Yöntem makalesi

In Vitro Leishmania Enfeksiyonunda İnsan Dendritik Hücrelerinin ve Belirteçlerinin Farklılaşması

DOI:

10.3791/62794

⸱

6 Nisan 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritik hücreler (DC'ler), Leishmania enfeksiyonuna karşı doğuştan gelen bağışıklığın temel bileşenleridir. DC'ler ve Leishmania arasındaki karmaşık etkileşimin altında yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, Leishmania enfeksiyonunun, göçle ilgili ve kostimülatör molekül ekspresyonu gibi insan DC'lerinin immünobiyolojik işlevini nasıl etkilediğini değerlendirmek için yöntemleri açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leishmaniasis, zorunlu hücre içi protozoonlar, Leishmania enfeksiyonu ile ilişkili bir dizi klinik belirti içerir. Leishmania parazitlerinin yaşam döngüsü, parazitlerin sırasıyla eklembacaklı vektörleri veya omurgalı konakçıları içinde bulunduğu iki alternatif yaşam evresinden (amastigotlar ve promastigotlar) oluşur. Özellikle, Leishmania parazitleri ve bağışıklık sisteminin çeşitli hücreleri arasındaki karmaşık etkileşimler, enfeksiyonun sonucunu büyük ölçüde etkiler. Daha da önemlisi, makrofajların Leishmania replikasyonu için ana konak nişi olduğu bilinmesine rağmen, parazitler ayrıca nötrofiller ve dendritik hücreler (DC'ler) gibi diğer doğuştan gelen bağışıklık hücreleri tarafından fagosite edilir.

DC'ler, bağışıklığın doğuştan gelen ve adaptif dalları arasında köprü kurmada önemli bir rol oynar ve böylece çok çeşitli patojenlere karşı bağışıklık tepkilerini düzenler. Leishmania ve DC'lerin etkileşime girdiği mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır ve patojen yakalama, DC olgunlaşma ve aktivasyon dinamikleri, drenaj lenf noduna (dLN'ler) DC göçü ve T hücrelerine antijen sunumu yönlerini içerir. Her ne kadar çok sayıda çalışma, DC'lerin Leishmania'ya karşı bağışıklık tepkilerini modüle etmede ikili bir rol oynadığı fikrini desteklese de, bu hücrelerin Leishmania'ya duyarlılık veya dirençteki katılımı tam olarak anlaşılamamıştır. Enfeksiyondan sonra, DC'ler, yardımcı uyarıcı moleküllere (yani CD40, CD80 ve CD86) ek olarak, yüzey majör histouyumluluk kompleksi (MHC) II'nin yukarı regülasyonu ile ilişkili bir olgunlaşma sürecinden geçer.

DC'lerin enfeksiyon sonucundaki rolünü anlamak, Leishmania'ya karşı immün yanıtı modüle etmek için terapötik ve profilaktik stratejiler geliştirmek için çok önemlidir. Bu makale, Leishmania-DC etkileşiminin karakterizasyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu ayrıntılı protokol, DC farklılaşması, hücre yüzey moleküllerinin karakterizasyonu ve enfeksiyon protokolleri boyunca rehberlik sağlayarak bilim adamlarının Leishmania enfeksiyonuna DC yanıtını araştırmasına ve bu hücrelerin enfeksiyon sırasında oynadığı roller hakkında fikir edinmesine olanak tanır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leishmaniasis, Leishmania cinsi1'in farklı türlerinin neden olduğu ihmal edilmiş hastalıkların bir kompleksini oluşturur. Leishmania , insanları ve diğer memelileri enfekte eden ve cilt lezyonlarından viseral formlara kadar değişen bir hastalık spektrumuna neden olan Trypanosomatidae familyasının hücre içi bir protozoanıdır2. Bu hastalığın ana klinik belirtileri tegumentary leishmaniasis (TL) ve visseral leishmaniasis'tir (VL). Dünya Sağlık Örgütü (WHO), yılda 700.000 ila 1 milyon yeni vakanın meydana geldiğini ve her yıl 70.000 ölüme neden olduğunu tahmin etmektedir2. Dünya çapında, leishmaniasis yaklaşık 12 ila 15 milyon insanı etkilemektedir ve 350 milyon kişi hastalığa yakalanma riski altındadır3.

