Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Xenopus laevis Embriyolarının Blastocoele'sine Salgılanan Dönüşüm Faktörü ß Aile Bölünmesi Ürünlerinin Analizi

1.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62782

⸱

21 Temmuz 2021

 , 
1Department of Neurobiology, University of Utah, 2Departments of Neurobiology and Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Hematologic Malignancies, University of Utah, School of Medicine

Bu makalede

Özet

Büyüme Faktörü ß aile öncül proteinlerinin dönüştürülmesi Xenopus laevis embriyolarında ektopik olarak ifade edildiğinde, küçülürler, bölünürler ve erken gastrula aşamasına geç blastülde başlayan blastokoele salgılanırlar. İmmünoblot analizi için blastocoele boşluğundan dekolte ürünlerini aspire etmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

Sırasıyla Tgfß/Nodal veya Bone morfogenetik protein (Bmp) ligandları tarafından temsil edilen Transforming Growth Factor ß (Tgfß) süper familyasının iki kolu embriyonik gelişim ve yetişkin homeostazında önemli roller oynar. Tgfß ailesinin üyeleri, endoplazmik reticulum içinde küçülen ve katlanan etkin olmayan öncüller olarak yapılır. Öncü daha sonra ligand ve prodomain parçalarına bölünür. Sadece dimerik ligand Tgfß reseptörlerini çalıştırabilse ve aşağı akış sinyalini etkinleştirebilse de, prodomain moiety'nin ligand aktivitesine katkıda bulunduğu giderek artan bir tanıma vardır. Bu makalede, Tgfß öncül proteinlerinin aktivasyonu sırasında oluşturulan bölünme ürünlerini tanımlamak için kullanılabilecek bir protokol açıklanmaktadır. RNA kodlama Tgfß öncülleri ilk olarak X. laevis embriyolarına mikroenjected edilir. Ertesi gün, gastrula evre embriyolarının blastokoelesinden dekolte ürünleri toplanır ve Batı lekeleri üzerinde analiz edilir. Bu protokol nispeten hızlı bir şekilde tamamlanabilir, pahalı reaktifler gerektirmez ve fizyolojik koşullar altında konsantre Tgfß dekolte ürünleri kaynağı sağlar.

Giriş

Transforming Growth Factor ß (Tgfß) süper aile üyeleri aktif olmayan, küçültücü öncül proteinler olarak sentezlenir. Öncüller daha sonra proprotein convertase (PC) ailesinin üyeleri tarafından salgı yolu içinde veya hücrelerin dışında bölünür. Bu aktif, disülfid bağlı ligand dimer ve iki prodomain parçaları oluşturur1. 30 yılı aşkın bir süredir bilinmesine rağmen, Tgfß ailesinin öncüllerinin prodomaininin aktif bir ligand oluşturmak için gerekli olduğuve 2, prodomainlerin ligand işlevine nasıl katkıda bulunduğuna dair anlayış eksiktir.

Tgfß aile üyelerinin proteolitik aktivasyonu sürecinin anlaşılması eksik kalsa da,hangi PC konsensüs motiflerinin vivo olarak bölündüğünü , dekoltenin belirli bir hücre altı veya hücre dışı bölmede gerçekleşip gerçekleşmediğini ve prodomain'in bölünen ligand3ile birlikte tutarlı veya yaygın olmayan bir şekilde kalıp kalmadığını anlamaya olan ilgi artmaktadır. Çeşitli çalışmalar, prodomain'in sadece4,5bölünmeden önce ligand katlamayı yönlendirdiğinideğil,aynı zamanda büyüme faktörü stabilitesini ve eylem aralığını da etkileyebileceğini göstermiştir 6,7,8,9, homodimer veya heterodimers oluşumunu yönlendirir10, ligand gecikmesini korumak için ligand'ı hücre dışı matrise tutturmak11ve bazı durumlarda, heterologu etkinleştirmek için kendi başına bir ligand işlevi görmek sinyal12. Tgfß ailesinin birçok üyesinin prodomain içindeki heterozipöz nokta mutasyonları, insanlarda göz, kemik, böbrek, iskelet veya diğer kusurlarla ilişkilidir3. Bu bulgular, prodomain'in aktif bir ligand oluşturma ve sürdürmedeki kritik rolünü vurgulamakta ve Tgfß ailesinin öncüllerinin proteolitik olgunlaşması sırasında geliştirilen dekolte ürünlerinin rolünün tanımlanması ve deşifre edilmesi önemini vurgulamaktadır.

