Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

6.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62765

⸱

7 Şubat 2022

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu makale, tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi için biyolojik örnekleri manuel olarak dondurmak için leke ve dalma yöntemini özetlemektedir.

Özet

Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM) ile yüksek çözünürlüklü yapı tespiti için elektronlu biyolojik örneklerin görüntülenmesi, ilgi çekici biyomolekülleri içeren ince bir vitreus buz tabakası gerektirir. Son yıllarda tek parçacıklı cryoEM'i yapısal biyolojinin ön saflarına taşıyan çok sayıda teknolojik ilerlemeye rağmen, numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için vitrifiye edildiği yöntemler genellikle hız sınırlayıcı adım olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda çok sayıda çaba, yeni örnek desteklerinin geliştirilmesi ve yenilikçi vitrifikasyon enstrümantasyonu da dahil olmak üzere numune vitrifikasyonu sırasında sıkça karşılaşılan engellerin üstesinden gelmek için araçlar sağlasa da, geleneksel manuel olarak işletilen piston, düşük satın alma maliyeti ve kullanım kolaylığı nedeniyle cryoEM topluluğunda temel bir unsur olmaya devam etmektedir. Burada, tek parçacıklı cryoEM ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu için standart, giyotin tarzı elle çalıştırılan blot ve dalma cihazını kullanmak için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Ayrıca, standart bir preparat uygun bir numune veremediğinde sık karşılaşılan sorunlar ve sorun giderme önerileri de açıklanmıştır.

Giriş

Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM), dinamik biyolojik örneklerin yapılarını atoma yakın çözünürlüğe çözmek için kullanılabilecek güçlü bir yapısal tekniktir1,2,3,4. Nitekim, doğrudan elektron dedektörü teknolojilerindeki son gelişmeler4,5,6,7,8,9,10, elektron kaynaklarında iyileşmeler4,11,12,13,14 ve elektromanyetik lens stabilitesi15, veri toplamanın sürekli gelişimi ile birleştiğinde 16,17 ve analiz yazılım paketleri18,19, araştırmacıların artık 3 şçözünürlüğe veya daha iyi 4,11,13,14,20,21,22,23'e iyi huylu örneklerin yapılarını rutin olarak belirlemelerini sağladı . Bu gelişmiş görüntüleme ve veri işleme yeteneklerine rağmen, cryoEM ızgara hazırlığı başarılı yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için en büyük engel olmaya devam ediyor ve genellikle EM iş akışında önemli bir darboğaz görevi görüyor24,25,26,27.

CryoEM, biyolojik örneklerin, yerel biyokimyasal durumu koruyan "cam benzeri" buzun ince bir filmini oluşturmak için dondurulan sulu çözeltilerde görüntülenmesine dayanır - vitrifikasyon olarak bilinen bir süreç. CryoEM için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu 40 yıl öncesine dayanıyor28,29,30 ve bu işlem için geliştirilen birçok teknik ve ekipman başlangıçta ayrıntılı blot ve dalma yöntemine güveniyor31,32,33,34,35 , örneğin, 1-5 μL) küçük bir numune hacminin, ızgaranın şişirme kağıdı ile fiziksel etkileşimi kullanılarak fazla çözelti çıkarılmadan önce özel bir EM ızgarasına uygulandığı yer. Bu işlemin zamanlaması genellikle her numune için ampirik olarak belirlenir, çünkü donma örneklerinin kritik bir bileşeni vitreus buz filminin kalınlığıdır - buz çok kalınsa, çok ince olan buz protein yönelimlerini kısıtlayabilir ve / veya parçacıkları ızgara folyo deliklerinin merkezinden dışlayabilirken elektron ışınının daha fazla saçılması nedeniyle görüntüleme kalitesi önemli ölçüde bozulur36 . Tek parçacıklı cryoEM için mükemmel buz kalınlığına olan bu güven, robotik37,38, mikroakışkanlar42 ve ultrasonik veya püskürtme cihazları27,39,40,41,42,43,44 dahil olmak üzere örnekleri dondurabilen çok çeşitli teknik ve ekipmanlara yol açmıştır. . Son yıllarda, en popüler numune hazırlama cihazlarından bazıları, blot ve dalma tekniğini kullanarak numunelerin otomatik olarak dondurulması için robotik kullanımına güveniyor45. Bu cihazlar görüntüleme için uygun buz kalınlığını yeniden oluşturmak üzere tasarlanmış olsa da, genellikle bireysel laboratuvarların satın alması ve çalışması için çok pahalı kalır ve genellikle kullanım için saatlik fiyatlarla cryoEM tesislerinde bulunur. Son yıllarda, orijinal manuel blot-and-plunge tekniği artmış kullanıma geri döndü3,47,48,49,50,51,52. Gerçekten de, elle çalıştırılan bir blot-and-plunge cihazı, robotik meslektaşlarının maliyetinin çok altında yüksek kaliteli cryoEM ızgaraları elde edebilir. Ayrıca, manuel şişkinlik, araştırmacılar her bir örnek ve araştırma sorusuna göre şişkinlik türünü (örneğin, ızgaranın geri blottingi, ızgaranın ön blottingi vb.) ve blotting süresini ayarlayabildiğinden, daha fazla kullanıcıya şişkinlik üzerinde kontrol sağlar.