Leishmania cinsi iki evrimsel form sunar: promastigot ve amastigot4. Leishmania promastigotları, flagella varlığı ve yüksek motilite ile karakterizedir. Bu formlar, kum sineğinin sindirim sisteminde bulunur ve burada enfektif forma (metasiklik promastigotlar) farklılaşırlar5. Buna karşılık, amastigotlar, enfekte olmuş memeli hücrelerinin hücre içi ortamında bulunur. Bu evrimsel form, sırayla, fagositik hücrelerin6 fagolizozomlarında çoğalır.

Leishmania spp.'nin bulaşma döngüsü, kanla beslenme sırasında, kum sineklerinin metasiklik promastigotları konakçının derisine aşıladığı zaman başlar1. Leishmania aşılamasından kısa bir süre sonra, nötrofiller ve dokuda yerleşik makrofajlar dahil olmak üzere doğuştan gelen bağışıklık hücreleri parazitleri fagositleştirir. Parazitoforöz vakuollerin içinde, Leishmania amastigotlara farklılaşır ve çoğalır, bu da komşu hücrelerin enfeksiyonuna ve parazitin yayılmasına izin veren konakçı hücre zarının yırtılmasıyla sonuçlanır4. Flebotominaslar, prosiklik promastigotlara ve daha sonra böceğin bağırsak sistemindeki metasiklik promastigotlarafarklılaşan amastigot içeren fagositleri yuttuğunda döngü tamamlanır 7.

Dokularda ve lenf düğümlerinde bulunan profesyonel antijen sunan hücreler olan dendritik hücreler, bağışıklık sistemi için bir nöbetçi görevi görür8. Bu hücreler, esas olarak antijen yakalama ve işlemede rol oynayan olgunlaşmamış aşamalarda periferik dokularda bulunur. Patojenlerle temastan sonra, DC'ler lenf düğümlerine göçleriyle sonuçlanan bir olgunlaşma sürecinden geçer ve daha sonra antijenleri saf CD4 + T hücrelerine sunar. Bu hücreler aynı zamanda tolerans veya iltihaplanma oluşturan doğuştan gelen ve uyarlanabilir bağışıklık tepkilerinin düzenlenmesinde de gereklidir9. DC olgunlaşma süreci, MHC'nin ve CD40 ve CD86 gibi uyarıcı moleküllerin artan ekspresyonunun yanı sıra gelişmiş sitokin sekresyonu dahil olmak üzere çeşitli yönleri içerir. DC'ler, CD11b ve CD11c dahil olmak üzere farklı belirteçleri eksprese eder ve insanlarda, CD14+ monositlerinden (moDC'ler) kaynaklanan DC'ler CD1a10'u eksprese eder. CCR7, DC'lerde yüksek oranda eksprese edilir ve bu hücrelerin karmaşık göç sürecinigösterir 12. CD209 ve CD80 ayrıca DC'ler ve lenfositler13 ile ilk temasta önemli bir rol oynar.

Leishmaniasis'te çalışmalar, moDC'lerin fagositozların parazitleri ve onları T hücrelerine antijen sundukları drenaj lenf düğümlerine (dLN'ler) ilettiğini göstermektedir13. Parazit yakalama mekanizması, fagositoz sırasında aktin filamentleri tarafından hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi ile ilişkilidir, bu da parazitin14 içselleştirilmesini destekler. Leishmaniasis'te DC'lerin oynadığı rollerle ilgili çoğu çalışma L. major, L. amazonensis ve L. braziliensis15'e odaklanmıştır. İlginç bir şekilde, Leishmania enfeksiyonunun in vivo çalışmaları, DC fonksiyonunun bozulmasının parazit suşuna özgü bir şekilde meydana geldiğini göstermiştir.

L. amazonensis enfeksiyonunun erken evrelerinde, DC'lerin parazit enfeksiyonunu sınırlama yeteneğinin azaldığı gösterilmiştir. Tersine, deneysel bir L. braziliensis enfeksiyonu modelinde, DC'lerin Leishmania sağkalımını kısıtlayan uygun bağışıklık tepkileri oluşturduğu gösterilmiştir16. Leishmania spp. enfeksiyonuna farklı yanıtlarla ilişkili olduğu bilinen başlıca yönler, DC olgunlaşma ve aktivasyon derecesidir. Bu makale, bu hücrelerin hastalık sonuçlarını nasıl etkilediğini daha iyi anlamak için insan DC'lerinin Leishmania enfeksiyonunda oynadığı rolü araştırmak için bir yöntemi açıklamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Hücreler sağlıklı donör gönüllülerden elde edilmiştir. Burada açıklanan prosedür Ulusal Etik Komitesi (sayı 2.751.345)-Fiocruz, Bahia, Brezilya tarafından onaylanmıştır.