Burada, X. laevis embriyolarının blastokoele'sinden Tgfß ailesi öncüllerinin olgunlaşması sırasında üretilen ve daha sonra immünoblotlarda analiz edilen dekolte ürünlerinin aspirasyonu için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, öncül proteindeki bir veya daha fazla PC konsensüs motifinin in vivo10 ,13,her motifi13,14'ü ayıran endojen PC'leri tanımlayıp ayırmadığını belirlemek içinkullanılabilir., Tgfß ailesi homodimerlerinin in vivo oluşumunu heterodimerler10 ile karşılaştırın veya Tgfß öncüllerindeki insan hastalığı ilişkili nokta mutasyonlarının fonksiyonel dimerik ligand oluşturma yeteneklerini etkileyip etkilemediğini analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Açıklanan tüm prosedürler Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Kurbağalar IACUC onaylı bir tesiste barındırılıyor. Erkek kurbağalar, kalbin ventrikülünü kırparak trikaine daldırarak ötenaziye tabi tökezlenir. Dişi kurbağalar, yumurta toplanmasına izin vermek için yumurtlamanın hormonal indüksiyonunu takiben laboratuvarda en fazla 24 saat boyunca barındırır ve daha sonra bakım tesisine geri döner.

1. X. laevis Testis Koleksiyonu

  1. Cinsel olarak olgunlaşmış bir erkeği% 0.2 Tricaine 'de (Tablo 1) 30-40 dakika boyunca uyuşturun, ta ki hayvan pençe sıkışmasına tepkisiz olana kadar.
  2. Cildi vücut duvarından uzaklaştırmak için künt tokmaklar kullanın. Cerrahi makas kullanarak alt karın boyunca ciltte yatay bir kesi yapın. Alttaki vücut duvarında paralel bir kesi yapın ve ardından göğüs kafesi boyunca vücut duvarından üçüncü, dik bir kesi yapın.
    1. Elde eden kapakları katlayın, kalbin ventrikülünün yerini bulun ve tabanı eksanguinate etmek ve ölümü sağlamak için kırpın.
  3. Sarı yağ gövdelerini künt toparlamalarla karından çıkarın ve yağ kütlelerinin tabanının altında kalan her iki taraftaki testisleri bulun. Her testisleri, cerrahi makas kullanarak yağ gövdelerinden ve bağlı herhangi bir visseradan keserek çıkarın.
  4. Testisleri 1x Modifiye Barth Çözümü (MBS) içeren bir Petri kabına aktarın (Tablo 1). Herhangi bir yapışık kan damarlarını veya bağlı visserayı durulayın ve çıkarın.
    1. Bir testisi hemen kullanım için testis tamponu(Tablo 1)içeren 35 mm Petri kabına aktarın ve diğerini daha sonra kullanmak üzere testis tamponu ile dolu 10 mL konik bir tüpte saklayın. Testis kullanılmadığında 4 °C'de saklanmalıdır ve en az iki hafta boyunca canlı kalacaktır.
      NOT: Testis izolasyonunun fotoğrafları Referans 15'te bulunabilir.

2. X. laevis Yumurtalarının Toplanması ve Döllenmesi

NOT: Kurbağalar, kurbağaları kullanmadan önce ve sonra yıkanmış vinil eldivenler veya ellerle ele alınmalıdır. Lateks eldivenler, losyonlar ve insan ellerindeki deterjan kalıntıları kurbağaların kırılgan cildine zarar verecektir.