Bu makalede, özel tasarlanmış bir dewar platformu53 ile birlikte geleneksel bir manuel blot ve dalma vitrifikasyon cihazı kullanarak biyolojik örneklerin etkili bir şekilde nasıl dondurulacağı hakkında ayrıntılı bilgi veriyoruz. Kriyojenin hazırlanması, ızgara işleme, örnek uygulama ve şişkinlik dahil olmak üzere en iyi uygulamaların yanı sıra bu engellerin nasıl aşılacağına dair yaygın tuzaklar ve öneriler sağlanmaktadır. Izgara preparatları arasında buz kalınlığı tekrarlanabilirliğinin nasıl artırılacağı ve numune şişkinliğinin biyolojik numune tipine göre nasıl değiştirilerek değiştirilmeleri konusunda tavsiyeler tartışılmıştır. Bu yazıda açıklanan manuel pistonun satın alınması ve işletilmesiyle ilgili düşük maliyet göz önüne alındığında, dünyanın dört bir yanındaki laboratuvarlar cryoEM için biyolojik örnekleri uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir şekilde hazırlayabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Manuel dalma ortamını hazırlayın

NOT: Tahmini çalışma süresi: 5-30 dakika

  1. Manuel pistonu, odayı %100 bağıl neme (RH) yakın tutmak için bir nemlendiricinin birlikte bulunabileceği 4 °C soğuk bir odada bulun (Şekil 1A).
    DİkKAT: Manuel pistonun güvenli konumu ve önerilen işlemler için lütfen kurumun Çevre Sağlığı ve Güvenliği yönergelerine bakın.
  2. Izgara hazırlamadan önce, soğuk odanın RH'sinin% 95'≥ emin olmak için soğuk odadaki nemlendiriciyi açın.
    NOT: Düşük nemde ızgara hazırlığı, ince filmlerin susuz kalmasına, buharlaşmaya bağlı tampon bileşenlerinin değiştirilmesine ve şebekeden ızgaraya tekrarlanabilirliğin azalmasına neden olabilir46. Izgaraların % 80 RH < dondurulması önerilmez.
  3. Soğuk odanın sıcaklığının 4 °C olduğundan emin olun.
  4. Izgaraların yakınında türbülansa ve/veya soğuk yüzeylerde belirgin buz birikmesine yol açabileceğinden, manuel pistonu güçlü hava akımlarından (yani klima ünitesi havalandırma deliklerinden uzakta) uzakta bulun.

2. Dalma malzemeleri ve aksesuarları hazırlayın

NOT: Tahmini çalışma süresi: 1-5 dakika

  1. Şişkin kağıt dairelerini 1-1,5 cm genişliğinde ve ~9 cm uzunluğunda şeritler halinde kesmek için temiz makas kullanın. Şişkin kağıdın ortasına dokunmaktan kaçının ve daha küçük uç parçalarını atın. Şişkin kağıt şeritlerinin kuru, temiz ve kirletici içermemesini sağlamak önemlidir. Şeritleri ayırın ve 100 mm Petri kabına yerleştirin.
  2. 22x22 mm kare cam kapak kapağı ayrı bir 60 mm cam Petri kabına yerleştirin. Bu kapaklı cam Petri kabı, ızgaraları depolamak, aktarmak ve kızdırma deşarj etmek için kullanılacaktır.
    NOT: Izgara eklemeden önce slayttaki görünür kalıntıları gidermek için bir hava tozlayıcı kutusu kullanmanız önerilir. Bir anti-statik tabanca, biriken statik elektriği gidermek için de kullanılabilir.
  3. Izgara depolama kutularını birleştirin ve etiketleyin.
  4. 4 ila 6 temiz ve kuru sıkma cımbızı alın ve manuel pistona bulun. Dalmadan önce her cımbızı görsel olarak inceleyerek hasar görmediklerini ve kirletici içermediklerini sağlayın.