1. İnsan dendritik hücrelerinin farklılaşması

  1. 10 mL polisikaroz-sodyum triazoat karışımını 50 mL konik tüplere pipetleyin.
  2. Her donör için sırasıyla 50 mL konik tüpleri etiketleyin.
  3. Sağlıklı donörlerden 30 mL kan toplayın ve sonraki tüm adımları laminer akış başlığında gerçekleştirin.
  4. Kanı dikkatlice konik tüplere aktarın ve kanı oda sıcaklığında 1: 1 oranında salin solüsyonunda (% 0.9 sodyum klorür) seyreltin.
  5. Yavaşça seyreltilmiş kanı tüplerdeki polisakroz-sodyum triazoat karışımının üzerine yerleştirin (adım 1.1). Tüpleri 400 × g'da bir kez 25 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Degrade katmanların karışmasını önlemek için santrifüjlemeden önce freni kapatın. İlk santrifüjlemeden sonra, santrifüjde sıcaklığı 4 °C'ye düşürün.
  6. Tüpleri dikkatlice santrifüjden çıkarın.
  7. Numunede periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) tarafından oluşturulan halkayı arayın (buffy coat); Kalan plazmayı bir pipetle dikkatlice aspire edin.
    NOT: Santrifüjleme, aşağıdaki gradyan katmanlarının oluşumuna yol açar: eritrositler, yoğunluk gradyan ortamı, PBMC halkası ve plazma. PBMC halkası, yoğunluk gradyan ortamı ile plazma katmanları arasındadır.
  8. Bulanık PBMC katmanını başka bir tüpe aktarın ve 30 mL'lik son hacme salin ekleyin.
  9. Hücre süspansiyonlarını içeren tüpleri 250 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti yeniden süspanse etmek için 1 mL salin ekleyin.
  10. Hücre sayımı için bir alikot toplayın ve 1: 1.000 oranında seyreltin. Hücre canlılığını belirlemek için bir Neubauer odası kullanarak tripan mavisi dışlama yöntemiyle hücreleri saymak için 10 μL seyreltilmiş hücre kullanın.
  11. Süspansiyonu 200 ° C'nin altında 10 dakika boyunca 4 × g'da tekrar döndürün.
  12. Manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralama (MACS) tamponunda peleti yeniden süspanse edin. 1 × 107 hücre başına 80 μL tampon kullanın.
    NOT: MACS tampon bileşimi için Tablo 1'e bakın. Tamponu soğuk tutun ve 2-8 °C'de saklayın.
  13. Adım 1.9'da hazırlanan hücre süspansiyonuna CD14 mikro boncukları ekleyin. 1 × 107 hücre başına 20 μL CD14 mikro boncuk kullanın.
    NOT: CD14 mikro boncukları, insan anti-CD14 içeren boncuklar, çoğu monositin yüzeyinde eksprese edilen CD14 + hücrelerine bağlandığından, PBMC'lerden insan monositlerini pozitif olarak seçmek için kullanılır.
  14. Peletleri ve mikro boncukları eşit şekilde yeniden süspanse etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin. 15 dakika buz üzerinde tutun.
  15. Süspansiyonu 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  16. MACS arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın. Hücre-mikroboncuk karışımında 1 × 10 7 hücre başına1-2 mL kullanın.
  17. Süspansiyonu 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  18. Süpernatanı çıkarın ve peleti 500 μL MACS tamponunda yeniden süspanse edin.
    NOT: Bu, bir sütunda işlenecek maksimum hücre süspansiyonu hacmidir.
  19. Manyetik sütunu monte edin.
  20. Kolonu 500 μL MACS tamponu ile bir kez yıkayın ve tamponun kolon boyunca yerçekimi altında akmasına izin verin.
    NOT: Hava kolonu tıkayabileceğinden, kolonun kurumasına izin vermemeye dikkat edin.
  21. Sütun başına 500 μL hücre boncuk süspansiyonu (adım 1.19) ekleyin. Hücre süspansiyonunun kolon boyunca yerçekimi altında akmasına izin verin.
  22. Kolonu 500 μL MACS tamponu (2x) ile yıkayın. Yalnızca sütun rezervuarı boş olduğunda yeni tampon ekleyin. Kolonun kurumasına izin vermeyin.
  23. Kolonun altına yeni bir tüp yerleştirin, 1 mL MACS tamponunu kolona pipetleyin ve pistonu sıkıca iterek manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri hemen kolondan boşaltın.
  24. CD14 ile zenginleştirilmiş hücreleri 300 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  25. Bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın.
  26. Hücreleri 100 μL / mL interlökin-4 (IL-4) ( (50 ng / mL) + granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) (50 ng / mL) ile 1 mL tam RPMI'de yeniden süspanse edin.
  27. Yukarıdaki sitokinleri içeren 500 μL tam RPMI ortamında oyuk başına 2 × 105 hücre konsantrasyonunda 24 oyuklu bir plaka üzerinde tohum hücreleri ve 37 ° C'de 7 gün boyunca inkübe edin.

