Kıkırdak Eksplantlarında Göç ve Alımı İzlemek için Hücre Dışı Veziküllerin Etiketlenmesi

Osteoartrit (OA), eklem kıkırdaklının hücre dışı matrisinin ilerleyici ve geri dönüşü olmayan bir iltihaplanma ve yok edilmesi anlamına gelen eklem dejeneratif bir hastalıktır¹. Çeşitli artrit formları çok sayıda tedaviye sahip olmasına rağmen^2,3,4, bunlar yan etkileri ve sınırlı etkinliği ile kısıtlanır. Erken OA kıkırdak lezyonlarında yaralı kıkırdağın rejeneratif tedavisi için otolog kondrosit implantasyonu kullanılarak doku mühendisliği teknikleri rutin olarak uygulanmaktadır^4. Hücre bazlı tedaviler esas olarak kıkırdağı etkili bir şekilde onarabilen fenotipik olarak stabil kondrositlerin veya kondroprogogenitatörlerin sınırlı sayıda nedeniyle kısıtlanır³. Bu nedenle, hastalığın ilerlemesini önlemek ve büyük kıkırdak lezyonlarını yenilemek için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi son derece önemlidir.

Hücre dışı veziklinler (EV' ler) farklı yazarlar tarafından OA için bir tedavi olarak önerilmiştir^5,6. EV'ler hücre tiplerinin çoğunluğu tarafından salgılanan membranöz cisimlerdir, hücreler arası sinyalizasyonda yer almaktadır ve kök hücrelerin terapötik etkilerini⁷,^8,9, son zamanlarda rejeneratif tıbba ilgi uyandırdıkları gösterilmiştir¹⁰. Mezenkimal stromal hücrelerden (MSC) elde edilen EV'ler, OA için araştırılan ana terapötik EV'lerdir, ancak diğer eklemle ilişkili hücreler EV kaynakları olarak kullanılmıştır, örneğin, kondroprogenitörler veya bağışıklık hücreleri^11,12.

Trombosit lizazları (PL' ler) gibi trombosit konsantreleri, kornea ülserleri^{13 , 14,15}veya tendon dokusu rejenerasyon¹⁶ gibi farklı yaralanmalarda yara iyileşmesini arttırmak için kullanılır, çünkü trombosit konsantrelerinin EV bileşeninin bu etkilerden sorumlu olabileceği hipotezi nedeniyle¹⁷ . Eklemle ilgili hastalıklarla ilgili bazı çalışmalar osteoartrit koşullarını iyileştirmek için tedavi olarak trombosit türevli EV'ler (PL-EV' ler) kullanmaktadır. PL-EV'ler, osteoarthride kondrojenik belirteçlerin ekspresyonunu teşvik eden Wnt/β-catenin yolu^18'ietkinleştirerek kondrosit çoğalmasını ve hücre göçünü iyileştirir veya PL-EV'lerle tedavi edilen osteoartritli tavşanlarda daha yüksek kondrojenik protein seviyeleri ve daha az tissular anormallik gösteren¹⁹.

EV'ler, hedef hücreye serbest bırakılan proteinler, lipitler ve nükleik asitler içerir ve terapötik uygulamalarıyla ilgili ana özellik olan hücreden hücreye iletişim kurar²⁰. EV'lerin etkileri, hücrelere ulaşmalarına ve daha sonra kargo salınımlarına bağlıdır. Bu etki, metabolik aktivite veya gen ekspresyon modifikasyonu gibi hücrelerde neden olduğu değişikliklerle dolaylı olarak doğrulanabilir. Bununla birlikte, bu yöntemler, EV'lerin işlevlerini uygulamak için hücrelere nasıl ulaştığının görselleştirilmesine izin vermez. Bu nedenle, bu makale, iltihaplı OA kıkırdak eksplantları için bir tedavi olarak kullanılacak bu PL türevi EV'leri etiketlemek için bir yöntem sürmektedir. Konfokal mikroskopi, EV alımını ve eksplantlarda bulunan kondrositlere ilerlemeyi 5 saatlik bir zaman atlamalı olarak izlemek için kullanıldı.

NOT: Projenin CEI-IB (IB 3656118 PI) tarafından etik olarak onaylanmasından sonra kurumsal yönergelere uygun olarak IdISBa Biobank'tan (IB 1995/12 BIO) kıkırdak eksplantları alınmıştır.

