Bu protokol, mTORC1-hiperaktif hücreler tarafından besinlerin (karbonhidrat ve protein) makropinositik alımını değerlendirmek için deneysel araçlar sağlar. Floresan etiketli dekstran ve sığır serum albümininin (BSA) alımını ölçmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
mTORC1-Hiperaktif Hücrelerde Makropinositozun Flow Sitometri Kullanılarak Kantitatif Değerlendirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Makropinositoz, proteinler ve lipitler dahil olmak üzere hücre dışı materyalin alımına izin veren, yüksek oranda korunmuş, aktine bağımlı bir endositik süreçtir. Çoğalan hücrelerde makropinositoz, kritik makromolekül yapı taşlarına işlenen lizozoma hücre dışı besinler sağlayabilir. Son çalışmalar, meme, kolorektal ve pankreas kanseri dahil olmak üzere çoklu kanserlerin makropinositoza bağımlılığını vurgulamıştır. Ras mutasyonlarının, mTORC1 sinyal yolu yoluyla hücresel anabolik süreçlerin aktivasyonuna yol açan makropinositoz başlangıcının arkasındaki itici olaylar olduğu düşünülmektedir. İlginç bir şekilde, mTORC1, Ras'tan bağımsız olarak makropinositoz ile de aktive edilebilir. Bu nedenle makropinositoz, terapötik olarak besinlere erişimlerini sınırlayarak makropinositik tümörleri hedeflemek için kullanılabilecek metabolik bir güvenlik açığını temsil eder.
Tüberöz Skleroz Kompleksi (TSC) ve Lenfanjioleiomyomatozda (LAM), mTORC1 hiperaktivasyonu artmış makropinositoz ve metabolik yeniden programlamaya yol açar. Burada, memeli hücrelerinde makropinositozu kantitatif olarak değerlendirmek için akış sitometrisi tabanlı bir protokol açıklıyoruz. mTORC1'in anormal aktivasyonunu sergileyen ve TSC2 eksprese eden hücrelere kıyasla makropinositozu arttırdığı gösterilen TSC2 eksikliği olan MEF'ler kullanılır. Makropinositozun farmakolojik inhibitörleri ile tedavi edilen hücreler, akış sitometrisi ile test edilen floresan işaretli, lizin ile fikse edilebilir, 70 kDa dekstran veya floresan işaretli sığır serum albümini (BSA) ile inkübe edilir. Bugüne kadar, in vitro ve in vivo tümör hücrelerinde makropinositozu kantitatif olarak değerlendirmek için sağlam görüntü tabanlı teknikler geliştirilmiştir. Bu analiz, çoklu deneysel koşullarda makropinositozun kantitatif bir değerlendirmesini sağlar ve mevcut görüntü tabanlı teknikleri tamamlar.
Giriş
Makropinositoz, hücre dışı materyalin toplu alımına ve ardından plazma zarına geri dönüştürülen veya içselleştirilmiş kargoyubozmak için lizozomlarla kaynaştırılan makropinozomların oluşumuna adanmış endositik bir süreçtir 1,2. Kargo alımı seçici olmamasına rağmen, makropinositoz, Rab GTPazlar ve membran fosfolipidleri 3,4 tarafından sıkı bir şekilde düzenlenen çok aşamalı bir süreçtir. Özellikle, kanser hücreleri, proteinler, polisakkaritler ve lipitler dahil olmak üzere hücre dışı besinleri içselleştirmek için makropinositoz kullanır. Kanser hücreler....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hücre tedavisi
1. Gün
- TSC2 eksikliği olan ve TSC2 eksprese eden fare embriyonik fibroblastlarını (MEF'ler), % 10 FBS ile desteklenmiş DMEM kullanılarak altı oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğunda üç kopya halinde tohumlayın. Hücreler 3. güne kadar% 60-70 oranında birleşmiş olmalıdır.
- FITC-Dextran veya TMR-BSA ile lekelenmeyecek her ilaç durumu için tohum ek kontrol kuyuları.
2. Gün
- Ortamı dikkatlice aspire edin ve hücreleri oda sıcaklığında PBS ile iki kez durulayın.
- Hüc....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Ritanserin, TSC2 eksikliği olan hücrelerde makropinositozu inhibe eder
Daha önce, TSC2 eksikliği olan hücrelerde besinlerin makropinositik alımının, TSC2 eksprese eden hücrelere kıyasla üç kat arttığını göstermiştik16. TSC ve LAM'da makropinositoza diasilgliserol kinaz alfa (DGKA) aracılık eder. DGKA'nın metabolik ürünü, hücresel zarların çok önemli bir bileşeni olan fosfatidik asittir (PA). Bu nedenle, DGKA'nın rita.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, akış sitometrisi kullanarak makropinositozu değerlendirmek için kantitatif bir yaklaşım tanımlanmıştır. Bu yöntem, floresan olarak işaretlenmiş makropinositik kargo, dekstran ve albüminin doğru ve hızlı bir şekilde ölçülmesini sağlar. Önceki çalışmalar, konfokal mikroskopi yaklaşımları15,20 kullanarak kanser hücrelerinin makropinositik indeksini dikkatlice karakterize etmiştir. Bu yöntemler makropinozomların içselleştiril.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
LAM Vakfı Kariyer Geliştirme Ödülü. Şekil 1 , BioRender.com ile oluşturulmuştur. Eleştirel okuma Hilaire C. Lam tarafından gerçekleştirildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Büyüme ortamı |
| EIPA (amilorid) | Sigma Aldrich | A3085 | Makropinositoz inhibitörü |
| FBS | R& D Systems | S11150 | Fetal Sığır Serumu |
| FITC-Dextran | Invitrogen | D1822 | Floresan polisakkarit (70kDa) |
| Parafolmadehyde | Pierce | 28906 | Fiksasyon ajanı |
| PBS | Gibco | 10010-023 | Fosfat Tamponu Salin |
| Penisilin / Streptomisin | Sigma Aldrich | P4458-100ML | Hücre kültürü antibiyotikleri |
| Fosfatidik Asit | Avanti | 840101P | Yumurtadan elde edilen fosfolipid |
| Ritanserin | Tocris | 1955 | DGKA inhibitörü |
| TMR-BSA | Invitrogen | A23016 | Floresan albümin |
| Tripsin | Sigma Aldrich | 25300-054 | Ayrışma ajanı |
Kaynaklar
- Yoshida, S., Pacitto, R., Inoki, K., Swanson, J. Macropinocytosis, mTORC1 and cellular growth control. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (7), 1227-1239 (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-t....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
