Echinococcus granulosus'un Strobilated Formlarının Geçici Transdüksiyonu

Summary

Üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak Echinococcus granulosus'un farklı gelişim evrelerinde hızlı geçici transdüksiyon tekniğini tanımladık.

Abstract

Kistik ekinokokkozis veya hidatik hastalık, köpeklerin bağırsağında bulunan küçük bir tenya olan Echinococcus granulosus'un neden olduğu en önemli zoonotik paraziter hastalıklardan biridir. Patogenezin ve hastalık kontrol ve korunma mekanizmalarının anlaşılması için uygulanan genetik araştırmalara acil ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, etkili bir gen değerlendirme sisteminin olmaması, Echinococcus türleri de dahil olmak üzere cestod parazitlerinin fonksiyonel genetiğinin doğrudan yorumlanmasını engellemektedir. Bu çalışma, E. granulosus'un metacestod ve strobile formlarında lentiviral gen geçici transdüksiyonunun potansiyelini göstermektedir. Protoskoleces (PSC'ler) hidatik kistlerden izole edildi ve strobile solucanlara dönüşmek üzere spesifik bifazik kültür ortamına aktarıldı. Solucanlar, bir transdüksiyon süreci kontrolü olarak HEK293T hücreleri ile birlikte hasat edilmiş üçüncü nesil lentivirüs ile transfekte edildi. Strobillenmiş solucanlarda 24 saat ve 48 saat boyunca belirgin bir floresan tespit edildi ve bu da E. granulosus'ta geçici lentiviral transdüksiyonu gösterdi. Bu çalışma, tenyalarda lentivirüs bazlı geçici transdüksiyona yönelik ilk girişimi sunmakta ve yassı solucan biyolojisi üzerine yapılan deneysel çalışmalarda potansiyel etkileri olan umut verici sonuçları göstermektedir.

Introduction

Kistik ekinokokkozis (CE), Taeniidae ^1,2 familyasında küçük bir tenya olan Echinococcus granulosus'un neden olduğu en önemli helmint hastalıklarından biridir. E. granulosus için immünodiagnostik ve aşı geliştirme konusunda kapsamlı çalışmalar yapılmıştır. Ancak parazit biyolojisinin moleküler temeli hakkında yetersiz bilgi sahibi olmak, hidatik hastalığının tanı, yönetim ve önlenmesinde önemli sınırlamalar getirmektedir 3,4,5,6.

Son yılla....

Protocol

Bu çalışma, Ulusal Tıbbi Araştırma Geliştirme Enstitüsü ve Araştırma Etiği İnceleme Komitesi, No. 958680 tarafından onaylanmıştır. Lentivirüsler BSL-2 organizmaları olarak sınıflandırılır; Bu nedenle, bu protokoldeki tüm laboratuvar kültürü prosedürleri steril laboratuvar uygulamaları kullanılarak gerçekleştirilmiş ve NIH kılavuzlarına göre laminer bir akış başlığı altında yürütülmüştür. Şekil 1 , farklı E. granulosus aşamaları için çalışma protokolünün şematik bir sunumunu göstermektedir.

1. Kist hidatik toplanması

1. Bir mezbahada rutin olarak kesilen doğal olarak enfekte olmu....

Results

Burada, E. granulosus'ta üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak hızlı ve etkili bir geçici transdüksiyon tekniği tanımlanmıştır. PSC'leri, daha önce^25,26'da tanımlandığı gibi^, strobillenmiş solucanlar elde etmek için bifazik bir kültür ortamında kültürledik. Protoscoleces in vitro 6 hafta sonra strobilated solucanlar haline gelir. Bifazik kültür ortamında, invaginasyonlu PSC'ler (Şekil 2A), evajine PSC'ler (Şekil 2B<.......

Discussion

Nematodların moleküler temelini ve Platyhelminthes biyolojisini anlamak, zoonotik parazitlerin patojenitesini anlamak için çok önemlidir²⁷. Etkili bir gen değerlendirme sisteminin olmaması, Echinococcus türleri^12,27 de dahil olmak üzere cestod parazitlerinin fonksiyonel genetiğinin doğrudan yorumlanmasının önünde büyük bir engeldir. Bu çalışma, E. granulosus geçici transdüksiyonunda lentivirüsün mükemmel potansiyelini gös.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 oyuklu kültür plakaları	SPL Yaşam Bilimleri	30012
25 cm2 kültür şişesi	SPL Yaşam Bilimleri	70325
6 oyuklu kültür plakaları	SPL Yaşam Bilimleri	30006
Kalsiyum klorür	Sigma-Aldrich	C4901-500G	Çalışma konsantrasyonu: 2.5  mM
CMRL 1066 orta	Thermo Fisher Scientific	11530037
CO2< / sub> inkübatör	memmert	ICO150
D-(+)-Glikoz	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
DMEM	Yaşam Teknolojisi	12100046
Köpek safrası			Ötenazi yapılmış bir köpekten izole edilmiş ve 0.2 & mu ile sterilize edilmiştir; m şırınga filtresi
Eosin Y	Sigma-Aldrich	E4009-5G	çalışma dışlama testi için Eosin'in% 0.1'ini hazırlar
Fetal Sığır Serumu (FBS)	DNAbiotech	DB9723-100ml	Isı inaktivasyonu  nın&nin  FBS (40 dakikada 30 dakika > C)
Fetal Buzağı Serumu (FCS)	DNAbiotech	DB9724-100ml	Isı inaktivasyonu  nın&nin  FCS (40 dakika içinde 30 dakika > C)
HEK293T hücreleri	BONbiotech	BN_0012.1.14	İnsan embriyonik böbrek 293T
HEPES tamponlu salin (HBS)	Sigma-Aldrich	51558-50ML	2x konsantre
Ters floresan mikroskobu	OLYMPUS	IX51
Penisilin	Sigma-Aldrich	P3032-10MU	Çalışma konsantrasyonu: 100 IU / mL
Pepsin	Roche	10108057001	Çalışma konsantrasyonu: 2 mg / mL, pH 2
Fosfat tamponlu salin (PBS)	DNAbiotech	DB0011
	BioIdea	BI-1006-05
Sodyum bikarbonat (NaHCO3< / sub>)	Sigma-Aldrich	S5761-1KG
Streptomisin	Sigma-Aldrich	S9137-25G	Çalışma konsantrasyonu: 100 &�; g/mL
Üçüncü nesil lentiviral plazmid (pCDH513b)	SBI System Biosciences (BioCat GmbH)	CD513B-1-SBI	Transfer vektörü (ticari olarak İran Eğitim, Kültür ve Araştırma Akademik Merkezi (ACECR), Meşhed, İran Moleküler Tıp Araştırma Bölümü'nden elde edilmiştir)
Üçüncü nesil lentiviral plazmit (pLPI ve pLPII)	İnvitrojen (Yaşam Teknolojileri)	K4975-00	Yardımcı vektör (İran Eğitim, Kültür ve Araştırma Akademik Merkezi (ACECR), Meşhed, İran Moleküler Tıp Araştırma Bölümü'nden ticari olarak elde edilmiştir)
Üçüncü nesil lentiviral plazmit (pMD2G)	Addgene	Plasmid 12259	Yardımcı vektör (ticari olarak İran Eğitim, Kültür ve Araştırma Akademik Merkezi (ACECR), Meşhed, İran Moleküler Tıp Araştırma Bölümü'nden elde edilmiştir)
Tris/EDTA Tamponu (TE)	DNAbiotech	DB9713-100ml
Tripsin	Sigma-Aldrich	T9935-50MG	1x çalışma solüsyonları (pH 7.4 > 7.6)