3. Kriyojen dewar ve manuel pistonu hazırlayın

NOT: Tahmini çalışma süresi: 5-15 dakika

  1. Platform tabanını dalma dewar'ın altına takın. Etan kabı dewar'ı platform tabanının üzerine yerleştirin, pirinç etan kabını ekleyin ve ardından iplik ızgarası depolama platformunu takın.
    1. Dalgıç dewar'a sıvı nitrojen (LN2) eklendikten sonra, platform tabanının yüksekliği artık ayarlanamaz. Izgara tabanının düzgün takıldığından ve yanlış piston yüksekliği nedeniyle ızgara ve/veya cımbız hasarını sınırlamak için seviyeli olduğundan emin olun.
  2. Donma işlemine gerek kalmak için manuel pistonu ve tüm yardımcı ekipmanları kontrol ederek numune ve/veya ızgara kaybını sınırlamak için düzgün çalıştıklarından emin olun.
  3. Her donma seansından önce, cımbızı tutmak için kullanılan manuel piston kolundaki bandı değiştirin. Odanın yüksek nemi bant yapıştırıcısını bozabilir ve bandın cımbız tutma yeteneğini azaltarak cımbız hasarı ve/veya ızgara kaybı olasılığını azaltabilir.
  4. Numune fitilini izlemek için yeterli ışık olduğundan emin olmak ve ızgara hasarını ve/veya kaybını önlemek için ızgara aktarımını kolayca görselleştirilebilmesini sağlamak için manuel pistonun yanındaki lambaları ayarlayın (bkz. adım 3.7). Sıvı hareketini görselleştirmek için pistonun hemen arkasında bir halka lambası ve donmuş ızgaraları aydınlatmak için dewar yakınında esnek bir kol görev ışığı kullanın.
  5. Dewar dalma kolunun yükseltilmiş konumdayken güvenli bir şekilde yerinde tutulmasını ve pedala basıldığında tamamen serbest bırakılmasını sağlamak için ayak pedalı gerilimini ayarlayın. Pistonun düzgün çalıştığından emin olmak için numune uygulamasından önce birkaç "kuru" çalışma gerçekleştirin.
    NOT: Ayak pedalı geriliminin yanlış ayarlanmasında, dalma kolunun erken salınması (yani, gerginlik çok düşüktür) ve ızgara kaybı veya ızgaranın etan kabına eksik daldırması (yani, gerilim çok yüksek ayarlanmıştır) neden olacaktır.
  6. Dalma dewar'ı manuel pistonun tabanına, dalma kolunun hemen altına yerleştirin ve yerine sabitleyin. Bağlı bandı kullanarak dalma koluna bir çift cımbız takın. Manuel dalma kolunu tutarken, dalgıç kolunu dikkatlice indirmek için ayak pedalını bastırın ve ızgaranın etan kabının ortasında yer alacağından emin olmak için dalma kolunun seyahatini ayarlayın.
  7. Ayak pedalı tamamen depresif olduğunda dalma kolunun son konumunu belirlemek için dalma kolunun üstündeki tümsek durağını kullanın (Şekil 1B). Etan kabındaki ızgaranın konumunu ayarlamak için dalma kolundaki çarpma durdurma yüksekliğini ayarlayın (Şekil 1C).
    NOT: Dalma kolunun yüksekliğinin yanlış ayarlanması ızgara ve/veya cımbız hasarına (örneğin, dalma kol yüksekliği çok düşük ayarlanmıştır) veya yetersiz vitrifikasyona (örneğin, dalma kol yüksekliği çok yüksek ayarlanmıştır) yol açabilir.
  8. Soğuk odanın dışındaki dewar'ı bulun ve sıvı etan hazırlamaya devam edin (adım 4).

