Echinococcus granulosus'un Strobilated Formlarının Geçici Transdüksiyonu

Kistik ekinokokkozis (CE), Taeniidae ^1,2 familyasında küçük bir tenya olan Echinococcus granulosus'un neden olduğu en önemli helmint hastalıklarından biridir. E. granulosus için immünodiagnostik ve aşı geliştirme konusunda kapsamlı çalışmalar yapılmıştır. Ancak parazit biyolojisinin moleküler temeli hakkında yetersiz bilgi sahibi olmak, hidatik hastalığının tanı, yönetim ve önlenmesinde önemli sınırlamalar getirmektedir 3,4,5,6.

Son yıllarda, genom dizilimi ve transkriptomik yöntemlerin gelişmesi nedeniyle, çeşitli araştırma grupları ^7,8,9 tarafından yassı solucanlar üzerinde çok çeşitli moleküler çalışmalar yapılmıştır. Bununla birlikte, parazitler dünyasında, parazitik yassı solucanlarda gen transfer teknolojisindeki ilerlemeler, bazı protozoalar^10,11,12 için geliştirilen yüksek oranda tekrarlanabilir geçici transdüksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında hala sınırlıdır.

Viral dağıtım sistemlerinin kullanımı, son yirmi yılda transgen dağıtımı ve gen / protein araştırmaları için gerekli bir araç olarak ortaya çıkmıştır¹³. Lentivirus hem bölünen hem de bölünmeyen hücreleri enfekte eder, böylece postmitotik hücreleri enfekte etmeyi mümkün kılar^14,15,16. Son kanıtlar, memeli hücrelerinde lentivirüs tabanlı bir transdüksiyon sistemi kullanmanın, önceki knock-in / knock-down tekniklerinin sınırlamalarının çoğunun üstesinden gelme potansiyeli sunduğunu göstermektedir. GFP ekspresyonu gibi uygun moleküler belirteçlere sahip ekspresyon lentiviral vektörlerinin tasarımı ve yapımı daha önce¹⁶ olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, E. granulosus'un protoskolekslerinde ve strobilated solucanlarında GFP muhabir geninin lentiviral geçici transdüksiyonunu değerlendiriyoruz.

Bu çalışma, Ulusal Tıbbi Araştırma Geliştirme Enstitüsü ve Araştırma Etiği İnceleme Komitesi, No. 958680 tarafından onaylanmıştır. Lentivirüsler BSL-2 organizmaları olarak sınıflandırılır; Bu nedenle, bu protokoldeki tüm laboratuvar kültürü prosedürleri steril laboratuvar uygulamaları kullanılarak gerçekleştirilmiş ve NIH kılavuzlarına göre laminer bir akış başlığı altında yürütülmüştür. Şekil 1 , farklı E. granulosus aşamaları için çalışma protokolünün şematik bir sunumunu göstermektedir.

1. Kist hidatik toplanması

1. Bir mezbahada rutin olarak kesilen doğal olarak enfekte olmuş koyunlardan karaciğer hidatik kistlerini toplayın.
2. Protoskolesleri (PSC'ler) aspire etmeden önce steril gazlı bez ve% 70 alkol kullanarak kist yüzeyini tamamen sterilize edin.
3. 20-50 mL hidatit sıvısını steril 50 mL konik tüplere aspire edin.
4. Boşalttıktan sonra, kisti keskin bir bıçakla lekeleyin, germinal tabakayı steril bir 50 mL konik tüpe aktarın ve PSC'lerin toplanmasını arttırmak için kısa bir süre (~ 2 dakika) sallayın.
5. PSC'leri 3-5x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
6. Bir ışık mikroskobu altında PSC'nin yaşayabilirliğini belirlemek için PSC'leri 5 dakika boyunca %0,1 eozin içinde gözlemleyin. Kültür için en az %95 uygulanabilirliğe sahip PSC'ler kullanın.
7. PSC çökeltiyi 15-20 dakika boyunca 2 mL pepsin (2 mg / mL, pH 2) ile tedavi edin.
8. Tek tek PSC'leri izole etmek için, PBS'deki PSC tortusunu yeniden askıya alın ve iki kat steril gazlı bezden yeni bir steril 50 mL konik tüpe geçirin.
   NOT: Bir ışık mikroskobu kullanarak 50 μL PSC tortuları üzerinde ortalama üç sayım hesaplayın. Sonraki denemelerde, PSC'leri/μL'yi belirlemek için tahmini değeri kullanın. Her bir kist hidatik izolatı, PCR dizilimi¹⁷ veya yüksek çözünürlüklü erime eğrisi analizi¹⁸ gibi moleküler yöntemlerle nükleotid polimorfizmlerine dayanarak karakterize edilmelidir.