  1. Yumurtlamadan önceki akşam, 26 G iğne ile donatılmış 1 mL şırınga kullanarak iki veya üç olgun X. laevis dişinin sırt lenf kesesine 0,3 mL (1200 IU) insan koryonik gonadotropin(Tablo1) enjekte edin. Her enjeksiyon için yeni bir iğne kullanın.
  2. Enjeksiyondan sonra, dişileri 18 °C biyolojik inkübatöre kapalı bir kaba (hava geçirmez değil) yerleştirin. Yumurtlama genellikle 14-16 saat sonra başlar.
    NOT: Kapağı kesilmiş plastik çekmeceler veya plastik kaplar, kadınları bir gecede tutmak için iyi çalışır. Kurbağaların kuluçka makinesinden kaçmasını ve kurumasını önlemek için kapağın sıkıca açık olduğundan emin olun.
  3. Dişiyi 1x MBS içeren 100 mm Petri kabının üzerinde tutun ve yumurtaları yemeğe dışarı çıkarmak için kurbağanın karnına hafif basınç uygulayın.
  4. Testislerin küçük bir parçasını (~1/5) jilet kullanarak kesin ve ~500 μL 1x MBS içeren 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Bir pelet pestle veya doku homojenizatör ile ezin. Elde eden sperm süspansiyonunu aynı gün içinde sonraki döllenme için buzda veya 4 °C'de saklayın.
  5. 100 mm Petri kabını 1x MBS'den mümkün olduğunca fazla dökmek için eğin ve geri kalanını plastik bir transfer pipet kullanarak çıkarın. Yaklaşık 100 μL sperm süspansiyonu uygulayın, yaklaşık 1 mL 0.1x MBS ekleyin ve karıştırmak için döndürün.
    1. 5 dakika sonra, yemeği dechlorinated musluk suyu veya 0,1x MBS ile doldurun ve 30 dakika bekletin.
      NOT: Su bir filtre kullanılarak dechlorinated veya belediye musluk suyu, klorun suya geleneksel klorun eklendiği bölgelerde dağılmasına izin vermek için en az 24 saat boyunca açıkta bırakılabilir. İçme suyunu dezenfekte etmek için kloramin eklendiği bölgelerde, su bunun yerine kloramini parçalayabilecek ticari olarak mevcut bir saç kremi ile muamele edilmelidir.
      NOT: Yumurtalar, döllenmeye engel olacak bir jöle kat oluşumunu önlemek için yüksek tuz çözeltisinde (1x MBS) toplanır. Gübrelemeden sonra, düşük tuz çözeltisi (deklore su veya 0,1 kat MBS) jöle kat oluşumuna izin verir ve yumurtalar birbirine ve yemeğe yapışır. Döllenmiş yumurtalar, pigmentli hayvan direğinin 30 dakika içinde yukarı doğru yüzleştiği şekilde dönecektir. Bu olmazsa ve yumurtalar mikroskop altında sağlıklı görünüyorsa, sperm canlılığı şüphelidir ve yeni testisler hasat etmek gerekebilir.
  6. Yumurtaları kaplayan çözeltiyi dökün ve Petri kabını taze hazırlanmış% 2 sistein çözeltisi ile doldurun (Tablo 1). Çözeltiyi, jöle kat çözünene ve yumurtalar artık birbirine veya yemeğe yapışmayana kadar 3-5 dakika boyunca tabakta döndürün.
    1. Kabı eğin ve sistein çözeltisini dikkatlice dökün veya plastik bir pipetle çıkarın. 1x DeBoer gölet suyu ile değiştirin (Tablo 1). Durulamak ve dekant için döndürün.
    2. DeBoer'ın çözeltisiyle bir yıkamayı, biri 0,1x MBS ile tekrarlayın ve kabı 0,1x MBS ile yeniden doldurun. Jöle katını çıkardıktan sonra, yumurtalar daha kırılgan hale gelir ve hava sıvısı arayüzüne maruz kalmamalıdır.
  7. Döllenmiş yumurtaları 16 °C biyolojik inkübatöre taşıyın veya oda sıcaklığında tezgahta bırakın. Oda sıcaklığında bırakılırsa, ilk bölünme döllenmeden 1-1,5 saat sonra meydana gelir ve sonraki bölünmeler yaklaşık her 30 dakikada bir gerçekleşir. Bunun aksine, embriyolar 15-16 ° C'de inkübe edilirse, bölünmeler kabaca her saat başı meydana gelir ve belirli bir yumurtlamadan daha fazla sayıda embriyo enjekte etmek mümkün olacaktır.

