklayın.
  8. Görüntü yakalama ve analizi.
    NOT: Görüntüleri 20x'te çekmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanıldı (Şekil 4A, Malzeme Tablosuna bakınız).
    1. Görüntüleri analiz etmek ve GFP kanalı için maskeyi elde etmek için açık kaynaklı ImageJ yazılımını kullanın (Şekil 4C).
      NOT: Ekipman kullanılabilirliğine ve deneysel formata bağlı olarak nöronları görüntülemenin ve analiz etmenin birkaç yolu vardır. Aşağıdaki iş akışı, amacın görüntüde bulunan bireysel GFP eksprese eden nöronların soma'sını tanımlamak olduğu temel bir örnek olarak sağlanmıştır. Eşik değer ve partikül boyutu gibi burada sunulan spesifik değerler, kullanıcı tarafından kendi özel deney koşullarına göre test edilmelidir. Ek olarak, farklı filtreler ve işleme adımları eklenebilir. Örneğin, ImageJ filtreleri Arka Planı Çıkar ve Benek Kaldır genellikle işlemenin başında görüntünün temizlenmesine yardımcı olur. Belirli deneysel koşullar için iş akışının optimizasyonu, görüntü analizinde önceki deneyimi ve nicel görüntü analizinin temel kavramlarının bilgisini gerektirir. Görüntü analizine ilişkin ayrıntılı bir kılavuz mevcut protokolün kapsamı dışında olduğundan, aşağıdaki kaynakları öneririz: ImageJ kullanıcı kılavuzu, https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/; Örnekler ve öğreticiler için https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.htm; MBF ImageJ paketi, https://imagej.net/mbf/index.htm.
    2. Segmentasyon için, nöronların en parlak bölgesi olan somayı izole etmek için gerekli parametrelerle Yoğunluk segmentasyonunu seçin.: Menü | Görüntü | Ayarla | Eşik | Minimum eşiği ayarlayın (ör. 100) | Uygula'ya tıklayın.
    3. Eşiği 4.8.2'den tekrarlayın. nöronların somaları için maskeyi (yani segmentli görüntüyü) görmek için tüm görüntülere (Şekil 4E).
    4. Her görüntüde kalan hücrelerin sayısını elde etmek ve sonuçları hesaplamalar yapmak üzere bir elektronik tabloya aktarmak için Menü | Analiz Edin | Parçacıkları analiz edin ve gerekli parametre değerlerini girin (örneğin, Boyut: 50 sonsuz piksel; Dairesellik: 0.5-1.00). T = 0 h'de, sayılan hücre sayısının tanımlanan toplam hücre sayısı olduğunu düşünün ve farklı zaman noktalarında hayatta kalan hücrelerin yüzdesini hesaplayın.
      NOT: Somadan daha küçük nesneleri filtrelemek için daha düşük bir boyut eşiği kullanışlıdır (örneğin, 60-80 μm2).
    5. Analizi otomatikleştirmek ve tekrarlamak için ImageJ'nin Makro Kaydet işlevini kullanın: Menü | Eklentiler | Makrolar | Kayıt | Makroyu oluşturmak için Oluştur'a tıklayın .

5. IN Cell Analyzer 2200 ile gerçek zamanlı analiz

  1. 12 oyuklu plakayı hücre analizörüne yerleştirin, CO2 sistemini bağlayın ve sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın.
    NOT: Bu adım, 96 oyuklu bir plakada kaplanmış nöronlarda benzer bir deney gerçekleştirerek bu platformda kolayca ölçeklendirilebilir.
  2. 20x hedefini seçin, kuyu başına rastgele 5 alan seçin (bu örnekte kuyunun %2,33'ünü kaplar) ve bunları her floresan kanalı için otomatik olarak odaklayın (bu durumda floresein izotiyosiyanat [FITC]). Alım parametrelerini seçin (16 saat boyunca 30 dakika hızlandırılmış). Başlat'a basın ve bekleyin.
    NOT: Görüntüleme alanlarının sayısı araştırmacı tarafından belirlenmeli ve tek bir kuyu içindeki değişkenliği hesaba katmak için yeterli olmalıdır.
  3. Analiz için uygun iş akışını ayarlamak için IN Cell Developertoolbox v1.9'u kullanın.
  4. Nöronların soma'sı için bir maske oluşturmak için nöron görüntülerini (FITC kanalı) analiz edin (Şekil 4).
    NOT: Amaç, görüntüde bulunan bireysel nöronların soma'sını tanımlamaktır. Bu analiz, ImageJ için bölüm 4'te açıklananlara eşdeğer adımları izler. İş akışı ve genel hususlar için lütfen bölüm 4'e bakın. Yoğunluk eşiği, nöronların en parlak bölgesi olan somayı seçmek için belirlenir.