2. Yetişkin solucanlar elde etmek için E. granulosus'un PSC'lerinin bifazik yetiştiriciliği

NOT: İzole PSC'ler, laminer akış kabini Sınıf II altında steril koşullarda kültürlenmelidir. Sonraki adımlara geçmeden önce bifazik kültür ortamının katı ve sıvı fazlarını ayrı ayrı hazırlayın¹⁹.

1. Bifazik kültür ortamını iki aşamadan oluşacak şekilde hazırlayın.
   1. Katı faz için, 25 mL'lik bir şişeye 10 mL sığır serumu ekleyin ve 20-30 dakika boyunca 76 ° C'de pıhtılaşmaya bırakın.
   2. Sıvı faz (modifiye CMRL) için, 100 mL ısıyla inaktive edilmiş fetal buzağı serumu (FCS), 36 mL% 5 maya ekstresi, 5.6 mL% 30 glikoz (damıtılmış suda), PBS'de 1.4 mL% 5 köpek safrası, 20 mM HEPES tamponu ve 260 mL CMRL-1066 ortamında 10 mM NaHCO₃ karıştırın. Son olarak, karışıma penisilin (100 IU / mL) ve streptomisin (100 mg / mL) ekleyin.
2. Her 25^cm2 kültür şişesine 10 mL sıvı faz ortamı ekleyin.
3. Kültür şişesine ~5.000 PSC ekleyin ve şişeyi CO 2 inkübatörüne aktarın (37 °C, %5 CO₂).
4. 24-48 saat sonra, PSC'leri katı fazlı (sığır serumu) yeni bir şişeye aktarın ve şişe başına aynı taze sıvı faz ortamından 1 mL ekleyin. Şişeleri CO 2 inkübatörüne aktarın (37 °C, %5 CO₂).
5. Her 5-7 günde bir, kültür ortamının rengindeki değişikliklere ve farklılaştırılmış PSC'lerin tahmini oranına bağlı olarak ortamı taze sıvı faz ortamı ile değiştirin.
   NOT: Protoscoleces kültürlendikten sonra çevresel değişikliklere hızlı bir şekilde tepki verir ve çoğu 2-3 hafta içinde farklılaşır. Besin maddelerinin tüketimi ve protoscoleces'in büyümesi ve gelişmesi nedeniyle, kültür ortamının pH'ı değişir ve rengi turuncu ve sarıya doğru kayar.

3. E. granulosus'un PSC'lerinin monofazik yetiştiriciliği

1. Monofazik ekimin transdüksiyondan 24-48 saat önce yapıldığından emin olun.
   1. RPMI ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile^{25 cm2'lik} bir kültür şişesinde kültür ~ 5.000 PSC.
   2. Şişeleri kullanıma kadar CO 2 inkübatörüne (37 °C, %5 CO₂) aktarın.

4. Virüs üretimi ve hazırlanması için hücre kültürü

NOT: Kerman Tıp Bilimleri Üniversitesi Patoloji ve Kök Hücre Araştırma Merkezi'nden vektör üretimi için insan embriyonik böbrek 293T (HEK293T) hücreleri elde edilmiştir.

1. 5 × 10⁵ HEK293T hücresini, %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin içeren 5 mL DMEM içeren^{25 cm2'lik} bir şişeye aktarın.
2. HEK293T hücrelerini 37 ° C'de% 5 CO_2'de inkübe edin ve her 48 saatte bir tam kültür ortamında geçirin. Son olarak, transdüksiyon²⁰ için düşük pasajlı HEK293T hücreleri kullanın.