4. Kriyojeni hazırlayın

NOT: Tahmini çalışma süresi: 10-30 dakika

  1. Etan tankı, regülatör, boru ve etan dağıtım ucunu herhangi bir hasar belirtisi için değerlendirin. Devam etmeden önce herhangi bir hasar belirtisini derhal bildirin ve düzeltin.
    DİkKAT: Sıkıştırılmış etan ve etan:propan gazı karışımları yanıcıdır ve yanlış kullanıldığında yaşam için ciddi bir tehdit oluşturabilir ve/veya yaralanmaya neden olabilir. Sıkıştırılmış gaz tanklarının nasıl çalıştırılacağından veya işleyeceğinden emin değilseniz lütfen bir uzmana danışın. Yanıcı sıkıştırılmış gazları kullanırken lütfen kurumun Çevre Sağlığı ve Güvenliği yönergelerine bakın. Ek olarak, sıvılaştırılmış etan, düzgün bir şekilde ele alınmazsa yaşam ve / veya yaralanma için ciddi bir tehdit oluşturabilen güçlü bir kriyojendir. Kriyojenleri kullanırken lütfen kurumun Çevre Sağlığı ve Güvenliği yönergelerine bakın.
  2. Uygun bir LN2 işleme dewarında yeterli LN2 elde edin (yani, 3-4 L ızgara hazırlama ve depolama için tipiktir).
    DİkKAT: LN2 , düzgün bir şekilde ele alınmazsa yaşam ve/veya yaralanma için ciddi bir tehdit oluşturabilen bir kriyojendir.
    1. Yaralanma riskini en aza indirmek için tüm kişisel koruyucu ekipmanların kullanıldığına emin olun. LN2 buharı bir boğulmadır ve iyi havalandırılmış alanlarda ele alınmalıdır. Kriyojenik damarların ve kriyojenlerin nasıl çalıştırılacağından veya ele alınacağından emin değilseniz lütfen bir uzmana danışın. Kriyojenleri kullanırken lütfen kurumun Çevre Sağlığı ve Güvenliği yönergelerine bakın. Soğuk bir odada sıvı nitrojenin kullanılamadığı durumlar için, serin ve iyi havalandırılmış bir alanda dalma donmasını öneririz.
  3. Soğuk odanın dışında, sıvı nitrojen seviyesi etan kabının tepesine ulaşana kadar LN2'yi doğrudan pirinç etan kabına dökerek dalma dewar'ını soğutun (yani platformun hemen üstünde). Gerektiğinde etan kabının dışındaki LN2'nin üst kısmından çıkın. LN2 şiddetli bir şekilde köpürmeyi bıraktığında bir sonraki adıma geçin (yaklaşık 5 dakika).
    1. Etan gazını yoğunlaştırarak önce kabı yeterince soğutmak için LN2'yi doğrudan pirinç etan kabına ekleyin. Pirinç etan kabının düzgün soğutulmaması, etan yoğuşması için gereken süreyi önemli ölçüde artıracaktır.
    2. Savaş LN2 sıcaklığına ulaştığında, LN2'nin etan kabına dökülmesi için dewar'ı aşırı doldurmaktan kaçının.
  4. Etan sıkıştırılmış gaz olarak gelir ve kullanım için sıvılaştırılmalıdır. Etan tankı, gaz akışını kontrol etmek için yüksek saflıkta çift kademeli bir regülatör kullanır. Boruyu regülatör çıkış vanasına bağlayın ve etan dağıtmak için sonuna bağlı 14 kalibrelik bir düz metal dağıtım ucu kullanın.
  5. Etan ana tank vanasını açmadan önce, basınç ayar düğmesinin ve çıkış vanasının tamamen kapalı olduğundan emin olun. Ana tank vanasını tamamen açın ve ardından çıkış vanasını ~ % 50'ye açın. Yavaş bir gaz akışı gözlenene kadar basınç ayar düğmesini yavaşça açın. Gaz akışına ince ayar yapmak için çıkış vanasını kullanın.
    DİkKAT: Vanaları açarken veya gaz akışı ayarlamaları yaparken metal dağıtım ucunu daima kendinden uzaklaştırın.
  6. Gaz akışını yavaşça başlatın ve etan gazı hattının ucunu küçük bir deiyonize su kabına sokarak akış hızını değerlendirin. Debi suyu orta derecede rahatsız edene kadar gaz akışını ayarlayın.
    1. Uygun etan yoğunlaşmanın meydana geldiğinden emin olmak için gaz akış hızını ayarlayın - bir akış hızının çok yavaş olması, etan gazının dağıtım ucunda katılaşmasına neden olur ve bir akış hızının çok hızlı olması yoğun kabarcıklanmalara neden olur ve donma önler.