3. X. laevis Embriyolarının Mikroenjeksiyon

  1. Cam kılcal damarları aşağıdaki ayarlarla bir mikropipette çekme kullanarak ince bir noktaya ısıtın ve çekin: İki adımlı çekme; Isı 1: 67.4 °C; Isı 2: 62 °C.
    NOT: Bu ayarlar burada kullanılan mikropipette çekme ve cam kılcal damarlar içinözeldir( Malzeme Masası ).
  2. Bir diseksiyon mikroskobu altında, Dumont #5 tokalarını kullanarak sonuna yakın çekilmiş bir iğnenin ucunu kırpın. İğne keskin olmalı, ancak embriyoya temas ettiğinde ucu bükülecek kadar ince olmamalıdır. Şekil 1, mikroenjeksiyon (A) için kırpılmış olmayan ve kırpılmış (B) uygun şekilde çekilmiş bir iğne örneği göstermektedir.
  3. İğneyi bir mikroenjektöre bağlı bir iğne tutucuya yerleştirin. İğne tutucuyu bir mikromanipülatöre takın. Tgfß öncül proteinini, küçük bir parafilm parçası üzerinde incelenme mikroskobu altında analiz edilecek şekilde 2-4 μL kapaklı sentetik RNA kodlayın.
    1. Mikromanipülatörü kullanarak, iğneyi damlaya küçümseyin ve RNA'yı iğneye aspire etmek için mikroinjektördeki dolgu işlevini kullanın. İğneyi damla yüzeyinin altında tuttuğunuzdan emin olun ve iğneye hava girmesini önlemek için mikroskop altında ilerlemeyi izleyin.
      NOT: Analiz edilecek Tgfß öncüsünün prodomain ve/veya ligand etki alanını tanıyan antikorlar mevcut değilse, bir epitop etiketini (örneğin, V5, myc, Flag) kodlayan sıra, RNA transkripsiyon için şablon olarak kullanılacak cDNA'ya çerçeve içine eklenebilir. Etiketli proteinin in vivo biyoaktivitesi, epitopun uygun katlama, bölünme veya aktiviteye müdahale etmediğinden emin olmak için etiketlenmemiş proteinle karşılaştırılmalıdır.
  4. RNA çözeltisinin bir damlasını havaya fırlatın ve enjeksiyon aşamasına veya mikroskobun göz merceğine monte edilmiş bir mikrometre kullanarak düşme boyutunu ölçün. Mikroenjektör üzerindeki zaman ve basınç kontrollerini kullanarak düşme boyutunu yaklaşık 10 nL'ye ayarlayın.
    NOT: 5-20 ng/μL aralığındaki RNA konsantrasyonları her embriyoya 50-200 pg RNA vermek için uygundur. Bu miktarda RNA genellikle 10-20 embriyodan aspiratlardaki bölünme ürünlerini tespit etmek için yeterlidir. İmmünoblotlarda tespit edilebilir bir sinyal veren en düşük RNA dozunu hedeflemek en iyisidir. Daha yüksek miktarda RNA, blastokoelenin genişlemesini engelleyen gastrülasyon kusurlarına neden olabilir.
  5. Embriyoları 2-4 hücre aşamasına ulaştıklarında 0,1x MBS'de(Tablo 1) %5Ficoll içeren bir enjeksiyon kabına veya tepsiye taşıyın. Altta bir parça naylon ağ ile donatılmış 35 mm Petri kabı, embriyoları hareketsiz tutacak ucuz bir enjeksiyon kabı görevi görebilebilir. İğneyi hayvan direğinin yakınına yerleştirin ve her embriyonun bir hücresine 10 nL RNA enjekte edin.
    NOT: Embriyolar bir ila 16 hücre aşaması arasında herhangi bir zamanda kolayca enjekte edilebilir. Embriyonun bölündükten sonra enjekte edilmesi yumurtanın döllenmesini ve embriyonun sağlıklı olmasını sağlar. Enjeksiyonun tam yeri gerekli değildir. RNA'ların X. laevis embriyolarına yumurtlaması, kültürü ve mikroenjeksiyonunun daha ayrıntılı bir açıklaması Referans 15'te bulunabilir.
  6. Enjekte edilen embriyoları 0,1x MBS'de %5 Fikol ile dolu 35 mm Petri kabınaaktarın (Tablo 1). Küçük tabakları 150 mm Petri kabının içine yerleştirin ve kültür medyasının buharlaşmasını önlemek için bir kapakla gevşek bir şekilde örtün. Embriyoları bir gecede 15-16 °C'de kültüre edin.
    NOT: Ficoll'da embriyoların kültleşmesi enjeksiyon bölgesinin iyileşmesine yardımcı olur. İnce iğneler kullanılırsa% 2-3 Ficoll'da kültleme yeterlidir, belirgin hasar görülürse% 5 Ficoll tercih edilir. Enjeksiyondan sonra embriyoları Ficoll çözeltisinde 1-2 saat tutmak iyileşmeye yardımcı olmak için yeterlidir, ancak çözelti gastrülasyon başlamadan önce değiştirildiği sürece gecelik inkübasyon embriyoya zarar vermez.