1. Sütun hazırlama

1. Üreticinin talimatlarını izleyerek veya aşağıdaki gibi sütunları dengele:
   1. Sütun kapağını çıkarın ve sütunu dengeleyin. Depolama arabelleği elution ile çıkarın.
   2. Kolonu 2,5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kez yıkayın. Her yıkama sırasında, sütunun tüm birimi emmesini bekleyin.
      NOT: Sütunun kurumasına izin vermeyin.
   3. Son yıkamadan sonra ve numune hazırlığına kadar sütunu kapakla örtün.

2. EV etiketleme

NOT: Bu EV etiketleme protokolü, daha önce boyut dışlama kromatografisi (SEC) tarafından yalıtılmış, daha önce açıklanan koşullar^21,22olan bir PL-EV örneği kullanır. Ancak, herhangi bir kaynaktan herhangi bir EV örneği bu iletişim kuralıyla kullanılabilir.

1. EV örneğini ve kontrolü (PBS) konsantre bir tüp kullanarak konsantre edin.
   1. Numuneleri, EV numunesinin başlangıç hacmine bağlı olarak 15 mL veya 500 μL konsantre tüpüne yerleştirin. Neredeyse kuru bir numune elde edilene kadar tüpleri üreticinin talimatlarına göre santrifüjlayın.
      NOT: Kontrol örneği herhangi bir boya arka planını kontrol etmek için gereklidir. Bu yöntem belirli bir başlangıç hacmi gerektirmemese de, arıtma adımları sırasında parçacıkların yaklaşık% 10'unun kaybedileceği düşünülmelidir.
2. Konsantre numuneleri 200 μL'lik seyreltici C. Resuspend EV numuneleri ve 100 μL'lik kontrol grubu ile yeniden satınlayın ve yeni 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın.
3. EV örneğini 100 μL'lik iki aliquot'a ayırın, birini boya ile işaretleyin ve tedavi olarak kullanın (PKH-PL-EV); diğerini işaretsiz bırakın, ancak EV örneği gibi işleyin (NTA-PL-EV) ve EV konsantrasyonu NTA ile ölçmek için kullanın.
4. Seyreltici C'de 8 μM PKH26 çözeltisi ile sonuçlanan 2x boya çözeltisi hazırlayın.
5. Numunede 125 μL seyreltici C başına 1 μL 1 mM PKH26 bağlayıcıyı karıştırın. Örneklere 1:1 oranında eklemek için gereken bir birim hazırlayın.
6. PKH-PL-EV'ye 2x boya çözeltisi ekleyin ve 1x boya konsantrasyonu ve 4 μM PKH26 konsantrasyonu elde etmek için numuneleri 1:1 oranında kontrol edin. NTA-PL-EV örneğine aynı miktarda PBS ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
7. Numunelere %5 sığır serum albümin-PBS solüsyonunun 1:1 oranında eklenmesini sağlayın ve son hacmin ~400 μL olduğundan emin olun.
   NOT: Bu adım, spesifik olmayan boya etkileşimlerinin veya ilişkisiz boyaların kaldırılmasını sağlar.
8. Etiketli EV'leri, boyanın sütunla ilişkisiz boyasından ve spesifik olmayan etkileşimlerinden ayırmaya devam edin.

3. Etiketli-EV yalıtımı

1. Kapağı sütundan çıkarın, numunenin 400 μL'sini ekleyin (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV veya kontrol) ve elde edilen tüm sıvıyı atın.
2. Sonraki adıma geçmeden önce örneğin sütunu tamamen girmesini bekleyin. 600 μL PBS ekleyin ve tüm eluted sıvıyı atın.
3. Bir sonraki adıma geçmeden önce PBS'nin sütunu tamamen girmesini bekleyin. 600 μL PBS ekleyin ve 1,5'te 600 μL'lik bir fraksiyon toplayın. mL santrifüj tüpü (EV'ler veya kontrol).
   NOT: Fazla boyayı numunelerden çıkarmak için bu adımlar gereklidir. Daha saf EV'ler elde etmek için sütuna göre başka bir ayırma gereklidir. Bu nedenle, aşağıdaki adımlar yeni bir eşkenel sütunda (adım 4.1.) veya ilk yıkama adımından sonra aynı sütunda (adım 4.2) gerçekleştirilmelidir.
4. Daha saf EV'ler elde etmek için sütunu yeni bir EV ayırma adımına hazırlayın. Yeni bir sütunsa, 2.1 adımlarını yineleyin. ve 2.2. Aynı sütunsa, sütunu % 20 izopropanol 2,5 mL ile yıkayın ve ardından 2.1 ve 2.2 adımlarını tekrarlayın.
5. Sütuna 2,5 adımda elde edilen daha önce elflenmiş 600 μL EV ekleyin ve elde edilen birimi atın. Bir sonraki adıma geçmeden önce sıvının sütuna tamamen girmesini bekleyin.
6. 400 μL PBS ekleyin ve tüm zorlanmış birimi atın. Bir sonraki adıma geçmeden önce sıvının sütuna tamamen girmesini bekleyin.
7. 600 μL PBS ekleyin ve 1,5 mL santrifüj tüpünde 600 μL'lik bir fraksiyon toplayın. Daha fazla analiz için EV'leri ve kontrol örneklerini kullanın veya gece boyunca 4 oC'de saklayın.
8. Kullanılan sütunları ileride kullanılmak üzere depolayın.
   1. Sütunu % 20 izopropanolden 25 mL ile yıkayın ve elde edilen hacmi atın. Sütunu 2,5 mL PBS ile 3 kez yıkayın.
   2. 1.1.1 adımında kaldırılan depolama arabelleği ekleyin ve arabelleğin sütuna girmesini bekleyin. Sütunu kapakla örtün ve sonraki kullanıma kadar 4 oC'de saklayın.