  7. Etan gazı hattının ucunu pirinç etan kabına yerleştirmeden önce, herhangi bir suyu çıkarmak için dağıtım ucunu hassas görev mendilleriyle temizleyin ve silin.
  8. Pürüzsüz ve hızlı bir hareketle, pirinç etan kabının altındaki gaz dağıtım ucunu bulun ve dağıtım ucunu etan kabının dibinde yavaş bir daire içinde hareket ettirmeye başlayın. Katı etan hemen oluşacaktır, ancak daha fazla etan gazı eklendikçe / yoğunlaştıkça hızlı bir şekilde sıvılacaktır.
    1. Katı etanları sıvılaştırmak için metal etan dağıtım ucunu etan kabının dibinde hareket ettirmeye devam edin. Etan kabını sıvı etan dolu 3/4'e kadar doldurun (üstten 2-3 diş). Metal etan dağıtım ucunu pirinç etan kabından dikkatlice çıkararak ve çıkış vanasını kapatarak etan gazı akışını durdurun.
  9. LN2'nin pirinç etan kabına LN2 eklenmesini önlemek için dewar'ın kenarına hafifçe dökülen dalma dewar'ın üst kısmını, sıvı seviyesi sadece pirinç etan kabına dokunana kadar. Etan katılaşmasını kolaylaştırmak için köpük kapağını dalma dewar üzerine yerleştirin.
    1. LN2, etan katılaşmasına yardımcı olmak için doğrudan pirinç etan kabına başvurmalıdır. Yaklaşık 5 dakika sonra, pirinç kap içindeki etan tamamen donmuş katı hale gelecektir. Etan kabına dokunana kadar daha fazla LN2 ekleyin ve bir sonraki adıma geçin.
  10. Etan katı donmamışsa, pirinç etan kap kalan adımlar için yeterince soğuk değildir. Etan kabına dokunana kadar daha fazla LN2 ekleyin ve 5 dakika daha bekleyin. Pirinç kap içindeki etanların tamamen donmuş olduğundan emin olun.
  11. 4.6. adımda belirlenene benzer bir oranda etan gazı akışı üretmek için gaz çıkış vanasını açın. Metal etan dağıtım ucunu dikey olarak katı etan içine yerleştirin ve katı etanları eritmek için etan dağıtım ucunu dairesel bir hareketle hareket ettirmeye devam edin.
    1. Pirinç etan kabının üst kısmı ile düz olana kadar etan eklemeye devam edin. Ucu yavaşça etan kabından çıkarın ve etan tankı çıkış vanasını kapatın. Etanların pirinç etan kabının kenarlarında katılaşmasını sağlamak için dewar'ı kapakla ~1-4 dakika örtün.
      NOT: İdeal bir etan kabı, merkezde sıvı etan bulunan pirinç etan kabının çevresinde 2-3 mm simetrik bir katı etan halkasına sahip olacaktır (Şekil 1D ve Şekil 2).
    2. Biyolojik numunenin uygun vitrifikasyonu için katılaşmadan etanların mümkün olduğunca soğuk olduğundan emin olun. Sıvı etanının düzgün bir şekilde hazırlanmaması, numunenin yetersiz vitrifikasyonuna, buz birikimine ve/veya numune kaybına neden olabilir ve her biri görüntüleme için numune kalitesinin bozulmasına katkıda bulunabilir.
    3. 2-3 dakika sonra katı bir etan halkası oluşmazsa, dewar'a daha fazla LN2 ekleyin ve 2-5 dakika daha örtün.
    4. Etan çok hızlı katılaşma yapıyorsa, etan kabını ve/veya katı etanları hafifçe ısıtmak için büyük bir çift temiz cımbız kullanın. Etan ve LN2 stabil hale gelince, tüm etan tankı vanalarını kapatın ve dalma dewar'ı manuel pistona bulun. Dalma dewar'ı manuel pistona sabitleyin.
      DİkKAT: LN2 etan kabına dökülebileceği ve sıvı etan katılaştırabileceği için dewar'ı aktarırken ekstra dikkatli olun. Gerekirse, kabın ortasındaki herhangi bir katı etan eritmek için temiz bir cımbız seti kullanılabilir.
  12. Cımbız ucunun etan kabının merkezinde bulunduğundan ve sıvı etan içinde ızgara ve cımbız ucu için yeterli alan olduğundan emin olmak için etan dewar'ın yerini bir çift boş cımbızla test edin (Şekil 1D).
    1. Katı etan halkası kolay ızgara kullanımı için çok kalınsa, katı etanları eritmek ve etan kabının merkezinde daha fazla donma alanı oluşturmak için bir çift oda sıcaklığı, temiz cımbız kullanın.

