Yöntem makalesi

Konak Hücrelere Bakteriyel Yapışmanın Otomatik, Yüksek Verimli Tespiti

DOI:

10.3791/62764

⸱

17 Eylül 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otomatik istatistiksel analiz yöntemleri ile birlikte yüksek verimli floresan etiketleme görüntüleme kullanılarak fenotipik yapışma esas alınarak konak-bakteriyel patojen etkileşimlerinin tespiti, konak hücrelerle potansiyel bakteriyel etkileşimlerin hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ortaya çıkan bakteriyel patojenlerin tanımlanması insan sağlığı ve güvenliği için kritik öneme sahiptir. Konak hücrelere bakteriyel yapışmak bakteriyel enfeksiyonlarda önemli bir adımdır ve potansiyel tehdidin ayırt edici bir özelliğidir. Bu nedenle, bakterilerin konak hücrelere yapışmasını incelemek bakteri tehdidi değerlendirmesinin bir bileşeni olarak kullanılabilir. Konak hücrelere bakteri yapışmasını numaralandırmak için standart bir yöntem, bakterileri konak hücrelerle birlikte kuluçkaya yatırmak, yapışık bakterileri hasat etmek, hasat edilen hücreleri katı ortamda kaplamak ve ardından elde edilen koloni oluşturan birimleri (CFU) saymaktır. Alternatif olarak, konak hücrelere bakteriyel yapışma immünoforezans mikroskopi tabanlı yaklaşımlar kullanılarak değerlendirilebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımları uygulamak için geleneksel stratejiler zaman alıcı ve verimsizdir. Burada yakın zamanda geliştirilen otomatik floresan mikroskopi tabanlı görüntüleme yöntemi açıklanmıştır. Yüksek verimli görüntü işleme ve istatistiksel analiz ile birleştirildiğinde, yöntem konak hücrelere yapışan bakterilerin hızlı bir şekilde ölçülmesini sağlar. Protokolü göstermek için gram negatif Pseudomonas aeruginosa ve Gram-pozitif Listeria monocytogenes ve buna karşılık gelen negatif kontroller olmak üzere iki bakteri türü test edildi. Sonuçlar, bu yaklaşımın yapışan bakterileri hızlı ve doğru bir şekilde numaralandırmasını ve deneysel iş yüklerini ve zaman çizelgelerini önemli ölçüde azalttığını göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel yapışma, bakterilerin diğer hücrelere veya yüzeylere bağlandığı bir işlemdir. Bakteriyel patojenler tarafından enfeksiyonun başarılı bir şekilde kurulması, konak hücrelere yapışıklık, dokuların kolonizasyonu ve bazı durumlarda konak hücrelerin istilası1,2,3gerektirir. Ortaya çıkan bulaşıcı hastalıklar, son COVID-19 pandemisi4,5,6tarafından kanıtlanan büyük halk sağlığı tehditleri oluşturmaktadır. Daha da önemlisi, yeni veya gelişmekte olan patojenler genomik tabanlı yaklaşımlar kullanılarak kolayca ayırt edilemeyebilir, özellikle patojenin tespit edilmekten kaçınmak için tasarlandığı veya patojenik olarak tanımlayan genomik imzalar içermediği durumlarda. Bu nedenle, konak hücrelere bakteriyel yapışım gibi patojenliğin ayırt edici özelliklerini doğrudan değerlendiren yöntemler kullanılarak potansiyel patojenlerin tanımlanması patojen tanımlamasında kritik bir rol oynayabilir.

