Bu makale, ex vivo deneyleri için yeni bir bağırsak organ kültürü sistemi kullanarak konak mikrobiyom etkileşimlerini analiz etmek için benzersiz bir yöntem salamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Konak-Mikrobiyota Etkileşimlerini Analiz Etmek için Bağırsak Bağırsak Organ Kültürü Sistemi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Bağırsak dokusunun yapısı, konakçı ile bağırsak mikrobiyotası arasındaki yakın ve karşılıklı etkileşimleri kolaylaştırır. Bu çapraz görüşmeler yerel ve sistemik homeostazların sürdürülmesi için çok önemlidir; bağırsak mikrobiyota bileşimindeki (disbiyozis) değişiklikler çok çeşitli insan hastalıkları ile ilişkilidir. Konak-mikrobiyota etkileşimlerini inceleme yöntemleri, fizyolojik doku yapısının korunması (in vivo hayvan modelleri kullanırken) ve deney faktörleri üzerindeki kontrol seviyesi (basit in vitro hücre kültürü sistemlerinde olduğu gibi) arasında doğal bir dengeyi kapsar. Bu dengeyi ele almak için, Yissachar ve arkadaşları yakın zamanda bir bağırsak organı kültür sistemi geliştirdiler. Sistem naif bir kolon dokusu yapımını ve hücresel mekanizmaları korur ve ayrıca sıkı deneysel kontrole izin vererek vivoolarak kolayca gerçekleştirilemeyen deneyleri kolaylaştırır. Çeşitli bağırsak bileşenlerinin (epitel, immünolojik ve nöronal elementler gibi) kısa süreli yanıtlarını ışık pertürbasyonlarına (anaerobik veya aerobik mikroplar, farelerden veya insanlardan gelen tüm mikrobiyota örnekleri, ilaçlar ve metabolitler dahil) ayırmak için en uygun olanıdır. Burada, özel yapım bir bağırsak kültürü cihazı kullanarak birden fazla bağırsak parçasının organ kültürü için optimize edilmiş bir protokolün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Luminal pertürbasyonlara konak yanıtları, doku bölümlerinin veya tüm montajlı doku parçalarının immünofluoresans boyanması, floresan yerinde hibridizasyon (FISH) veya zaman atlamalı görüntüleme ile görselleştirilebilir. Bu sistem, yeni nesil sıralama, akış sitometrisi ve çeşitli hücresel ve biyokimyasal tahliller de dahil olmak üzere çok çeşitli okumaları destekler. Genel olarak, bu üç boyutlu organ kültürü sistemi büyük, bozulmamış bağırsak dokularının kültürünü destekler ve yerel bağırsak ortamında konak-mikrobiyota etkileşimlerinin yüksek çözünürlüklü analizi ve görselleştirilmesi için geniş uygulamalara sahiptir.
Giriş
Bağırsak, hücrelerin birbirleriyle ve ışık içeriğiyle (mikrobiyota, gıda vb.) etkileşime girmesini ve iletişim kurmasını sağlayan belirli bir yapıda düzenlenmiş çok çeşitli hücre tipleri (epitel hücreleri, bağışıklık sistemi hücreleri, nöronlar ve daha fazlası) içeren son derece karmaşık bir organdır. 1. Şu anda, konak-mikrobiyota etkileşimlerini analiz etmek için mevcut olan araştırma araç kutusu in vitro hücre kültürlerini ve in vivo hayvan modellerini içerir2. In vivo hayvan modelleri fizyolojik doku konstrüksiyon3 sağlar, ancak zayıf deneysel kontrol ve deney koşullarını manipüle etme yeteneği sınırlıdır. İn vitro kültür sistemleri ise, mikroplarla desteklenebilen birincil hücreleri veya hücre hatlarını kullanın4Deney parametreleri üzerinde sıkı kontrol sağlar, ancak hücresel karmaşıklıktan ve doku mimarisinden yoksundur. Modern in vitro tahliller, fare veya insan kaynaklarından elde edilen epitel organoidler 5,6ve mukozal mikroçevreyi taklit eden örnekler gibi sağlıklı ve patolojik insan dokusu örneklerinin ileri düzeyde kullanılmasına izin verir7. Başka bir örnek, bağırsak değişmez8'infizyolojik durumunu taklit etmek için insan kolonik epitel hücre hattı (Caco2), hücre dışı matris ve mikroakışkan kanalları içeren 'çip üzerindeki bağırsak' tahlildir. Bununla birlikte, in vitro örnekler ne kadar gelişmiş ve yenilikçi olsalar da, normal bir doku mimarisi veya naif hücresel bileşim sağlamaz.