4. Blastocoele Ekstraksiyonu ve Tgfß Bölünme Ürünlerinin Analizi

  1. Enjeksiyondan sonraki sabah, Ficoll çözeltisini çıkarın ve ölü veya ölmekte olan embriyoları çıkarın. Embriyoları 0,1x MBS ile bir veya iki kez durulayın ve embriyoları oda sıcaklığında bankta 0,1x MBS olarak kültüre edin.
    NOT: Embriyolar gelişimi yavaşlatmak için 16 °C biyolojik inkübatöre de geri döndürülebilir.
  2. Cam kılcal damarları aşağıdaki ayarlarla bir mikropipette çekme kullanarak ince bir noktaya ısıtın ve çekin: İki adımlı çekme; Isı 1: 67.4 °C; Isı 2: 62 °C.
    NOT: Bu ayarlar burada kullanılan çekme ve cam kılcal damarlar için özeldir (Malzeme Masası).
  3. Bir diseksiyon mikroskobu altında, çekilmiş bir iğnenin ucunu tokalar kullanarak kırpın. Tıkanmasını önlemek için, blastocoele aspirasyonu için kullanılan bir iğnenin açılması, mikroenjeksiyon için kullanılan bir iğnedekinden daha büyük olmalıdır. Blastocoele aspirasyonu için kullanılacak iyi çekilmiş ve kırpılmış bir iğne örneği Şekil 1C'degösterilmiştir. Aspirasyon iğnesini bir mikroenjektöre bağlı iğne tutucuya yerleştirin ve iğne tutucuyu bir mikromanipülatöre takın.
    NOT: En uygun iğne çapı deneme yanılma yöntemiyle ampirik olarak belirlenir. Büyük çaplı iğneler çok hızlı doluyor ve hücresel kalıntıların iğneye girme olasılığını daha fazla hale getiriyor. Bunun aksine, çok küçük çaplı iğnelerin tıkanmış olması muhtemeldir. Uygun bir iğne oluşturulduktan sonra, aynı pozisyonda kırpılmış birden fazla iğne oluşturmak yararlıdır.
  4. Embriyoları gastrula aşamasının ortasına (evre 10-11) ulaştıklarında 0,1x MBS ile dolu bir enjeksiyon tepsisine veya yemeğe yerleştirin.
  5. İğneyi embriyonun yüzeyinin altına hayvan kutbunun yanına yerleştirin. İğneye ve embriyoya göz kulak olmak için diseksiyon mikroskobundan bakarken mikroinjektördeki doldurma düğmesine basın. Birkaç saniye içinde, iğnede berrak sıvı seviyesi yükselecek ve embriyo çökecek ve içbükey hale gelecektir.
    1. Bulutlu beyaz madde iğneye girerse, doldurma düğmesini bırakın ve proteaz içermesi muhtemel hücresel döküntülerden oluşan herhangi bir bulutlu maddeyi çıkarmak için enjekte düğmesini bir veya daha fazla kez darbelayın.
      NOT: Blastocoele çökerse ve doldurma düğmesine basıldığı anda hücre kalıntıları iğneye girerse, bu iğnedeki açıklığın çok büyük olduğunu gösterir. Blastocoele çökemezse ancak beyaz madde iğneye hemen girerse, bu iğnenin çok derine sokıldığını ve blastocoele zeminine dokunduğunu gösterir. Beyaz maddeyi dışarı at ve bir sonraki embriyoya geç. Aspirasyon oranı, sürekli basmak yerine doldurma düğmesine nabız alarak daha dikkatli bir şekilde kontrol edilebilir. İğnedeki açıklık optimalden daha büyükse, bu özellikle önemlidir.
  6. Sıvı 10-20 embriyonun blastokoelesinden emişli olana kadar 4.5 adımını tekrarlayın.
    NOT: Genellikle, 10-20 embriyodan emişli blastocoele sıvısı, immünoblotlardaki bölünme ürünlerini tespit etmek için yeterlidir. Bununla birlikte, bu antikor kalitesine bağlı olarak değişebilir ve ampirik olarak belirlenmelidir.
  7. Enjeksiyon tepsisine bir parça parafin ve üzerine pipet 1 μL çekirdeksiz su yerleştirin. İğneyi su damlasının altına batırın ve blastocoele sıvısını suya dağıtmak için enjekte düğmesine basın.
    1. Alternatif olarak, sıvıyı doğrudan parafilme atın, ancak bu durumda, enjekte düğmesini basılı tutmak yerine darbelayın. Bu, sıvıyı daha düşük basınç altında dışarı atar, parafilmde düzleştirmesini önler, bu da bir pipette çekmeyi zorlaştırır.