Konak hücrelere bakteriyel yapışma, onlarca yıldır bakteriyel patogenez mekanizmalarını değerlendirmek için kullanılmıştır1,7. Mikroskobik görüntüleme8,9 ve bakteriyel koloni oluşturan ünitenin (CFU) 10 ,11,12,13 enfeksiyon sonrası kaplama ile numaralandırılması, konak hücrelerin mikrobiyal yapışma ve/veya enfeksiyonunu test etmek için iyi geliştirilmiş iki laboratuvar yöntemidir14. Bakteri hücrelerinin mikrometre ölçek büyüklüğü göz önüne alındığında, yapışık bakteri hücrelerinin numaralandırılması genellikle gelişmiş yüksek büyütme mikroskopi tekniklerinin yanı sıra elektron mikroskopisi, genleşme mikroskopisi (ExM)15,16ve üç boyutlu görüntüleme dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımlarının kullanılmasını gerektirir17 . Alternatif olarak, konak hücrelere bağlı veya içselleştirilmiş bakterilerin numaralandırması, hasat edilen bakterilerin seyreltme serisini katı agar üzerine kaplayarak ve sonuçta elde edilen CFO'lar10 , 12,13sayarak gerçekleştirilebilir. Bu yöntem zahmetlidir ve yüksek verimli analizler için gerekli standartlaştırılmış veya otomatik bir prosedür oluşturmada zorluklar getiren birçok manuel adım içerir18,19. Bu nedenle, konak hücre ekini değerlendirmek için yeni yöntemlerin geliştirilmesi alandaki geçerli sınırlamaları giderir.

Burada, yüksek verimli görüntü işleme ve istatistiksel analiz ile birlikte otomatik yüksek verimli mikroskopi kullanan bu tür bir yöntem açıklanmıştır. Yaklaşımı göstermek için, pseudomonas aeruginosada dahil olmak üzere çeşitli bakteriyel patojenlerle deneyler yapıldı, insanların, hayvanların ve bitkilerin fırsatçı bir Gram-negatif bakteriyel patojeni14,20, sık sık konak savunma fonksiyonları bozulmuş hastaların solunum yollarını kolonileştirdiği tespit edildi. Bu yaklaşım, önceki çalışmalarda açıklanan mikroskobik görüntüleme sürecini optimize etti14,20. Görüntüleme algılaması, floresan etiketli konak hücreler ve bakteriler tarafından, bunların yakınlığını hızla izlemek için basitleştirildi ve bu da bakterileri ayırt etmek için yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için mikroskopi iş yükünü önemli ölçüde azalttı. Buna ek olarak, konak hücre ve bakterilerin sayımındaki görüntülerin otomatik istatistiksel analizi, konak hücre başına yapışık bakteri sayısının oranını tahmin etmek için bakteriyel CFU kaplamanın elden deneyinin yerini almıştır. Bu yöntemin uyumluluğunu doğrulamak için Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus ve Klebsiella pneumoniae gibi birden fazla bakteri türü ve konak hücre tipinin yanı sıra insan göbek ve damar endotel hücreleri (HUVEC) de test edilmiştir ve sonuçlar yöntemin çeşitliliğini ve etkinliğini desteklememektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. A549 hücre kültürü

  1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş F-12K ortamında A549 hücre hattını koruyun ve 37 °C, %5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
  2. Ortamı her 3-4 günde bir değiştirin ve % 85-% 95 izdiahta geçiş.
  3. Kısaca, hücreleri 1 x fosfat tamponlu salin (AKSI belirtilmedikçe pS, pH 7.4) ile durulayın ve 1 ml%0.25 Trypsin-0.53 mM etileniaminetetraasetik asit (EDTA) çözeltisi (hücre tabakasını batırarak) ile yaklaşık 2 dakika boyunca 37 °C'de tedavi edin.
  4. Proteaz aktivitesini durdurmak için ek 6 mL tam büyüme ortamı (F-12K orta + % 10 FBS) ekleyin. Daha sonra, steril bir polistiren T-75 doku kültürü şişeskindeki hücreleri 1:3-1:8 alt kültür oranında plakala. Kültürün son hacmi 12 mL'dir.
  5. Yapışma testlerinden bir gün önce 96 kuyu plakasının her kuyusuna yaklaşık 1 x 104 A549 hücresi (hücre konsantrasyonu: ~1 x 10 5 hücre/mL) tohumlayın.