5. EM ızgaralarını hazırlayın

NOT: Tahmini çalışma süresi: 1-5 dakika

  1. Izgara depolama kutularını dewar'a ekleyin, ızgara depolama kutusu kapaklarını sökün ve her kapağın serbestçe yeni bir ızgara yuvasına dönebildiğinden emin olun.
  2. Izgara saklama kutusundan kare cam kapak ucunun kenarına ızgaraların ~% 30-40'ını slayt kenarından dikkatlice aktarın. Izgara folyonun yukarı dönük olduğundan emin olun. Izgaraların kullanılmadığında kaplandığından emin olun. Izgaraları kare cam kapak çizgisinin kenarına yerleştirmek ızgara işleme kolaylığı sağlar ve aktarım sırasında ızgarayı bükme veya zarar verme şansını azaltır.
    NOT: 4-6 ızgara genellikle bir seferde hazırlanır.
  3. Izgaraları bir kızdırma deşarjı veya plazma temizleyicisi kullanarak hidrofilik hale getir.
    NOT: Lütfen kızdırma deşarjı/plazma temizleyici üreticisi tarafından sağlanan ızgara temizliği için önerilen yönergelere bakın.
    1. Izgaralar hidrofilitesini kaybettiğinden ve bu süreden sonra şebekeden şebekeye tekrarlanabilirlik azaldığından plazma temizliğinden sonraki 10 dakika içinde ızgaraları kullanın.

6. Dondurucuya dalarak cryoEM örneğini hazırlayın

NOT: Tahmini çalışma süresi: >10 dakika (ızgara başına ~ 1-3 dakika)