  8. Blastocoele sıvısını buz üzerinde steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Embriyo başına yaklaşık 0.3-0.5 μL blastokoele sıvısı hasat etmeyi bekleyin. Son ses seviyesini 30 μL'ye ayarlamak için çekirdeksiz su ekleyin.
  9. Blastokoele sıvısı tükenmiş embriyoları buz üzerinde ayrı bir tüpe aktarın. Fazla 0,1x MBS'yi çıkarın ve 200 μL soğutulmuş (4 °C) embriyo lysate tamponu (embriyo başına 10 μL) ekleyin (Tablo 1). Pipet embriyoları 10-20 kez bir mikropipette kullanarak tamamen homojenize olana ve küme kalmayana kadar.
  10. Homojenize embriyoları 10 dakika boyunca 10.000 x g'da soğutulmuş bir mikrosantrifüjde santrifüj edin. Bir P200 pipet kullanarak süpernatant 160 μL çıkarın ve tüpün alt yarısındaki beyaz yumurta sarısı proteinlerinden ve diğer hücresel döküntülerden kaçınmaya dikkat derek buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın.
    1. Mikrosantrifüjasyonu bir kez tekrarlayın ve berrak süpernatantın 128 μL'lik kısmını buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. Bu noktada temizlenmiş embriyo lysates ve blastocoele sıvısı -80 °C'de istanildiği kadar saklanabilir.
      NOT: Birkaç istisna dışında, Tgfß öncül proteinleri blastocoele içine salgılanmaz ve sadece tükenmiş embriyo lysates'lerinde tespit edilir. Bunun aksine, Tgfß aile dekolte ürünleri öncelikle blastocoele sıvısında görülür. Çoğu amaç için hem embriyo lysates hem de blastocoele sıvısının toplanması ve analiz etmesi yararlıdır. En azından bu, öncül sağlam bir şekilde çevrilmiş ve kararlı olduğundan emin olmak için pozitif bir kontrol sağlar. Ek olarak, farklı vahşi tip veya mutant proteinler arasında dekolte ürünlerinin göreceli oranlarını öncüllerle karşılaştırmaya izin verir, bozulmamış öncüllerin blastocoele sıvısına salgılanmasını sağlayan mutasyonları (örneğin, PC konsensüs motifinde yer alan ve bölünmeden uygun katlama ve salgılanmaya izin veren mutasyonlar, bu durumda hem embriyoda hem de blastocoele sıvısında bozulmamış öncül tespit edilir) veya yanlış katlanmış olarak üretilen mutasyonları tanımlamak, bölünemeyen proteinler (bu durumda öncü embriyo lisatında tespit edilecektir, ancak blastocoele sıvısında bölünme ürünleri olmayacaktır).
  11. Deglikosilat proteinleri, üreticinin talimatlarını izleyerek bu noktada PNGase F ile blastocoele sıvısında bulunur.
    NOT Embriyo lizde bulunan öncül proteinleri deglikoze etmeye gerek yoktur, çünkü bunlar endoplazmik reticulum (ER)-- PNGase F tarafından çıkarılan karmaşık N bağlantılı oligosakkaritlerden yoksun öncüllerin yerleşik formlarını temsil eder. Bunun aksine, blastocoele sıvısında bulunan bölünme ürünleri, karbonhidratların daha da değiştirildiği ve artık PNGase F tarafından çıkarılabildiği trans-Golgi ağında (TGN) hareket ettirilmiştir. Deglikosilasyonu takiben, dekolte ürünleri, dekolte ürünlerini görselleştirmeye, nicelleştirmeye ve doğru bir şekilde tanımlamaya yardımcı olabilecek SDS jellerinde daha sıkı yoğunlaştırılmış bir bant olarak taşınır. Bu kesinlikle gerekli değildir, ancak örneğin, göç kalıplarına dayanarak homodimerler ve heterodimerler arasında ayrım yapmaya çalışıyorsanız veya bir bölünme ürünü geniş bir bulanık bant olarak göç etmesine neden olan heterojen karbonhidratlar içeriyorsa yararlı olabilir.
  12. 4x numune tamponunun(Tablo 1) 15 μLblastokoele sıvısına ve 15 μL netleştirilmiş embriyo kalsat'ına indirgendiğinin 5 μL'sini ekleyin. Kalan15μL blastocoele sıvısına 5 μL azaltmayan 4x numune tamponu ( Tablo 1) ekleyin. 5 dakika boyunca 100 °C'ye ısıtın ve buza yerleştirin.