2. Leishmania kültürü

NOT: Bu testte L. amazonensis (MHOM/BR88/Ba-125) parazitleri kullanılmıştır.

  1. 24 ° C'de bir Biyo-Oksijen İhtiyacı (BOİ) inkübatöründe 25 cm'lik 2 kültür şişesinde 5 mL Schneider tam ortamı veya Minimum Esansiyel Ortamı (MEM) ile Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) kanlı agar ortamında promastigotları koruyun.
    NOT: L. amazonensis türünün promastigot formunu yetiştirmek için, 5 mL Schneider'in tam besiyeri (%10 inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ve 50 μg/mL konsantrasyonda gentamisin içeren Schneider'in Böcek Besiyeri) kullanılmıştır.
  2. BOD inkübatöründe 24 ° C'de 7 gün inkübe edin.
  3. 100 μL promastigot kültürünü 25cm2'lik yeni bir hücre kültürü şişesine pipetleyin.
  4. Takviye edilmiş MEM'den 5 mL ekleyin.
  5. BOD inkübatöründe 24 ° C'de inkübe edin ve salinle seyreltilmiş parazit hücresi süspansiyonunun bir alikotunu bir Neubauer odasına (yani hemositometre) sabit faza ulaşılana kadar aktararak promastigotları periyodik olarak sayın.
    NOT: Deneyler için NNN Medium'dan sonraki ilk pasajı kullanmayın.
  6. Leishmania sabit büyüme fazı promastigotlarının 1 × 10:5'ini yeni bir 25cm2 hücre kültürü şişesine aktarın ve 5 mL takviye edilmiş MEM ekleyin.
  7. Durağan faz elde edilene kadar bir Neubauer odası kullanarak kültürlerin büyümesini periyodik olarak izleyin.
    NOT: Virülans kaybını önlemek için in vitro olarak 7 geçişe kadar promastigot kültürleri kullanın.

3. Leishmania enfeksiyonu

  1. Kültürlenmiş parazitlerin durağan faz büyümesini doğruladıktan sonra, tüm içeriği kültür şişelerinden çıkarın ve bunları 50 mL konik tüplere yerleştirin. 30 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için soğuk tuzlu su çözeltisi ekleyin.
  2. 4 ° C'de 1.600 × g'da üç kez 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın ve peleti soğuk tuzlu su çözeltisinde yeniden süspanse edin.
  3. Canlı olmayan parazitleri gidermek için hücreleri yıkayın ve peleti 1 mL soğuk tuzlu su içinde yeniden süspanse edin. Parazit kümelerini ayırmak için süspansiyonu 16 G'lik bir iğne ile donatılmış 1 mL'lik bir şırıngadan 5 kez yavaşça geçirin.
  4. Eq (1) kullanarak bir hemositometredeki parazit konsantrasyonunu saymak için numuneden bir alikot çıkarın.
    Parazit konsantrasyonu = 4 kadrandaki parazitlerin ortalaması × seyreltme faktörü × 104 (1)
  5. Leishmania sp miktarını hesaplayın.10: 1 parazit: konak hücre oranını korumak için kaplanacak konak hücre sayısı için gereklidir (adım 1.27).
  6. DC'leri 1 mL tuzlu su çözeltisi ekleyerek ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 × g'da üç kez santrifüjleyerek yıkayın.
  7. 24 oyuklu hücre kültürü plakasının her bir oyuğuna gerekli hacimde Leishmania yerleştirin (bkz. adım 3.5).
  8. DC'leri% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de bir inkübatörde 4 saat boyunca parazitlerle inkübe edin.