  1. Temizlenmiş bir ızgarayı almak için temiz ve kuru bir cımbız kullanın, ızgarayı yerinde sabitlemek için plastik kelepçeyi aşağı kaydırın ve ızgaranın düzgün bir şekilde sabit olduğundan emin olmak için cımbıza hafifçe dokunun.
    1. Izgara folyonun zarar görmesini önlemek için ızgaraları dış bilezikten alın.
  2. Izgaranın hazırlanan tarafına (örneğin, ön veya folyo tarafı) 1 ila 5 μL numune uygulayın.
    NOT: En uygun hacim ve şişkinlik süresi örneğe bağlıdır ve her örnek için optimize edilmesi gerekir; daha büyük hacimler ve daha viskoz numuneler daha uzun blotting süreleri gerektirir.
  3. Cımbız ızgarası örnek tertibatını, bandı cımbız sapının etrafına sararak manuel dalma koluna sabitleyin.
    1. Geleneksel ön şişkinlik için örneği kullanıcıya doğru yüzleşin. Örnek geri şişkinlik gerektiriyorsa, örneği kullanıcıdan uzakta bulun.
  4. Her elin başparmağı ve işaret parmağı arasında temiz, kuru, kesilmiş bir lekeleme kağıdı tutun.
    1. Sadece kenarlardaki şişkin kağıtları kullanın ve ellerden/ eldivenlerden gelen yağlar ve diğer kirleticiler ızgara kalitesini değiştirebileceğinden asla merkeze dokunmayın.
  5. Kararlı bir pozisyon oluşturmak için ellerinizi dalma dewar'ın kenarına koyun. Izgara yüzeyinden yaklaşık 1 cm uzaklıkta ızgara yüzeyine paralel olarak şişirme kağıdını bulun.
    1. Tam sıvı hareketliliği ve hatta ızgara yüzeyinde fitilleme sağlamak için şişirme kağıdının orta bölümünü kullanın.
  6. Şişkinlik başlatmak için şişkin kağıdı ızgaraya doğru bükmek için başparmak ve yüzük parmaklarını hafifçe kaydırın ve birbirine doğru döndürün. Tüm blotting işlemi sırasında şişkinlik kağıdı ile ızgara yüzeyi arasındaki teması koruyun.
    1. Şişkinlik kağıdını doğrudan ızgara yüzeyine temas ettirin ve ızgara yüzeyinde tutarlı teması koruyun.
    2. Şişkin kağıdın hafifçe bükülmesi ızgaranın bükülmesini ve/veya ızgara yüzeyine zarar görmesini azaltır ve ızgara boyunca daha tutarlı buzla sonuçlanır (Şekil 3A).
  7. Mobil sıvı ön tarafına dikkat edin ve şişkin kağıda ilerlemeyi bıraktığında 4 ila 6 saniye boyunca saymaya başlayın.
    NOT: Blotting kağıdı ızgara yüzeyine temas ettikten sonra sayım gerçekleşebilir, ancak daha düşük ızgaradan ızgaraya tekrarlanabilirlik oluşabilir. Toplam leke süresi ızgara tipine, folyo tipine, numune konsantrasyonuna ve numune tipine (örneğin, çözünür ve membran ve filamentli proteinlere karşı) bağlı olacaktır. Daha viskoz numuneler için daha uzun leke süreleri (örneğin, 5 ila 7 saniye) gerekecektir.
    1. Önemli: Dondurma işlemi sırasında tekrarlanabilirliği büyük ölçüde artırmak için güvenilir ve tutarlı bir sayım şeması geliştirin.
  8. Şişkin kağıdı ızgara yüzeyinden "yapışma hareketi" içinde çıkarmak için sol, sağ başparmak ve işaret parmaklarını ters yönde hareket ettirin. Dalma kolunu serbest bırakmak ve ızgarayı sıvı etan içine daldırmak için ayak pedalını hemen bastırın.
    1. Aynı anda şişkin kağıdı çıkarın ve en iyi donma sonuçları için ızgarayı etan içine mümkün olan en kısa sürede daldırmak için ayak pedalına basın. Kağıt kaldırma ve dalma arasındaki süre ne kadar uzun olursa, ince filmlerin buharlaşması o kadar fazla gerçekleşir ve ızgaradan ızgaraya tekrarlanabilirliği azaltır.
  9. Sıkma cımbızını stabilize etmek, cımbızın etrafından bantları dikkatlice gevşetmek ve manuel dalma kolunu kullanmak için bir el kullanın.
    1. Cımbız ızgarasının hareketini önlemek ve ızgaranın katı etana çarpmasını önlemek için her zaman cımbızla teması sürdürün.
  10. Sıkma cımbızları manuel dalma kolundan kurtulduktan sonra, cımbızı bir elinizde dalma dewarının üzerine yaslayarak koruyun, ızgaranın sıvı etan içinde kaldığından emin olun. Izgaranın aktarılabilmesi için plastik kelepçeyi ızgaradan dikkatlice kaydırın. Izgarayı korumak için cımbız üzerindeki basıncı koruyun.
    1. Hızlı bir hareketle, ızgarayı etan kaptan LN2 rezervuarına hızlı bir şekilde aktarın. Izgarayı ızgara depolama kutusuna dikkatlice yerleştirin.
      NOT: Izgara yüzeyinde bir miktar etan katılaşabilir. Cımbızın hafifçe açılması etanları kıracak ve ızgaranın ızgara kutusuna düşmesine izin verecektir.
  11. Don birikimini önlemek için cımbızın ucunu hassas bir görev mendiline sarın. Cımbız oda sıcaklığına dönene kadar kenara alın.
    1. Kullanım kolaylığı için elinizde 4 ila 6 cımbız olsun. Her cımbız numune dondurma için kullanılacak ve sonraki kullanımdan önce ısıtılacaktır.
  12. Her ızgara için 6.1-6.11 adımlarını yineleyin.
  13. Donma sona erdiğinde, ızgara kutusunu güvenli bir şekilde kapatın ve uygun bir depolama konumuna aktarın.
  14. Sıvı etan ve LN2'yi dikkatlice atın ve tüm malzemeleri kuru bir yerde saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada açıklanan blot ve dalma protokolünün başarılı bir şekilde yürütülmesi, elektron mikroskobu altında gözlemlenebilen altıgen buz, kirleticiler ve kullanılamaz buzun büyük gradyanlarından arınmış ince, düzgün bir vitreus buz tabakası ile sonuçlanacaktır (Şekil 3). Şişkinlik kağıdının ızgara yüzeyi ile tutarsız teması, şişkin kağıdın zamanından önce çıkarılması veya ızgara teması sırasında şişkin kağıdın hareket ettirilerek vitreus buzun kalitesi düşebilir ve EM ızgarası boyunca tutarsız ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi (cryoEM) ile görüntüleme için biyolojik örneklerin vitrifikasyonu, başarılı yapı tespiti için kritik öneme sahip bir adım olmaya devam etmektedir. Bu protokolde açıklanan manuel blot-and-plunge yöntemi, cryoEM görüntüleme için ince vitreus buz filmlerindeki biyolojik örneklerin hızlı bir şekilde dondurulması için uygun maliyetli, güvenilir ve sağlam bir yöntemi temsil eder. Araştırmacılar, el yazmasında belirtilen yöntemleri kullanarak manuel pistonu bir araya getirip çalış...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Açıklayacak bir şeyimiz yok.