4. EV nicelemesi

1. Aşağıdaki iki adımda açıklandığı gibi NTA-PL-EV örneğinin ve ilk PL-EV örneğinin 1:1.000 seyreltmesini hazırlayın.
   1. 0,2 μm filtreden süzülmüş PBS ile 1:10 seyreltilmiş NTA-PL-EV'nin 1 mL'si ve 1:10 seyreltilmiş ilk PL-EV'nin 1 mL'si hazırlayın.
   2. 0,2 μm filtreden süzülen PBS ile önceki seyreltilmiş numunelerin 1:100 seyreltilmesinin 1 mL'sini hazırlayın.
2. 1:1.000 seyreltilmiş NTA-PL-EV örneğini veya ilk PL-EV örneğini steril bir şırınna kullanarak NTA pompasına enjekte edin. Parçacık konsantrasyonu ve boyut dağılımı belirleme için üreticinin talimatlarını ve önerilerini izleyin.
   NOT: EV konsantrasyonu numune marş hacmine bağlı olduğundan, doğru bir NTA tayini elde etmek için ara seyreltmeleri okumak ve ayarlamalar yapmak gerekebilir.

5. İltihaplı OA için tedavi olarak kullanılan EV'ler

1. Kıkırdağı PBS ile iki kez yıkayın ve steril koşullar altında 3 mm çapında biyopsi zımbası kullanarak kesin.
   NOT: Hücre kültürü başlığındaki 5.1 ile 5.6 adımlarındaki yordamı gerçekleştirin.
2. Eksplantları 37 oC'de%1 penisilin-streptomisin, %5 CO 2 ve %80 nem ile desteklenmiş DMEM-F12 ortamına sahip₉₆kuyu kültür plakasına yerleştirin.
   1. İnflamasyon odaklı bir OA modeli oluşturmak için hücre kültürü ortamını 10 ng/mL onkostatin M ve 2 ng/mL tümör nekroz faktörü-alfa (TNFα) ile destekleyin.
3. Eksplantları 1 × 10⁹ partikül/etiketli EV kuyusu (PKH-PL-EV) ile tedavi edin veya onkostatin M ve TNFα ile desteklenmiş hücre kültürü ortamında kontrol edin.
   NOT: 1 × 10⁹ parçacık/kuyu içeren numunenin hacmini ölçün ve kontrol için aynı hacmi kullanın.
4. Ortamı kıkırdak eksplantları içeren 96 kuyu hücre kültürü plakalarından çıkarın. Her kuyuya 5,3 adımda açıklanan hücre kültürü ortamının 200 μL'lik kısmını ekleyin.
   NOT: 96 kuyu plakaları fetal sığır serumu (FBS) ile temas etmişse, FBS'den EV'leri çıkarmak için her birini 200 μL PBS ile üç kez yıkayın.
5. Tüp bebek testini farklı zamanlarda durdurun: 0, 1, 2, 3, 4 ve 5 saat.
6. Kıkırdak eksplantlarını içeren hücre kültürü kuyularını 200 μL PBS ile iki kez yıkayın.
7. 4 oC'de 3 saat sabitlemek için dokuya 100 μL% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyin.
   NOT: PFA ile ilgili adımlar, Güvenlik Veri Sayfası önerilerini izleyerek duman kaputunda gerçekleştirilmelidir.
8. PFA'yı çıkarın, 100 μL PBS ekleyin, sabit dokuyu 4 °C'de saklayın ve numuneleri 48 saat içinde işleyin.