4. Akış sitometrisi analizi için immün boyama

  1. Enfeksiyondan sonra, içselleştirilmemiş parazitleri uzaklaştırmak için hücreleri 1 mL tuzlu su çözeltisi ile iki kez yıkayın.
    NOT: Antikor klonları ve florokromları içeren panel, Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
  2. Deneysel koşul başına 50 μL'lik bir nihai hacimde floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponunda (% 1 BSA ile 1x PBS) seyreltik antikorlar (1:50).
    NOT: Optimum boyama konsantrasyonlarını sağlamak için deneyden önce antikorları titre etmek önemlidir. Bu protokolde titrasyon deneylerinden sonra 1:50 kullanılmıştır.
  3. Bir ana karışım hazırlayın (% 1 BSA + antikor karışımı ile 1x PBS). Vorteks ve pipet 50 μL içeren hücrelerdeki karışım.
  4. DC'leri antikor karışımı (anti-insan CD1a, anti-insan CCR7, anti-insan CD83, anti-CD11c, anti-insan CD209, anti-insan HLA-DR) ile 30 dakika boyunca buz üzerinde ışıktan korunarak kısaca inkübe edin.
  5. Hücreleri 1 mL soğuk boyama tamponu (1x PBS'de %1 FBS) ile iki kez yıkayın ve 300 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  6. Süpernatanı aspire edin ve peleti 200 μL soğuk boyama tamponunda yeniden süspanse edin.
  7. Bir akış sitometresinde veri toplamaya devam edin.
    NOT: FACS analizi için en uygun koşulları sağlamak için, numune boyamadan sonraki 48 saat içinde veri toplama işlemi gerçekleştirilmelidir. Veriler FlowJo yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir.
    1. FlowJo yazılım programını açın ve yeni bir çalışma alanı oluşturun. Analiz edilecek akış sitometri dosyalarını çalışma alanı penceresine sürükleyerek ekleyin.
    2. Yan saçılma (SSC) ve ileri saçılma (FSC) parametrelerini seçmek için tüp adına tıklayın.
      NOT: DC olgunlaşmasının akış sitometrik analizi, CD1a, CD11c, CD80, CCR7, CD209 ve HLA-DR ekspresyonuna dayanıyordu.
    3. Çokgen geçit aracını kullanarak DC'lerin etrafına bir geçit çizin. Yeni bir pencere görüntülemek için seçilen geçitli hücrelere çift tıklayın. FSC-A ve FSC-H parametrelerini seçerek çift temizleme gerçekleştirin. Çokgen aracını kullanarak, tek tek hücrelerin etrafına yeni bir çizim çizin.
    4. Kapılı hücrelere çift tıklayın ve CD11c+ hücreleri içeren bir geçit oluşturmak için SSC ve CD11c parametrelerini seçin.
    5. Temizlenmiş CD11c+ hücre kapağını seçerek dışa aktarın. Kapıya sağ tıklayın ve Eşdeğer düğümleri seç seçeneğini seçin. Kapıya sağ tıklayın ve yakın zamanda oluşturulan bir klasöre kaydederek tüm telafi edilmiş parametrelerle birlikte dışa aktarın.
    6. Son kaydedilen dosyaları açarak yeni bir çalışma alanı oluşturun. Çalışma Alanı'na tıklayın ve eklentileri seçin | Alt Numune | 30.000 ila 50.000 olay; Tamam'a basın.
      NOT: TSNE hem zaman alıcı hem de hesaplama açısından zorlu bir süreç olduğundan, analiz edilen olayların toplam sayısını azaltmak için bu adım önerilir.
    7. Altörneklenmiş bir dosyaya sağ tıklayın ve eşdeğer düğümleri seçin.
    8. Alt örneklenmiş bir dosyaya sağ tıklayın ve Dışa Aktar/birleştir'i seçin.
    9. Birleştir penceresine tıklayın ve tüm telafi edilmiş parametreleri seçin. Birleştirilmiş dosyaları seçin ve çalışma alanı | eklenti | tSNE'ye tıklayın.
    10. Kümeler oluşturmak için istenen parametreleri (CD1a, HLA-DR, CCR7, CD80, CD209 ve CD11c) seçin. Tamam'a basın.
    11. tSNE1 ve tSNE2 parametrelerini görselleştirmek için birleştirilmiş dosyaya tıklayın.