Bunu ele almak için, Yissachar ve arkadaşları son zamanlarda sağlam bağırsak parçalarını koruyan bir ex vivo organ kültürü sistemi geliştirdi9 (Şekil 1) ex vivo, hem in vivo hem de in vitro modellerin avantajlarından yararlanıyor. Bu ex vivo gut organ kültürü sistemi, altı kolon dokusunun çok katlı kültürünü destekleyen, sistemin giriş ve çıkışlarını kontrol ederken benzer koşullar altında deneysel girdilerin incelenmesine izin veren özel yapım bir kültür cihazına dayanmaktadır. Son çalışmalar, bu sistemin bireysel bağırsak bakterilerine bağırsak yanıtlarını analiz etmek için değerli olduğunu göstermiştir9, tüm insan mikrobiyota örnekleri10 ve mikrobiyal metabolitler11. Bu sistem, ilk kez, bu erken konak-mikrobiyota etkileşimlerinin konak, mikrobiyal ve çevresel bileşenler üzerinde yüksek düzeyde kontrol ile incelenmesine izin verir. Ayrıca, deney boyunca sistemin gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve manipüle etmesine izin verir.
Şekil 1: Bağırsak kültürü cihazının şemaları. Bütün bir bağırsak dokusu parçası, odanın çıkış ve giriş portlarına (üstte), lümenin içindeki ve dış orta odanın içindeki orta akışı düzenleyen pompalarla tutturulur. Tüm cihaz (altta) bu tür 6 odacık içerir. Bu rakam Yissachar ve ark. 2017'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol, hayvan refahı etik komitesi tarafından onaylanan hayvan bakım yönergelerini izler.
1. Deney hazırlığı
- Bağırsak organ kültürü cihazının imalatı (3 gün)
- 3D yazıcı kullanarak, organ kültürü cihazı için yeniden kullanılabilir plastik kalıpları yazdırın (cihazda 24 küçük ve büyük delikli 6 kuyu ve cihaz kapağı kapağı vardır) (3D dosyalar eklenmiştir).
NOT: Bu plastik kalıplar çok sayıda cihazın imalatı için kullanılabilir. - Künt uçlu iğneleri (22 G & 18 G) cihaz kalıbı içinde uygun konuma getirin ve cihazın ve kapağın bir seti için yaklaşık 20 g polidimetilsiloksan (PDMS) karışımı (1:10 ağırlık oranı, tabandan katalizöre) dökün.
- Hava kabarcıklarını PDMS karışımından çıkarmak için kalıpları 30 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin.
- PDMS polimerizasyonunu tamamlamak için kalıpları bir gecede 55 °C'de kuluçkaya yatırın.
- PDMS ayarlandığında, iğneleri kalıptan çıkarın ve kültür cihazını ve kapağı plastik kalıplardan dikkatlice serbest bırakın.
- Pdms kalıntılarını bir cerrahi bıçak kullanarak kuyu anahattından çıkarın. PDMS cihazını ve cihaz kapağını toksik olmayan silikon yapıştırıcı kullanarak bir kapak camına (75 mm x 50 mm mikro slaytlar) takın ve parçaları gece boyunca ayarlamak üzere bırakın (yapıştırıcıyı cihazın pürüzsüz tarafına uygulayın).
- Lümen için on iki 22 G iğne ve kuyu için on iki 18 G iğne yerleştirin. Silikon kullanarak tüm iğneleri yerinde sabitle ve gece boyunca ayarlasın. Bağırsak organ kültürü cihazına uygun hava akışı için kapak kapağına iki adet 18 G iğne yerleştirin.
- Su dolu bir şırınga kullanarak tüm iğneleri sızıntılara karşı kontrol edin. Kuyuları su ile doldurarak kuyulardan sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
- Kolona bağlanacak her 22 G iğneye iki cerrahi düğüm yerleştirin. Cihazı ve kapağı bir otoklav kese kağıdına yerleştirin ve bir otoklavda sterilize edin.
- 3D yazıcı kullanarak, organ kültürü cihazı için yeniden kullanılabilir plastik kalıpları yazdırın (cihazda 24 küçük ve büyük delikli 6 kuyu ve cihaz kapağı kapağı vardır) (3D dosyalar eklenmiştir).