    NOT: Proteinlerin azaltıcı olmayan koşullar altında analiz etmek, bölünen homodimerik veya heterodimerik ligandların oluşumunu analiz etmek için gereklidir, ancak sadece bölünme bölgelerini veya bölünen protein seviyelerini analiz etmek için gerekli değildir. Birkaç istisna dışında, prodomain parçaları monomer olarak salgılanır. Ayrıca, embriyo lisatında bulunan öncü proteinler öncelikle er yerleşik monomerler olarak ortaya çıkarken. Bu nedenle, bu ürünleri azaltıcı olmayan koşullarda analiz etmeye gerek yoktur.
  13. %15 SDS/poliakrilamid jellerde öncü proteinleri ve dekolte ürünlerini elektroforez ile çözün.
  14. Elektroforetik transfer kullanarak jelden proteinleri bir PVDF membranına aktarın.
  15. Membranları prodomain ve ligand etki alanını (veya bu alanlara eklenen epitop etiketlerini) tanıyan uygun antikorlarla kuluçkaya yatırın, uygun ikincil antikorlarla yıkayın ve kuluçkaya bırakın. Proteinleri chemiluminescence veya floresan görüntüleme ile görselleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Deneyin aşağıda açıklanan amacı, Bmp4 ve Bmp7'nin heterodimer (bir Bmp4 ligand ve bir Bmp7 ligand'dan oluşan dimerler), homodimerler (iki Bmp4 veya iki Bmp7 ligand'dan oluşan) veya X. laevis ile birlikte ifade edildiklerinde her birinin bir karışımını mı oluşturduğunu belirlemekti. Şekil 2'de gösterilen veriler daha önce yayınlanmış bir çalışmadan çıkarılır10. Şekil 2A, Bmp4 veya Bmp7 homodimerik öncüllerinin veya Bmp4/7 heterodi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan protokolün temel avantajları, nispeten hızlı bir şekilde tamamlanabilmesi, pahalı reaktifler gerektirmemesi ve fizyolojik koşullar altında konsantre Tgfß dekolte ürünleri kaynağı sağlamasıdır. Başka bir avantaj, epitop etiketli proteinleri analiz etmesine izin etmesi ve böylece çoğu Tgfß ailesi prodomainini tanıyan ticari olarak mevcut antikorların eksikliğini atlatmasıdır. Transfected kültürlü memeli hücrelerinde epitop etiketli Tgfß öncül proteinlerinin bölünmesini analiz etmek de mümkün olsa da, X...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Mary Sanchez'e mükemmel hayvan bakımı için teşekkür ederiz. Yazarların araştırmaları, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü (NIH/NICHD) tarafından R01HD067473-08 ve R21 HD102668-01 ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK/NIH) hibe R01DK128068-01 tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ß-merkaptoetanolFisherAC125470100
Bromofenol BlueFisherB392-5
Kalsiyum KlorürFisherC79-500
Kalsiyum NitratFisherC109-500
Tek Kullanımlık Pelet Havaneli/Doku ÖğütücüFisher12-141-364
Dumont #5 forsepsGüzel Bilim araçları11251-10
Fetal Sığır SerumuAtlanta BiologicalsS11150H
Ficoll 400Sigma AldrichF9378-500G
Cam kılcal, 1 X 90 mmNarshigeG-1
Gliserol FisherG33-4
HEPESFisherBP310-500
İnsan koryonik gonadotropinSigma AldrichCG10-10VL
Enjeksiyon Şırıngası, 1 mLFisher8881501368
L-SisteinSigma AldrichC7352
Magnezyum SülfatFisherM63-500
İğne, 26 GFisher305111
Penisilin / StreptomisinGibco15140148
Pikolitre MikroenjektörWarner InstrumentsPLI-100A
Pipet ÇektirmeNarashigePC-100
Potasyum KlorürFisherP217-500
PVDF MembranSigma AldrichIPVH00010
Sodyum BikarbonatFisherS233-500
Sodyum KlorürFisherS271-10
Sodyum Dodesil SülfatFisherBP166-500
Sodyum HidroksitFisherS318-500
Trikain-SPentairTRS5
TrisFisherBP152-5