5. Üçüncü nesil lentiviral vektörlerle virüsün üretimi ve hazırlanması

NOT: GFP muhabir genini eksprese etmek için lentivirüs vektörü pCDH513b (transfer vektörü) ve PLPII, PLPI ve PMD2G (yardımcı vektörler) kullanılmıştır. Bkz. Malzeme tablosu ve Ek Şekil S1.

1. 1. Gün:
   1. HEK293T hücreleri^21'i 6 kuyucuklu kültür plakalarında tripsinize ettikten sonra, tohum 7 ×% 10 FBS içeren taze antibiyotik içermeyen DMEM ile kuyu başına 10 ⁴ hücre.
   2. Kalsiyum fosfat yöntemi ile transdüksiyon için% 50-60 akıcılıkta hücreler kullanın.
2. 2. Gün:
   1. Deneyden 2-3 saat önce hücre kültürü ortamını % 2 FBS içeren taze antibiyotik içermeyen DMEM ile değiştirin.
   2. 1,5 mL'lik bir tüpte, 7 μg/μL pCDH513b (transfer vektörü), 4 μg/μL PLPII, 4 μg/μL PLPI ve 2 μg/μL PMD2G (yardımcı vektörler) dahil olmak üzere üçüncü nesil lentiviral plazmidleri karıştırın.
   3. Karışıma HEPES tamponunu (0,28 M NaCl, 0,05 M HEPES ve 1,5 mM Na₂HPO₄; optimum pH aralığı, 7,00-7,28) 422 μL'lik bir hacme ekleyin.
   4. Karışıma 16 μL %1 Tris-EDTA (TE) tamponu ekleyin.
   5. Tüplere 62 μL 2,5 mM kalsiyum klorür ekleyin ve iyice karıştırın.
   6. Bir Pasteur pipeti kullanarak karışıma 500 μL 2x HEPES-tamponlu salin (HBS) ekleyin, damla damla, damla damla. Yarı opak bir çözelti elde edilene kadar hafifçe karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
   7. Karışımı her plakaya yavaşça ekleyin ve yavaş dairesel hareketlerle dağıtın.
   8. Plakaları% 5 CO₂ inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin ve 4-6 saat sonra ortamı % 10 FBS içeren antibiyotiksiz DMEM ile değiştirin.
3. 3. Gün:
   1. Ters çevrilmiş floresan mikroskobu kullanarak başarılı geçici transdüksiyonu ve hücre canlılığını onaylayın.
4. 4. Gün:
   1. Her bir kuyucuğun süpernatantını toplayarak virüsleri kültür ortamından toplayın ve kullanıma kadar -70 ° C'de saklayın.
      NOT: Hasat edilen lentivirüsler konsantre edilebilir ve hassas transfeksiyon için titre edilebilir²².

6. E. granulosus'un farklı evrelerinin virüs ile geçici transdüksiyonu

1. 1. Gün:
   1. Gen transferi için 12 kuyucuklu bir kültür plakası kullanın. Kültür 5 × 10^3-5 × 10⁴ HEK293T hücreleri üçlü olarak, iç referans olarak tam DMEM ortamı ile.
   2. Kültür RPMI ve %10 FBS'de üçlü olarak 150 taze PSC.
   3. Kültür 30% 10 ısı-inaktive FBS içeren DMEM'de üçlü olarak strobilated solucanlar.
      NOT: Tüm transdüksiyon ortamları antibiyotiksiz olmalıdır. Bu süreçte HEK293T hücreleri, PSC'ler ve strobilated solucanlar için üç adet tedavi edilmemiş kontrol kuyusu bulundurun.
   4. HEK293T hücrelerini ve solucanın farklı aşamalarını dönüştürmek için 4 μg / mL transfeksiyon reaktifi ile 1 × 10⁶ virüsün bir karışımını hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   5. Karışımı her plakaya yavaşça ekleyin ve yavaş dairesel hareketlerle dağıtın. Plakaları bir CO 2 inkübatöründe 4-6 saat boyunca inkübe edin (37 ° C,% 5 CO₂). Transfeksiyon reaktifinin toksik etkilerini en aza indirmek için her numunenin ortamını aynı tam kültür ortamıyla değiştirin.
2. 2. Gün:
   1. HEK293T hücreleri, PSC'ler ve strobilated solucanlar için geçici iletim verimliliğini artırmak üzere 6.1.4-6.1.5 arasındaki adımları yineleyin.
   2. Tüm plakaları, hücre ortamının tipine bağlı olarak aynı kültür koşullarına sahip bir CO₂ inkübatöründe 24-48 saat boyunca inkübe edin.
3. 3. Gün:
   1. Floresan mikroskobu kullanarak transdüksiyonun başarılı olup olmadığını kontrol edin.
      NOT: Gen transfer prosedüründe PCR / qPCR ^20,23 veya Western blotting²⁴ teknikleri gibi daha fazla doğrulayıcı tahlil kullanmayı düşünün.