2. Bakteriyel büyüme ve lekeleme

  1. Tüm bakteriyel çalışmaları biyogüvenlik kabini, Biyogüvenlik Seviye 2 laboratuvarında gerçekleştirin.
  2. P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes ve B. subtilis, vb. dahil olmak üzere tüm bakteri kültürlerini donmuş gliserol stoğundan aşılayın ve 37 °C'de bir gecede 250 r'de tutulan sarsıcı bir inkübatörde Tryptic Soy Broth'ta (TSB, 3 mL) yetiştirin.
  3. Ertesi gün, bir alt kültürü aşılamak için geceleme kültürünün 1:100 seyreltilmesini kullanın ve üstel faza 3 saat boyunca TSB'de (1 mL) yetiştirin, onaylamak için OD'yi 600 nm (OD600)olarak ölçün. OD600'ün 0,4-0,6 aralığında olduğundan eminolun.
  4. Bakteri-konak yapışma tahlilini gerçekleştirmeden önce, bakteriyel süspansiyonun plaka seri seyreltmeleri TSB-agar plakalarına, 37 ° C'de bir gecede kuluçkaya yatırın ve daha sonra bakteri cfo'larını koloni sayısından kurun. P. aeruginosaiçin,1.0'ın OD 600'ü 2 x 108 uygulanabilir bakteri hücrelerine /mL'ye ve L. monocytogenesiçin 1.0'ın600'ü 9 x 10 8 uygulanabilir bakteri hücrelerine /mL'ye karşılık gelir.
  5. Bakteri kültürlerini oda sıcaklığında (RT) 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleme ile üstel fazda hasat edin, ardından 1x PBS (1 mL) kullanarak bir kez yıkayın. Bakteri peletlerini 1 mL 1x PBS'de yeniden dirildi ve OD600 bakteri süspansiyonlarını ölçerek konsantrasyonları belirledi. Örneğin,0,5'in OD 600'üne sahip P. aeruginosa, 1 x 108 bakteri hücresi /mL konsantrasyonu temsil eder.
  6. Karanlıkta yumuşak dönüş ile 30 dakika boyunca RT'de yeşil veya kırmızı floresan boya kullanarak bakteri süspansiyonu lekelenin. Bunun için, boyayı 1 kat seyreltmek için 1 mL bakteriyel süspansiyona 500 kat konsantre stok boyama boyasının 2 μL'sini ekleyin. Boyama boyasını yıkamak için, lekeli bakterileri 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüj edin ve peleti 1 mL 1x PBS'de üç kez yeniden ıslatın.
    NOT: Deneyde floresan - (GFP-, RFP-, mCherry- vb.) etiketli bakteriler kullanılıyorsa, bu bakteriyel boyama adımını atlayın. Bu protokolde GFP etiketli P. aeruginosa ve kırmızı floresan boya lekeli L. monocytogenes kullanılmıştır.
  7. Lekeli bakteri hücrelerini veya GFP etiketli bakterileri 2 dakika boyunca 13.000 x g'da santrifüjleme ile toplayın. Taze F-12K ortamında (1 mL) yeniden dürt ve her kültürünOD 600'lerini ölçün. Daha sonra, enfeksiyonun çokluğuna (MOI) ve konak hücre konsantrasyonuna bağlı olarak kültürleri istenen konsantrasyonlara seyreltin. Bu deneyde kullanılan son hacim 500 μL'dir.
    NOT: Örneğin, Trypan Blue boyama kullanılarak sayılan konak hücre konsantrasyonu 1 x 105 hücre/mL ise, 100 MOI'de istenen bakteri hücresi konsantrasyonu 1 x 107 hücre/mL olacaktır. 0.5 OD 600'de P. aeruginosa konsantrasyonu1 x 10 8 /mL'dir. İstenilen konsantrasyonu elde etmek için, P. aeruginosa kültürünü 10 kat seyreltin, 450 μL taze F-12K ortama 50 μL resüspended kültür ekleyin.