5. Aktin immün boyama

  1. 24 oyuklu plakalara yerleştirilen lameller üzerindeki plaka enfekte DC'ler. Plakaları 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Hücre dışı parazitleri gidermek için enfeksiyondan sonra hücreleri 3x steril tuzlu su ile oda sıcaklığında yıkayın.
  2. DC'leri 500 μL% 4 paraformaldehit ile oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Paraformaldehiti çıkarın ve 1 mL salin ekleyin (bakınız Tablo 1).

6. İmmün etiketleme

NOT: Çalkalama altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.

  1. Lamelleri 1x PBS ile 5 dakika yıkayın; 3x tekrarlayın. Kuyucuk başına 500 μL amonyum klorür çözeltisi ekleyin; Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
  2. Lamelleri 1x PBS ile 5 dakika yıkayın; 3x tekrarlayın.
  3. Membranı 15 dakika boyunca% 0.15 Saponin ile geçirgenleştirin.
  4. 1x PBS 1x/%3 BSA/%0.15 saponin ile 1 saat bloke edin. Lamelleri 1x PBS/%0.15 saponin ile 5 dakika yıkayın; 3x tekrarlayın.
  5. Hücreleri 1x PBS /% 1 BSA ve% 0.15 saponin içinde seyreltilmiş phalloidin (1: 1.200) ile 1 saat inkübe edin. Lamelleri 1x PBS/%0.15 saponin ile 5 dakika yıkayın; 3x tekrarlayın.
  6. Lamelleri, hücreleri aşağı bakacak şekilde 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile montaj ortamına yerleştirin. Slaytları ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün.
  7. 63x/1.4 objektifli konfokal floresan mikroskobu kullanarak görüntüler elde edin.

7. Konfokal mikroskopi alımı ve Fiji miktar tayini

  1. Konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak immünofloresan görüntüler yakalayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
    NOT: En iyi çözünürlük için 63x objektif yağa daldırma lensi kullanın.
  2. Lamelleri ışıktan koruyun ve almadan önce en az 30 dakika oda sıcaklığında bırakın.
  3. Lamelleri temizlemek için emici doku kullanın. Objektife bir damla daldırma yağı ekleyin ve slaydı mikroskop tablasına yerleştirin. Yağ ile 63x objektifi seçin, yağ slayta temas edene kadar platformu kaldırın ve mikroskop üzerindeki odağı ayarlayın.
  4. Programı açın ve 488, 552 ve 405 nm lazer dalga boylarını etkinleştirin.
  5. Görüntü çözünürlüğünü 1024 x 1024 piksel olarak ayarlayın.
  6. Canlı alta tıklayın, Z yığınını ayarlayın ve Başlat'a basın. Bu işlemi tekrarlayın ve ardından Bitir düğmesine basın.
  7. Görüntü alımının tamamlanmasını bekleyin ve ardından araçlarda Maksimum Projeksiyon seçeneğini belirleyin.
  8. Deneyi kaydedin ve .lif biçimindeki görüntüleri bir bilgisayara aktarın.
  9. FIJI programını açın, denemeyi FIJI'de açın ve görünüm yığınını Hyperstack olarak ayarlayın.
  10. Açık görüntü dosyalarını tek tek seçin | döşemeleri dikin.
  11. Fiji araç çubuğunda serbest el aracını seçin ve her hücreyi elle dikkatlice izleyin. Floresan yoğunluğunu görselleştirmek için analiz | düğmesine basın. Her grup için her hücre türü için bu işlemi yineleyin.
  12. Ölçümleri kaydedin ve bir elektronik tabloya aktarın. İstatistiksel analiz yapmak için istatistiksel analiz yazılımı kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakın) veri içeren dosyayı açın.