- Kültür ortamı (0,5 saat)
- Biyolojik bir kaputun içinde, aşağıdakileri karıştırın (50 mL tüpte): 37 mL Iscove Modifiye Dulbecco'nun Ortası (IMDM), 10 mL KSR serum replasmanı, 1 mL B27 takviyesi, 0,5 mL N2 takviyesi, 0,5 mL 1 M HEPES tamponu ve 0,5 mL esansiyel olmayan amino asitler.
- Tüm ortamı filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
- Boru ve cerrahi takım hazırlama
- Giriş lümen, giriş kuyusu, çıkış lümen ve çıkış kuyusu (12 kısa tüp ve 12 uzun tüp) için uygun boru uzunluğunu kesin. Tüpün her iki tarafına uygun bir adaptör bağlayın.
- Cerrahi aletleri hazırlayın: düz makas, 4x ince kanat ve 2x keskin eleps.
- Tüpleri ve cerrahi aletleri bir otoklav kağıt torbasına yerleştirin ve bir otoklav kullanarak sterilize edin.
- Işıltı girişini hazırlayın (istenen stimülasyon - bakteri, dışkı, ilaçlar vb.).
- Deneyden önce, bakteri kültürünün bakteri yükünü, seri seyreltmeler12ve aerobik ve / veya anaerobik koşullar altında kültürü belirleyin.
- Bakteri yükünü hesapladıktan sonra, gerekli bakteri konsantrasyonu elde etmek için steril doku kültürü ortamında bakteri kültürlerini seyreltin. Dışkı örnekleri için 100 μm süzgeç kullanarak filtreleyin.
NOT: Nonbakteriyel stimülasyon (ilaçlar, metabolitler vb.) için, bağırsak kültürü ortamını kullanarak maddeyi gerekli konsantrasyona seyreltin.
2. Deneme kurulum hazırlığı
- Organ kültürü inkübatörünün içinde, ısıtıcı ünitesini açın ve 37 ° C'ye ayarlayın.
- Pompaların yanı sıra giriş ve çıkış şırınnalarını da kurun.
- Doku kültürü ortam girişi
- Biyolojik veya laminer akış davlumbazında, giriş kuyusu şırınnalarını tam kültür ortamı ile doldurun. Son hacim deneyin süresine ve akış hızına bağlıdır; genellikle 1 mL/h artı temizleme için ek ortam.
- Luer-lock adaptörünü kullanarak tüpleri şırınna bağlayın. Dolu şırınnaları şırınna pompalarına yerleştirin.
- Giriş şırınnalarını temizle. Kuyu ortamının tüm tüplerden atık bir cama aktığından emin olun.
- Işıltılı giriş
- Işınlama giriş şırınglarını stimülasyon tedavisi (bakteri, ilaç vb.) ile doldurun. Hacim, denemenin süresine ve akış hızına bağlıdır (genellikle 30 μL / s artı temizleme için ek ortam).
- Luer-lock adaptörünü kullanarak tüpleri şırınna bağlayın. Dolu şırınnaları şırınna pompalarına yerleştirin.
- Giriş şırınmalarını temizle. Stimülasyonun tüm tüplerden atık bir bardağa aktığından emin olun. Farklı stimülasyonları kirletmemeye dikkat edin.
- Çıkış
- Boş şırıngları çıkış şırıngır pompalarına yerleştirin (pompa modunu 'çekilme' olarak ayarlayın).
- Cihaz kurulumu
- Gaz karışımını (%95 O 2 +%5 CO2)kontrol eden regülatörü hafif ve minimum bir akış için ayarlayın.
- Cihazı laminar kaputta inceleyin.
- İğneleri yıkamak için cihazın iğnelerini steril IMDM ile yıkayın.
- Cihazın her kuyusuna 500 μL steril kültür ortamı ekleyin.
- Doku diseksiyonu için hazırlık
- Steril cerrahi aletleri laminar kaputun içine koyun.
- 10 mL'lik bir şırıngayı steril IMDM ile doldurun ve kolonun yıkanması için steril (otomatik kapatılmış) 22 G künt uçlu bir iğne bağlayın.
3. Organ kültürleri
- Farelerin kurban ve doku diseksiyonu
- Laminar bir başlıkta, 12-14 günlük fareleri kafa keserek kurban edin. Fareleri% 70 etanol ile püskürtün ve fareleri plastik bir tabağa yerleştirin.
- Keskin makas ve tokmaklar kullanarak fareyi parçalara ayırın ve tüm yağ ve bağ dokularını keserek sindirim sistemini mideden anüse kadar çıkarın. Kolonu kesin ve yeni bir tabağa yerleştirin.
