Yöntem makalesi

Akış Sitometrisi ile Kalite Kontrollü Balgam Analizi

DOI:

10.3791/62785

⸱

9 Ağustos 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1bioAffinity Technologies, 2Department of Cell Systems & Anatomy, The University of Texas Health Science Center at San Antonio

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, balgamını tek bir hücre süspansiyonuna dağıtmak ve standart akış sitometrik platformlarındaki hücresel alt kümelerin daha sonra karakterizasyonu için etkili bir yöntemi açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğerin sağlığını anlamak için hücresel içeriği ve diğer mikroçevronmental özellikleri incelemek için yaygın olarak kullanılan balgam, geleneksel olarak sitoloji tabanlı metodolojiler kullanılarak analiz edilir. Slaytları okumak zaman alıcı olduğundan ve son derece uzmanlaşmış personel gerektirdiğinden, yardımcı programı sınırlıdır. Ayrıca, geniş döküntüler ve çok fazla skuamöz epitel hücresinin (SEC) veya yanak hücrelerinin varlığı, genellikle bir örneği tanı için yetersiz hale getirir. Buna karşılık, akış sitometrisi, hücresel popülasyonların yüksek verimli fenotiplemesine izin verirken aynı zamanda döküntüleri ve DC'leri hariç tutmaktadır.

Burada sunulan protokol, balgamını tek bir hücre süspansiyonuna, antikor lekesine ve hücresel popülasyonları düzeltmeye ve akış sitometrik platformunda örnekler almaya yönelik etkili bir yöntemi açıklar. Enkaz, ölü hücreler (SEC'ler dahil) ve hücre çiftlerinin hariç tutulmasını açıklayan bir gating stratejisi burada sunulmaktadır. Ayrıca, bu çalışma, hematopoetik ve epitel soy alt kümelerini karakterize etmek için bir farklılaşma kümesine (CD)45 pozitif ve negatif popülasyona dayanarak uygulanabilir, tek balgam hücrelerinin nasıl analiz edilip edilecektir. Akciğere özgü makrofajların akciğerden örnek elde edildiğinin ve tükürük olmadığının kanıtı olarak tanımlanmasıyla da bir kalite kontrol önlemi sağlanır. Son olarak, bu yöntemin üç akış sitometresinde analiz edilen aynı hastadan balgam profilleri sağlanarak farklı sitometrik platformlara uygulanabileceği gösterilmiştir; Navios EX, LSR II ve Lirik. Ayrıca, bu protokol ek hücresel ilgi işaretlerini içerecek şekilde değiştirilebilir. Bir akış sitometrik platformunda tüm balgam örneğini analiz etmek için bir yöntem burada sunulmaktadır, bu da balgamını akciğer hastalığının yüksek verimli tanısını geliştirmek için uygun hale getirir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akış sitometrelerinin donanım ve yazılımındaki teknik gelişmeler, birçok farklı hücre popülasyonunun aynı anda tanımlanmasını mümkün kıldı1,2,3,4. Örneğin, hematopoetik hücre araştırmalarında akış sitometresinin kullanılması, bağışıklık sisteminin çok daha iyi anlaşılmasına yol açmıştır2 ve hematopoetik sistemin hücresel hiyerarşisi5, ayrıca çok sayıda farklı kan kanserinin tanısal ayrımı6,7,8. Balgam ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Balgam işlemenin tüm adımları, uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilir.