Teşekkürler

Herzik laboratuvar üyelerine bu makale ve video içeriği hakkında eleştirel düşünmeleri ve geri bildirimde bulunmaları için teşekkür ederiz. M.A.H.Jr. NIH R35 GM138206 ve Searle Scholar tarafından desteklenmektedir. H.P.M.N Moleküler Biyofizik Eğitim Hibesi (NIH T32 GM008326) tarafından desteklenmektedir. Ayrıca Scripps Araştırma Enstitüsü'ndeki Bill Anderson, Charles Bowman ve Dr. Gabriel Lander'a videoda gösterilen manuel pistonun tasarlanması, montajı ve testine yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4 yuvalı ızgara saklama kutusuTed Pella160-40
14 gauge düz metal dağıtım ucuAmazonB07M7YWWLT
22x22 mm kare cam lamelSigmaC9802-1PAK
Izgaraları saklamak için 60 mm cam Petri kabıFisher08-747A
Whatman kağıdını saklamak için 100 mm cam Petri kabıFisher08-747D
Whatman kağıdını saklamak için 150 mm cam Petri kabıFisher08-747F
250 mL beherFisher02-555-25B
Mavi strafor dewarSpear LabFD-500
Pirinç etan kabıLasco17-4075
Sıkıştırma cımbızıTed Pella38825
Hassas görev mendilleriFisher06-666
Kontrol vanalı çift kademeli regülatörAirgasY12N245D580-AG
Kanalizasyon şebekesi tabanıUCSD
Etan platformuUCSD
Etan propan tankıPraxairET PR50ZU-Getan (%50): yüksek basınçlı tankta propan (%50)
Etan tankıPraxairUN1035etan (%100)
Esnek kol görev lambasıAmscopeLED-11CR
Izgaralar (UltrAufoil R 1.2 / 1.3 300 mesh)Elektron Mikroskobu BilimleriQ325AR1.3
NemlendiriciHedef719438
HigrometreThermoProB01H1R0K68
Laboratuvar önlüğüUCSD
Sıvı Nitrojen dewarWorthingtonLD4
Sıvı Nitrojen eldivenleriFisher19-059-925
Manuel piston standı (siyah stand + ayak pedalı)UCSD
Mark 5 (dalma platformu)UCSD
Nitril eldivenlerVWR82026-424
P20 pipetEppendorf13-690-029
PCR tüpleriEppendorf
Pipet uçlarıibis scientific63300005
Halka lambaAmazonB07HMR4H8G
Güvenlik gözlükleriUCSD
MakasAmazonFiskars 01-004761J
TornavidaIronside354711
BantFisher15-901-10R
Izgara kutusunu aktarmak için cımbızAmazonLTS-3
Tygon boruFisher14-171-130
Whatman kurutma kağıdıFisher1001-090
E0030124286

Kaynaklar

  1. Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
  2. Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
  3. Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
  4. Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  5. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  6. Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  7. Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
  8. McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
  9. Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047(2021).
  10. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  11. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  12. Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
  13. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  14. Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
  15. Herzik, M. A. Jr Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
  16. Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  17. Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  18. de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  19. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  20. Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006(2017).
  21. Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
  22. Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482(2020).
  23. Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
  24. Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  25. D'Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747(2019).
  26. Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  27. Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
  28. McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
  29. Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
  30. Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
  31. Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
  32. Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
  33. Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
  34. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
  35. Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing 'Standard' Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
  36. Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257(2018).
  37. Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
  38. Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
  39. Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
  40. Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
  41. Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
  42. Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
  43. Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
  44. Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
  45. Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
  46. Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
  47. Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027(2016).
  48. Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773(2018).
  49. Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
  50. Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A. Jr, Lander, G. C., Lee, S. -Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
  51. Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275(2020).
  52. Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730(2020).
  53. Herzik, M. A. Jr Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , Available at: https://herziklab.com/manual-plunge.html (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tek Parçacık Kriyo-EMManuel Şok DondurmaVitreöz Buz HazırlamaTransmisyon Elektron MikroskopisiKriyo-EM Izgarası HazırlamaSıvı Etan DondurmaBlotlama Kağıdı TekniğiBiyolojik Örnek Vitrifikasyonu
Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.