NOT: Kolon dokusu ile teması en aza indirin. Kolon dokusunun orta kısmına dokunmayın. Dokuyu nazikçe ve sadece dokunun kenarlarında tutun.
- Kolon yıkama ve yıkama
- Diseksiyon mikroskobu altında, kolon içeriğini steril IMDM (proksimal tarafa) ile hazırlanan 10 mL şırıngayla (adım 2.7.2) hafifçe yıkayın. Dışkıyı bağırsak dokusundan çıkardıktan sonra, kolonu 0,5 mL steril IMDM ile dolu yeni bir 6 kuyu plakasına yerleştirin.
- İki nokta üst üste aygıtı bağlama
- Dokuyu alın ve 22 G iğneye dikkatlice bağlayın ve iki iplikle sıkı bir bağ yapın. Bu noktada, kolonun lümen akışına doğru yönelimini korumak zorunludur (proksimal = giriş, distal = çıkış). 6 doku için de 3.2-3.3 adımlarını tekrarlayın.
- Giriş iğnesi Luer kilitlerinin ortamdan boş olduğunu doğrulayın. Değilse, boşaltın. Giriş iğnesi Luer kilidine stimülasyonlar ekleyin (hava kabarcıklarının lümene girmesini önlemek için). Uygun uyarılma ile her iki nokta üst üste için bu adımı tekrarlayın.
- Tüm dokuların bağlı olup olmadığını kontrol edin ve kapak kapağını cihazın üzerine yerleştirin.
- Organ kültürü cihazının pompalara bağlanması
- Cihazı önceden ısıtılmış sıcaklık kontrollü odaya (37 °C) yerleştirin.
- Gaz akışını bağlayın
- Uygun giriş iğnesini kullanarak gaz adaptörünü kapak kapağına bağlayın.
- Giriş ve çıkış tüplerini cihaza bağlayın.
NOT: Proksimal kolon tarafını giriş küvetlerine bağlayın.
- Lümeni stimülasyon girişleriyle arındırın.
- Işıklı stimülasyonu bağırsaktan hafifçe geçirin ve çıkış tüplerindeki orta akışı doğrulayın.
- Harici ortamı yıkayın.
- Harici ortamı 3 kez yıkayın (pompaları hem giriş hem de çıkış için 600 μL/ dk hızında ayarlayın). Her yıkama 1 dakika sürer (kuyuyu boşaltarak başlar).
- Deneye başlayın.
- Pompaları aşağıdaki oranlarda başlatın:
Akış hızı: lümen: giriş- 30 μL/h, çıkış- 35 μL/h
Harici ortam: giriş- 1000 μL/h, çıkış- 950 μL/h
NOT: Deneme süresi 30 dakika ile 24 saat arasında değişebilir.
- Pompaları aşağıdaki oranlarda başlatın:
- Deney sonu (kolon organ kültürleri için 24 saate kadar)
- Tüm tüpleri cihazdan çıkarın.
- Dokuları iğnelerden ayırın ve istenen okumalara devam edin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bağırsak organ kültürü sistemi doku canlılığını korur ex vivo. Doku canlılığının değerlendirilmesi kültür dönemi boyunca yapıldı. Kolon dokusu parçaları bağırsak organ kültürü sisteminde inkübe edildi ve 2/12/24 saat kültürü takiben sabitlendi. Bağırsak epitel hücre (IEC) tabaka bütünlüğü E-cadherin ve sitokeratin-18 antikorları kullanılarak immünofluoresans lekelenmesi ile doğrulandı. Aynı şekilde, ki-67 boyama ile belirtildiği gibi, kolonik epiteldeki mukus dolu kadeh hücreleri ve lümen içindeki mukus salgısı...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede, Yissachar ve arkadaşlarının yakın zamanda geliştirdiği ex vivo gut organ kültürleri için optimize edilmiş bir protokol açıklanmaktadır(yayınlanan 9 ve yayınlanmamış veriler). Bağırsak organ kültürü sistemi, parlak akışı korurken sağlam bağırsak parçalarının çok yönlü kültürünü destekler. İl içi ve ekstra-luminal ortam (stimülasyon dozu, maruz kalma süresi ve akış hızı dahil) üzerinde tam kontrol sağlar ve naif bağırsak dokusu yapısını ve hücresel karmaşıklığını korur
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Yissachar laboratuvarının geçmiş ve şimdiki üyelerine bağırsak organ kültürü sistemi protokolünü optimize etmedeki değerli katkıları için teşekkür ederiz. Yael Laure'ye makalenin eleştirel düzenlemesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma İsrail Bilim Vakfı (3114831 No. hibe), İsrail Bilim Vakfı - Broad Institute Ortak Programı (8165162 Sayılı hibe) ve gassner Tıbbi Araştırma Fonu, İsrail tarafından desteklendi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Cihaz< / güçlü> | |||