    1. Segmentasyon için, gerekli parametrelerle Yoğunluk segmentasyonunu seçin (bu durumda, minimum 20005.40 eşiği).
    2. İşlem sonrası için, hedefleri önceden belirlenmiş bir değerden daha büyük bir alana sahip tutarak Elek seçeneğini seçin (burada, 189 piksel (~80 μm2)).
    3. Maskede tanımlanan tüm nöronları (hayatta kalan nöronlar) ve her alan için ve zaman seyrinin her zaman noktasında bir kuyunun tüm alanları için saymak ve toplamak için Sum parametresini seçin.
    4. Sonuçları bir e-tabloya aktarın. t = 0 h'de, sayılan hücre sayısının tanımlanan toplam hücreler olduğunu düşünün ve farklı zaman noktalarında hayatta kalan hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Koşullar arasındaki karşılaştırmayı kolaylaştırmak için hücrelerin %50'sinin öldüğü süreyi hesaplayın.
      NOT: Segmentasyon ve son işlem adımları için parametreler, tanımlanacak yapılara bağlı olarak farklı floresan kanalları için kullanıcı tarafından ayarlanmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol inme için in vitro bir model oluşturmayı amaçlamaktadır. Bireysel elektropore nöronların tanınmasına izin verecek yeterli bir nöronal yoğunluk elde etmek önemlidir. Kaplamadan sonraki nöronal kültürün aşaması da çok önemlidir. Kültürdeki nöronların olgunlaşması ilerleyicidir. Büyüme faktörlerine, nörit büyümesine, bağlanabilirliğe ve elektrofizyolojik aktiviteye bağımlılık, aşamaya bağlı olarak büyük ölçüde değişecektir. 4-6 günlük bu spesifik koşullarda in vitro, nöritler iyi uzamış olmasın...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, in vitro bir inme modellemenin etkili bir yolunu gösterir. Bu amaca ulaşmak için, elektroporasyon sistemi NEPA215 kullanarak kortikal nöronların seyrek etiketlenmesini önerdik. Bu, kitleri veya belirli cihazları kullanan diğer sistemlere kıyasla protokolün minimum işletme maliyetiyle özelleştirilmesine izin veren açık bir sistemdir. Naif ve elektroporatlı nöronların karışık kültürü, düşük yoğunluklu nöronal kültüre kıyasla daha fazla esneklik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Carlos Dotti'ye nöronal kültür konusundaki uzmanlığını paylaştığı için teşekkür ederiz. Ayrıca, Avrupa FEDERER fonu tarafından desteklenen Centro de Investigación Principe Felipe'nin (CIPF) Cytomics Core Facility'sinden Alicia Martínez-Romero'ya da teşekkür ederiz. Proje, İspanya Ekonomi ve Rekabet Edebilirlik Bakanlığı tarafından (SAF2017-89020-R) reaktifler, malzemeler ve YDC ve PF maaşları için desteklenmektedir. PF ayrıca RyC-2014-16410 hibesi ile de desteklenmektedir. CGN ve PF, Generalitat Valenciana'dan Conselleria de Sanitat ve AGM (ACIF/2019/015) tarafından desteklenmektedir. Ángela Rodríguez Prieto, İspanya Bilim, Yenilik ve Üniversiteler Bakanlığı tarafından PRE2018-083562 hibesi ile desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10 cm petri kaplarıFISHER SCIENTIFIC, S.L.1130-9283
3,5 cm petri kaplarıSterilin
75 cm2 şişesiCorning430641U
B-27Yaşam Teknolojileri17504-044
Hücre kültürü plakalarıCorning kuruluşu Costar®3513
Hücre inkübatörüThermo Electron CorporationModel 371
Hücre süzgeci 70 ve mikro; mFalcon352350
Soğuk ışıklarSchott223488KL 1500 LCD
Lameller (15 mm)Marienfeld111530
CU500 Küvet OdasıNepa Gene
CU600 Küvet Stand TutucuNepa Gene
DAPISigma-Aldrich Quimica, SLD9542-10MG1:2000
DMSOPanreacA3672
Dumont İnce ForsepsFST11254-20
Dumont İnce ForsepsFST11252-00
EC-002S NEPA Elektroporasyon Küvetleri, 2 mm boşlukNepa Gen Filtresi
süzgeciFalcon352350
İnce Makas-Keskin-KörFST14028-10
İnce Makas-ToughCut rFST14058-09
GFP tavuk IgYAves LabsGFP-10101:600
GlikozSigma68769-100ml
GlutaMAX-I Takviyesi 200 mM 100 mLFisher Scientific35050-061