1. Balgam ayrışmaya başlamadan önce reaktif hazırlama

  1. %1 Paraformaldehit (PFA), buzda numune başına 25 mL çözün ve kullanıma kadar soğuk tutun.
    DİkKAT: PFA inhalasyon ve cilt teması ile toksiktir. Düzelticiyi üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve kullanıma kadar 25 mL aliquots içinde -20 °C'de dondurun.
  2. Numunenin ağırlığını yaklaşık olarak kavr ve 2.2. adım için yeterli miktarda% 0.1 Dithiothreitol (DTT) çözün ve 37 ° C'ye getirin. (DTT'nin aliquotları kullanılmadan önce -20 °C'de saklanmalıdı....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol klinik laboratuvar ayarı göz önünde bulundurularak geliştirilmiştir. Protokolün geliştirilmesi sırasında odak noktası basitlik, verimlilik ve tekrarlanabilirlikti. Balgamının işlenmesinde en çok zaman alan adımın hücreleri saymak olduğu bulunmuştur. Bu nedenle protokol, balgam işleme ve hücre etiketlemesi zaman kaybı olmadan hücre sayımından bağımsız olarak gerçekleştirilebilecek şekilde ayarlanır. Numuneyi engelsiz bir çalışma için uygun şekilde seyreltmek için hala gerekli olan doğru bir hücre sayısı, daha .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Balganın hücresel içeriği, genellikle çok fazla enkazla birlikte çok çeşitli hücreler içerir37. Ek olarak, balgam analizi, numunenin ağız boşluğu yerine akciğerden toplandığını doğrulayan bir kalite kontrolü gerektirir38. Bu nedenle, balgamumu akış sitometrisi ile analiz etmek, örneğin çok daha temiz ve homojen bir hücre süspansiyonu serbest bırakan kan için olduğu kadar basit değildir. Bu protokol tüm bu sorunları ele almıştır: hem en küçük hem de en büyük hücre popülasyon.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar bioAffinity Technologies'in geçmiş veya mevcut çalışanlarıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

David Rodriguez'e figür hazırlığındaki yardımı için teşekkür etmek istiyoruz. Balgam örnekleri UT Health, NIH-NCI P30 CA054174-20 (CTRC at UT Health) ve UL1 TR001120 (CTSA hibesi) tarafından desteklenen UT Health San Antonio Flow Cytometry Paylaşılan Kaynak Tesisi'ndeki BD LSR II'de çalıştırıldı.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 1 Paraformaldehit Akış DüzeltmePolibilimleri25037
100 & mikro; M naylon hücre süzgeçleri, Falcon # 352360Fisher Scientific08-771-19
3 M NaOHEMDSX0593-1
50 mL konik şahin tüpüFisher Scientific14-432-22
Alexa488 anti-insan CD19BioLegend302219
Alexa488 anti-insan sitokeratiniBioLegend628608
Alexa488 PanCK, CD3 ve CD19 İzotipiBioLegend400129
BV510 anti-insan CD45BioLegend304036
CD66b FITC izotipiBD Biosciences555748
CompBead Plus Kompanzasyon BoncuklarıBD Biosciences560497
Corning Polistiren tek kullanımlık steril şişe 250 mLFisher Scientific09-761-4
Corning Polistiren tek kullanımlık steril şişe 500 mLFisher Scientific09-761-10
CS& T boncukBD Biosciences655051
DTTFisher ScientificBP172-5
FITC anti-insan CD66bGeneTexGTX75907
Sabitlenebilir Canlılık LekesiBD Biosciences564406
FlowCheckBeckman CoulterA69183
FlowSetBeckman CoulterA69184
HBSSFisher Scientific14-175-095
NACSigma-AldrichA9165
NIST Boncuklar, 05 & mu; MPolysciences64080
NIST Boncuklar, 20 μ MPolysciences64160
NIST Boncuklar, 30 & mu; MPolysciences64170
PE anti-insan CD45BioLegend304039
PE-CF594 anti-insan EpCAM BDBiosciences565399
PE-CF594 CD206 / EpCAM İzotipBD Biosciences562292
PE-CR594 anti-insan CD206BD Biosciences564063
Sodyum sitrat dihidratEMDSX0445-1
Tripan Mavisi çözeltisi, %0,4Fisher Scientific15250061
Alexa488 anti-insan CD3 BioLegend 300415

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (7), 705-713 (2010).
  2. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek H cre S spansiyonuGating StratejisiH cre Canl lHematopoetik H crelerEpitelyal H crelerAkci er MakrofajlarY ksek Kapasiteli Tan SistemleriH cre Pop lasyonu Fenotiplemesi

İlgili makaleler