3. Bakteriyel yapışma ve konak hücre boyama

  1. İlk olarak, tohumlu A549 hücre monolayerlerini ılık 1x PBS ile üç kez yıkayın. Her yıkama için, her kuyuya 100 μL 1x PBS ekleyin, üç kez hafifçe pipet yukarı ve aşağı, 1x PBS atın veya eklemeden sonra 10 s bekleyin ve ardından 1x PBS'yi çıkarmak için vakumlayın. Bakteri ilişkisinin kinetiğini belirlemek için, hücreleri farklı MTI'lerle (0, 1, 10 ve 100) istenen 100 μL bakteri süspansiyon konsantrasyonuna sahip kapla. Bakterileri 200 x g'da 10 dakika döndürün ve enfekte olmuş A549 hücrelerini 37 °C'de kuluçkaya yatırın, 1 saat daha% 5 CO2.
    NOT: Bu deneyde, her durumun teknik bir üçeye özeli vardı.
  2. Yukarıda açıklandığı gibi sıcak 1x PBS ile monolayerleri beş kez yıkayarak ilişkisiz bakterileri temizleyin. Hücreleri sabitlemek için 96 kuyu plakalarının her kuyusuna 100 μL% 4 formaldehit (1x PBS olarak) ekleyin. Plakaları 15 dakika boyunca buzun üzerine oturtun ve ardından 1x PBS kullanarak sabitleme çözeltisini üç kez yıkayın.
  3. Çekirdeği lekelemek için, 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) 50 ng / mL ekleyin ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, kuyuları 1x PBS kullanarak üç kez yıkayın. Kurumasını önlemek için enfekte olmuş A549 hücrelerini 100 μL 1x PBS ile örtün. Bir sonraki adım için işlem yapın veya plakayı karanlıkta 2 güne kadar 4 °C'de saklayın.