HBSSThermofisher14175-095https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html
Hepes 1 MThermoFisher15630-080
At Serumuİnvitrojen26050088
MEMThermofisher11095080https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080
Mikroskop lamı (polilizin)VWR631-0107Boyut: 25 x 75 x 1 mm
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich Quimica, Sl81381-250G
İğneler sarı, 30 gaugeBD Microlance ve ticaret; 3304000
NEPA21 elektroporatörNepa Gene
Neubauer odasıBlau Marka717805
Nörobazal OrtaThermoFisher21103-49
Opti-MEMInvitrogen31985-062
ParafilmCole-ParmerPM996
Paraformaldehit (PFA),% 95Sigma-Aldrich Quimica, SL158127-500GKullanım çözümü: %4
PEIPolysciences23966-1
Fazzari ve diğerleri, Nature, 2010için Plazmid
(Penisilin, Streptomisin)ThermoFisher15140122
StereomikroskopDÜNYA HASSASİYET CİHAZLARI
ŞırıngalarBD Plastipak 1ml303176
Triton X-100Sigma-Aldrich Quimica, S. L.MDL numarası: MFCD00128254Noniyonik
Tripsin-EDTAThermoFisher25300054
Tüpler 15 mLFisher05-539-4
Tüpler 50 mLVWR21008-242
Tupperware-Vidalı kapaklı hermetik tupperware. SP Berner - Koniklik 1 L Redondo con Rosca. Herhangi bir eşdeğer hermetik Tupperware herhangi bir süpermarkette satın alınabilir.
Su banyosuSHELDON LABORATUVAR MODEL 12241641951
Poly-L-Lysine SIGMA P2636 PS'de açıklanan GFP pCMV-GFP-ires-Cre Tırtıklı forseps FST 11152-10

Kaynaklar

  1. Salazar, I. L., Mele, M., Caldeira, M., Costa, R. O., Correia, B., Frisari, S., Duarte, C. B. Preparation of primary cultures of embryonic rat hippocampal and cerebrocortical neurons. Bio-protocol. 7 (18), 2551(2017).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  3. Fazzari, P., et al. Cell autonomous regulation of hippocampal circuitry via Aph1b-γ-secretase/neuregulin 1 signalling. eLife. 3, 02196(2014).
  4. Navarro-González, C., Huerga-Gómez, A., Fazzari, P. Nrg1 intracellular signaling is neuroprotective upon stroke. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 3930186(2019).
  5. NEPA21 transfection of cell suspensions using cuvettes. NEPAGENE Co. Ldt. , Available from: http://2017.igem.org/wiki/images/3/3a/T--TECHNION-ISRAEL--Electroporation-NEPA2_for_HPC-7.pdf (2017).
  6. Larson, M. A., Gibson, K. A., Vivian, J. L. In vivo validation of CRISPR reagents in preimplantation mouse embryos. Methods in Molecular Biology. 2066, 47-57 (2020).
  7. Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods in Molecular Biology. 1254, 197-210 (2015).
  8. Holloway, P. M., Gavins, F. N. E. Modeling ischemic stroke in vitro: the status quo and future perspectives. Physiology and Behavior. 47 (2), 561-569 (2016).
  9. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
  10. Dotti, C. G., Banker, G. A. Experimentally induced alteration in the polarity of developing neurons. Nature. 330 (6145), 254-256 (1987).
  11. Fazzari, P., et al. Control of cortical GABA circuitry development by Nrg1 and ErbB4 signalling. Nature. 464 (7293), 1376-1380 (2010).
  12. Sadiq, A. A., et al. An overview: Investigation of electroporation and sonoporation techniques. 2015 2nd International Conference on Biomedical Engineering. , 1-6 (2015).
  13. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  14. Fazzari, P., Mortimer, N., Yabut, O., Vogt, D., Pla, R. Cortical distribution of GABAergic interneurons is determined by migration time and brain size. Development. 147 (14), 185033(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tek H cre z n rlGer ek Zamanl G r nt lemeFloresan aretlemeElektroporasyonOksijen Glikoz Yoksunlu uHipoksik OdaOtomatik Nicelle tirmeY ksek Kapasiteli Tarama
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.