6. Mikroskopi hazırlama ve görselleştirme

NOT: Bu histolojik işlem dehidrasyon, parafin gömme ve rehidrasyon adımlarından oluşur. Bu adımlar genel boya floresanını azaltabilir (PKH26 veri sayfası'nda belirtilen bir sınırlama). Bu nedenle, dondurulmuş kesitleme gibi diğer prosedürler konfokal mikroskopi ile EV görselleştirme için daha uygun olabilir.

1. Sabit dokuları parafin bloklarına gömün. Dokuyu 6 μm kalınlığında bölümlere kesin.
2. Doku bölümlerinin deparaffinize.
   NOT: Ksilen kullanan tüm adımlar duman kaputunda yapılmalıdır.
   1. Doku bölümlerini 30 dakika ksilen, 2 dakika için% 100 etanol, 2 dakika için% 96 etanol, 1 dakika için% 75 etanol ve son olarak 30 s damıtılmış suya daldır.
3. Doku bölümlerini permeabilize edin.
   1. Dokuya nüfuz etmek için % 0.1 Triton-% 0.1 sodyum sitrat çözeltisi hazırlayın. Her doku bölümüne 20 μL'lik bir damla ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatır. Her bölümü 20 μL PBS ile iki kez yıkayın.
4. Mikroskobik bir slaytta, floresan korumak için sulu bir montaj ortamı ile 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) içeren bir damla montaj ortamı ekleyin. Adım 6.3.1'den itibaren 3 doku bölümü içeren slaydı örtün.
5. Slaytları oda sıcaklığında gece boyunca inkübte edin, ışıktan kornun.
6. Konfokal mikroskopiye kadar ışıktan korunarak 4 °C'de saklayın.

Şekil 1'de EV etiketleme ve alım izleme için şematik bir genel bakış görüntülenir. Tablo 1'de NTA tarafından tespit edilen parçacık konsantrasyonu ve EV boyutu, sütunla etiketlendikten sonra iki kez gerçekleştirilen saflaştırma adımı nedeniyle ev konsantrasyonunun işlem sırasında azaldığını göstermektedir. Bununla birlikte, elde edilen miktar, tedavi için kullanılacak partikül sayısının en uygun aralığındadır. Bu parçacık konsantrasyonu, osteoartrit kıkırdak eksplantlarını tedavi etmek için kullanılan PKH-PL-EV ve kontrol hacmini hesaplamak için kullanılır.

Kıkırdak eksplantları EV'ler veya kontrol grubu ile tedavi edildikten sonra, farklı süreler için sabitlenir: 0, 1, 2, 3, 4 ve 5 saat. Her grup daha sonra parafinize edilir, dilimlendi ve DAPI içeren bir montaj ortamı ile konfokal mikroskopi için hazırlanır. Her zaman noktasındaki her grup için temsili görüntüler Şekil 2'de sunulmuştur, EV'lerin kondrositlere ulaşana ve zaman içinde girene kadar dokuya nasıl girdiğini gösterir.

Şekil 2'degörüldüğü gibi, etiketli EV'ler 1 saat inkübasyondan sonra (PKH26 boyası ile kırmızı renkte gösterilmiştir) kondrositlerin etrafında (DAPI boyama ile mavi renkte gösterilmiştir) lokalizedir. EV'leri olmayan ancak EV örneğiyle aynı protokolden sonra işlenen kontrol grubu için kalıntı boyası nedeniyle bazı arka planlar gözlemlenebilir. Bu sonuçlar, burada gösterildiği gibi in vitro tahlillerde ve in vivo deneylerde doku yoluyla göçlerini izlemek için kullanılabilecek EV'leri etiketleme protokolünün başarısını doğrulamaktedir.

Şekil 1: EV etiketleme ve alım izleme protokolü için şematik genel bakış. Kısaltmalar: PBS = fosfat tamponlu salin; EV = hücre dışı veziklin; RT = oda sıcaklığı; BSA = sığır serum albümin; NTA = nanopartikül izleme analizi; OA = osteoartrit; TNFα = tümör nekroz faktörü-alfa; PL = trombosit lisat; PFA = paraformaldehit; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Ev alımının farklı zamanlarda temsili görüntüleri. PKH etiketli EV'lerle veya bir kontrol grubuyla inkübe edilen 0, 1, 2, 3, 4 ve 5 saatlik osteoartrit kıkırdak eksplantlarından sonra çekilen konfokal temsili görüntüler. Görüntüler 400x'te çekildi. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: OA = osteoartrit; PL = trombosit lisat; EV = hücre dışı veziklin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Nanopartikül izleme analizi ile karakterizasyon. Kısaltmalar: OA = osteoartrit; PL = trombosit lisat; EV = hücre dışı veziklin; NTA = nanopartikül izleme analizi.

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.