| 18 Ölçer Künt İğne | Mcmaster | 75165a754 | |
| 22 Ayar Künt İğne | Mcmaster | 75165a758 | |
| Çok Amaçlı Yapıştırıcı Selant %100 Silikon | DAP | 688 | |
| Kübik Vakum Kurutucu VDC-21 + 2 Raflı | AAAD4021 | ||
| Cam Slayt 1 mm Kalın | Corning | 2947-75X50 | |
| Mini İnkübatör im-10 | AAH24315K | ||
| MPC 301E Vakum POMPASI | VI-412711 | ||
| Plastik Hızlı Dönüşlü Boru Bağlantı Fişleri | Mcmaster | 51525k121 | |
| plastik Hızlı Dönüşlü Boru Bağlantı Soketleri | Mcmaster | 52525k211 | |
| Sylgard 184 Silikon Elastomer | Dow | Polidimetilsiloksan, PDMS | |
| Boru | Mcmaster | 6516t11 | |
| Zortrax M200 | Zortrax | Zortrax Z-SUITE, Autodesk Fusion 360 | |
| Zortrax M200 Malzemeler: z-ultrat | Zortrax | ||
| Orta | |||
| B27 Takviyesi (50x), Serum İçermeyen | Thermo Fisher Scientific | ||
| HEPES Tamponu (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | |
| Iscove'un Fenol Kırmızısı İçeren Modifiye Dulbecco'nun Ortamı (1x) | Thermo Fisher Scientific | 12440061 | |
| Nakavt Serumu | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| N2 Takviyesi (100x) | Thermo Fisher Scientific | A1370701 | |
| Olmayan Esansiyel Amino Asit (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Cerrahi Aletler | |||
| Büyük Makas | Aseltech | 11-00-10 | |
| Keskin Forseps | FST | 11297-10 | |
| İpek Örgülü Cerrahi İplik | SMI | 8010G | |
| Düz Makas | FST | 14091-09 | |
| İnce Forseps | FST | 11051-10 | |
| Organ Sistemi< / güçlü> | |||
| 0.1 ve mikro; m | Filtre Ömrü Geni | ||
| 0.22 ve mikro; m Filtre | Ömrü Geni | ||
| 5 mL Luer Kilit Şırınga | BD | 309649 | |
| Greenough Stereo Mikroskop | ZEISS | Stemi 305 | |
| Devridaim Hassas Hava Isıtıcı "CUBE" | CUBE-2-LIS Şırınga | ||
| Pompası | Yeni Dönem Pompa Sistemleri A.Ş | NEP-NE-1600-EM |
Kaynaklar
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Pearce, S. C., et al. Intestinal in vitro and ex vivo Models to Study Host-Microbiome Interactions and Acute Stressors. Frontiers in Physiology. 9 (1584), (2018).
- Hooper, L. V., et al. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science. 291 (5505), 881-884 (2001).
- Haller, D., et al. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. 61 (7), 1007-1015 (2012).
- Gazzaniga, F. S., et al. Harnessing Colon Chip Technology to Identify Commensal Bacteria That Promote Host Tolerance to Infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 638014(2021).
- Yissachar, N., et al. An Intestinal Organ Culture System Uncovers a Role for the Nervous System in Microbe-Immune Crosstalk. Cell. 168 (6), 1135-1148 (2017).
- Duscha, A., et al. Propionic Acid Shapes the Multiple Sclerosis Disease Course by an Immunomodulatory Mechanism. Cell. 180 (6), 1067-1080 (2020).
- Grosheva, I., et al. High-Throughput Screen Identifies Host and Microbiota Regulators of Intestinal Barrier Function. Gastroenterology. 159 (5), 1807-1823 (2020).
- Blaize, J. F., Corbo, C. P. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Schnupf, P., et al. Growth and host interaction of mouse segmented filamentous bacteria in vitro. Nature. 520 (7545), 99-103 (2015).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Atarashi, K., et al. Th17 Cell Induction by Adhesion of Microbes to Intestinal Epithelial Cells. Cell. 163 (2), 367-380 (2015).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