4. Otomatik floresan görüntüleme, işleme ve analiz

  1. Veri bütünlüğünü korumak için, görüntüleri 20x büyütmede yakalamak için her kuyunun beş konumunu rastgele ve manuel olarak seçin. Sırasıyla DAPI ve GFP kanalları altında A549 hücrelerinin ve bakterilerinin floresan görüntülerini yakalayın. Kırmızı floresan boya ile lekelenmiş bakteriler için PE-Cy5 kanalını kullanın.
  2. Daha iyi bir çözünürlüğe sahip olmak için, arka plan düzleştirme ve dekonvolüzyon için tüm görüntüleri işleyin. Görüntü dekonvolüyonunun nokta yayılma işlevini (PSF) hedefe göre yumuşatmak ve otomatik olarak ölçmek için parametreleri yuvarlanan topun 68 μm çapı olarak ayarlayın.
  3. Tüm nitelikli hücreleri ve bakterileri saymak için konak hücrelerin ve bakterilerin floresan yoğunluğunu ölçün ve konak hücre ve bakterilerin en zayıf floresan yoğunluğunu hücre sayısı eşikleri olarak ayarlayın. A549 hücresinin çapı 10,59-14,93 μm21olduğu için yapışan bakteri olarak 15 μm mesafedeki bir konak hücreye yakın tüm bakterileri sayın.
    NOT: Görüntüleme sistemindeki varsayılan bir ayar, çapları 5-100 μm arasında değişen konak hücreleri ve boyut (genişlik ve uzunluk) olarak 0,2-5 μm arasında değişen bakterileri seçici olarak sayar.
  4. Yukarıda belirtilen manuel görüntü işleme sonuçlarına bağlı olarak, otomatik görüntülerin geri kalanına görüntü yumuşatma, dekonvolüsyon, nesne boyutları, mesafe ve floresan yoğunluklarının parametrelerini uygulayın. Otomatik analizden sonra, bakteriyel yapışmayı belirlemek için toplam konak hücre sayıları, hücre boyutları ve şekilleri, toplam bakteri sayısı ve en önemli gösterge olan konak hücre başına ortalama bakteri sayısı gibi kritik okumaları göz önünde bulundurun.
  5. Veri ihracatı ve istatistiksel analiz
    1. Analiz edilen sonuçları tüm görüntülerden bir elektronik tabloya (ör. 'xlsx' biçimi) dışa aktarın. Otomatik sistem iki sonuç kümesi oluşturur: 1) her görüntüden ortalama yapışan bakteri sayısı; 2) tek bir hücreye yapışan bakteri sayısı, konak boyutu ve konak hücre ve bakterilerin ortalama floresan yoğunluğu gibi her bir konak hücrenin bilgilendirici verileri, ilgili görüntüden.
    2. Negatif kontrollere kıyasla bakteriyel yapışma seviyesini temsil etmek için tüm görüntülerden yapışık bakteri sayısının ortalama sayısını ve standart sapmasını hesaplayın. Bu yöntemde E. coli ve B. subtilis sırasıyla Gram-negatif ve Gram-pozitif bakteriyel yapışma testlerinde negatif kontrol görevi gördü. Üç bağımsız deney için tedavi genelinde veri noktaları arasında önemli bir varyasyon sınamak için iki yönlü ANOVA'lar gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan görüntüleme bazlı bakteriyel yapışma testini geliştirmek için, P. aeruginosa suşu PAO1 ve negatif yapışma muadili E. coli, protokol etkinliğini test etmek için kullanıldı, çünkü bu bakterilerin A549 hücrelerine yapışma14,20,22bildirilmiştir. İlk olarak, GFP etiketli P. aeruginosa (PAO1) ve GFP etiketli E. coli, sırasıyla çeşitli MOI'lerde insan ölümsüzleştirilmiş epitel hücre hattı A5...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, konak hücrelere bakteriyel bağlanmayı numaralandırmak için otomatik bir yaklaşım açıklar. Açıklanan yaklaşımın geleneksel yöntemlere göre birkaç çekici avantajı vardır. İlk olarak, bu yaklaşım, tek tek konak hücrelere bağlı mikrobiyal patojen hücrelerinin sayısının kesin olarak ölçülmesini sağlar. Daha da önemlisi, bu niceleme zahmetli bakteriyel hasat, seri seyreltmeler, katı ortamlarda kaplama ve CFO10, 11,12tayini gerekmeden gerçekleştiril...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biotek A.Ş.'den Dr. Kaite Zlotkowski'ye teknik destekleri için minnettarız. Bu çalışma Savunma Bakanlığı tarafından W911NF1920013 sözleşme numarası altında PDF, Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) ve İçişleri Bakanlığı tarafından PDF'ye 140D6319C0029 sözleşme numarası altında desteklenmiştir. Bilgilerin içeriği mutlaka Hükümetin konumunu veya politikasını yansıtmaz ve resmi bir onay çıkarılmamalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10x PBSVWR45001-130
4 & prime ;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher62248Ana hücre boyama boyası
96 kuyulu plakaCorning3882Yarım alan kuyusu, düz net alt
A549 hücreleriATCC & nbsp;CCL 185Memeli hücre hattı
BactoView Canlı KırmızıBiotium40101Bakteri staning boya
SantrifüjEppendorf5810R
CFSE hücre bölünmesi izleyiciBioLegend423801
Sitasyon 5  BioTekSitasyon 5 Hücre görüntüleme çok modlu okuyucu
E. coliLaboratuvar stoku 
EGM bulletKitLonzaCC-3124HUVEC hücre kültürü ortamı
EHECNIST koleksiyonları
F-12k ortamıATCC 302004A549 hücre kültürü ortamı
Fetal sığır serumuCorning35-016-CV
HUVECLaboratuvar stoğu 
L. monocytogenes,NIST koleksiyonları
, OD600 DiluPhotometer,IMPLEN
P. aeruginosaDr. Lori Burrows
P. aeruginosa & Delta; pilA,Dr. Lori Burrows, laboratuvar stoğu
S. agalactiae,NIST koleksiyonları
, S. aureusBEI,NR-46543
S. aureus & Delta; saeRBEINR-48164
S. rubidaeaNIST koleksiyonları
Tipik soya suyuGrowcellsMBPE-4040
, , , laboratuvar stoğu, , , ,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
  2. Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
  3. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433(2017).
  4. Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
  5. Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094(2020).
  6. Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
  7. Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928(2019).
  8. Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
  9. Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192(2021).
  10. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110(2008).
  11. Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078(2011).
  12. Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240(2020).
  13. Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103(2018).
  14. Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
  15. Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173(2020).
  16. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268(2019).
  17. Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350(2019).
  18. Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43(2018).
  19. Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259(2012).
  20. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
  21. Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
  22. Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
  23. Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
  24. Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 2/08/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

Etiketler

Otomatik TespitY ksek Kapasiteli G r nt lemeFloresan MikroskopiG r nt AnaliziKoloni Olu turan BirimlerEnfeksiyon oklu uA549 H creleriPseudomonas Aeruginosa

İlgili makaleler