Kaynaklar

  1. Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
  2. Gray, A. M., Mason, A. J. Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly. Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).
  3. Constam, D. B. Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing. Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).
  4. Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. Structure and activation of pro-activin A. Nature Communications. 7, 12052(2016).
  5. Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1. Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).
  6. Cui, Y., et al. The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor. Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).
  7. Goldman, D. C., et al. Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity. Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).
  8. Le Good, J. A., et al. Nodal stability determines signaling range. Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).
  9. Tilak, A., et al. Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice. Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).
  10. Neugebauer, J. M., et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).
  11. Robertson, I. B., Rifkin, D. B. Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).
  12. Zhou, F., et al. GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth. Cell Reports. 33, 108332(2020).
  13. Nelsen, S. M., Christian, J. L. Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7. Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).
  14. Birsoy, B., et al. XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development. Development. 132 (3), 591-602 (2005).
  15. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).
  16. Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. Proprotein convertase genes in Xenopus development. Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).
  17. Constam, D. B., Robertson, E. J. Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases. Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).
  18. Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).
  19. Sopory, S., Christian, J. L. Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos. Whitman, M. A., Whitman, S. , CRC Press LLC. 38-55 (2006).
  20. Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).
  21. Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4. Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

TGF-Beta KesimiBlastosöl SıvısıXenopus EmbriyolarıBMP HeterodimerleriProtein MikroenjeksiyonuSDS-PAGEWestern BlotEmbriyo LizatıProteolitik KesimProdomain Fragmanı
Xenopus laevis Embriyolarının Blastocoele'sine Salgılanan Dönüşüm Faktörü ß Aile Bölünmesi Ürünlerinin Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.