Burada, E. granulosus'ta üçüncü nesil lentiviral vektörler kullanılarak hızlı ve etkili bir geçici transdüksiyon tekniği tanımlanmıştır. PSC'leri, daha önce25,26'da tanımlandığı gibi, strobillenmiş solucanlar elde etmek için bifazik bir kültür ortamında kültürledik. Protoscoleces in vitro 6 hafta sonra strobilated solucanlar haline gelir. Bifazik kültür ortamında, invaginasyonlu PSC'ler (Şekil 2A), evajine PSC'ler (Şekil 2B) ve birinci ve üçüncü proglottid formasyonlu strobile solucanlar (Şekil 2C-E) dahil olmak üzere E. granulosus'un farklı aşamaları gözlenmiştir. Protoscoleces ve sırasıyla monofazik ve bifazik kültürlerden elde edilen strobillenmiş solucanlar, GFP eksprese eden lentivirüslerle transfekte edildi (Şekil 3). Otofloresan etkilerinden kaçınmak için, mikroskobik gözlemler her üç örnek grubundaki arka plan floresansı ile karşılaştırıldı ve bu arka plan seviyesinin üzerindeki tüm örnekler transfekte edilmiş olarak kabul edildi.

Saha aydınlatmasını ayarladık ve her işlem için kontrol numunelerinde olası otofloresan emisyonunu önlemek için deklanşörü indirdik. Daha sonra lentiviral vektörle işlenmiş örnekleri kontrol ettik, burada siyah alana karşı yeşil ışık emisyonu etkili geçici transdüksiyon olarak kabul edildi. HEK293T hücreleri - geçici iletim işlemi kontrolü - GFP'yi açıkça ifade etti (Şekil 3D). Yetişkin solucanlar GFP'yi tegumental tabakada en belirgin şekilde ifade ettiler (Şekil 3F); Bununla birlikte, PSC'ler 48 saat sonra biraz daha düşük bir GFP ekspresyonu seviyesi göstermiştir. PSC'lerin etrafındaki bazı kist sıvı kalıntıları ve / veya germinal tabaka kalıntıları, transfekte edilen örneklerde arka planda bir miktar floresana neden olmuştur. HEK293T hücrelerinde ve strobillenmiş solucanlarda floresan yoğunluğu 24 saat ve 48 saat sonra artmıştır (PSC'lerde küçük değişiklikler gözlenmiştir).

Şekil 1: Çalışma protokolünün şematik bir sunumu. Kısaltma: PSC'ler = protoscoleces. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bifazik kültür ortamında Echinococcus granulosus'un farklı evreleri. (A) İnvaginasyonlu PSC'ler, (B) kaçamak PSC'ler, (C, D) strobilasyon sürecinde solucanlar, (E) üçüncü proglottid formasyonuna sahip strobillenmiş solucanlar, (F) kültür ortamında strobilasyonun farklı aşamalarında solucanlar. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Işık ve floresan mikroskopisinde Echinococcus granulosus'un farklı aşamalarının ve kontrol hücre hattının geçici transdüksiyonu . (A,D) Transdüksiyon proses kontrolü olarak HEK293T hücreleri, (B, E) protoskoleksler ve (C, F) strobile solucanlar. (G, H, I) Karışık ışık ve floresans mikroskopisi. Ölçek çubukları = 50 μm, 100 μm ve 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: pCDH-CMV-MCS-EF1-GreenPuro cDNA klonlama ve ekspresyon vektörünün haritası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.