8. İstatistiksel analiz

  1. Yazılımda yeni bir proje açın.
  2. Normal dağılıma sahip veriler için Student'ın t-testini kullanın; parametrik olmayan veriler için Mann-Whitney U testini kullanın.
  3. Deney sonuçlarından elde edilen değerleri tabloya yapıştırın.
  4. Tanımlayıcı istatistikleri seçin ve veri dağılımını analiz etmek için istatistikler [tüm testler] sütun sütununu seçin.
    NOT: Veriler Gauss dağılımını takip ediyorsa, iki çifti karşılaştırarak örnekleri incelemek için t-testini seçin. Dağılım Gauss değilse, merkezi eğilim ölçüleri (ortalamalar veya medyanlar) ve varyasyon ölçüleri ile Mann-Whitney U testini kullanarak verileri analiz edin.
  5. En iyi veri gösterimi için en iyi grafik seçeneğini belirleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor, akım sitometrisi ve konfokal mikroskopi kullanarak DC'lerin Leishmania enfeksiyonundaki rolünü araştırmaktadır. Başlangıçta, insan monositinden türetilmiş DC'nin fenotipik profili oluşturuldu. Özellikle, elde edilen CD11c + dendritik hücre popülasyonları CCR7, CD209, CD80, CD1a ve HLA-DR için pozitifti. Sonuçlar, DC popülasyonlarında bu belirteçlerin ekspresyonunun Leishmania enfeksiyonundan derinden etkilendiğini göstermektedir. Enfekte DC'ler artırılmış CD80, CD209, CCR7 ve HLA-DR...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leishmaniasis dünya çapında ciddi bir halk sağlığı sorunudur. Bu hastalığın patogenezi oldukça karmaşıktır ve omurgalı konakçılarda parazit sağkalımını destekleyen mekanizmalar hala belirsizdir17. DC'ler, filtreleme ve lenfoid organlar dahil olmak üzere vücudun her yerinde bulunan profesyonel antijen sunan hücrelerdir. Antijen yakalama ve işlemeyi takiben, olgunlaşmamış DC'ler, bu hücrelerin antijenleri T lenfositlerine18 sunmaktan sorumlu ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gonçalo Moniz Enstitüsü'ne (IGM-Fiocruz) (Bahia, Brezilya) ve mikroskopi bölümüne yardımları için teşekkür ederiz. Yazarlar, eleştirel analiz, İngilizce dil revizyonu ve el yazması kopya düzenleme yardımı için Andris K. Walter'a minnettardır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
anti CCR7Termo
anti CD209Isofarma
anti CD83Leica SP8
anti HLA-DRGibco
Sığır serum albüminiThermoA2153-100GSigma
SiprofloksasinGibco
konfokal mikroskopThermo Fisher Bilimsel
Fetal sığır serumuGibco
Flow JoThermo Fisher Bilimsel
GentamisinThermo Fisher Bilimsel
GlutaminGibco
HEPESThermo Fisher Bilimsel
phalloidinThermo Fisher Bilimsel
Fosfat tampon çözeltisiPeprotech
uzun süreli altın antifade kitiBD pharmigen
RPMIBD pharmigen
SaponinBD pharmigen47036 – 50G – FSigma
Schneider'in böcek ortamıyazılımı BD biosciences

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Torres-Guerrero, E., Qunitanilla-Cedillo, M. R., Ruiz-Esmenhjaud, J., Arenas, R. Leishmaniasis: a review. F1000 Research. 6, 750(2017).
  2. Pace, D. Leishmaniasis. Journal of Infection. 69, Suppl 1 10-18 (2014).
  3. Reithinger, R., et al. Cutaneous leishmaniasis. Lancet. Infectious Diseases. 7 (9), 581-596 (2007).
  4. Kaye, P., Scott, P. Leishmaniasis: complexity at the host-pathogen interface. Nature Reviews. Microbiology. 9 (8), 604-615 (2011).
  5. Handman, E., Bullen, D. V. Interaction of Leishmania with the host macrophage. Trends in Parasitology. 18 (8), 332-334 (2002).
  6. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  7. Kamhawi, S. Phlebotomine sand flies and Leishmania parasites: friends or foes. Trends in Parasitology. 22 (9), 439-445 (2006).
  8. Guilliams, M., et al. Unsupervised high-dimensional analysis aligns dendritic cells across tissues and species. Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).
  9. Moll, H. Dendritic cells and host resistance to infection. Cellular Microbiology. 5 (8), 493-500 (2003).
  10. Sundquist, M., Rydstrom, A., Wick, M. J. Immunity to Salmonella from a dendritic point of view. Cellular Microbiology. 6 (1), 1-11 (2004).
  11. Saban, D. The chemokine receptor CCR7 expressed by dendritic cells: A key player in corneal and ocular surface inflammation. Ocular Surface Journal. 12, 87-99 (2014).
  12. Relloso, M., et al. DC-SIGN (CD209) Expression is IL-4 dependent and it is negatively regulated by IFN, TGF and inflammatory agents. Journal of Immunology. 168 (6), 2634-2643 (2002).
  13. Leon, B., Lopez-Bravo, M., Ardavin, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  14. Gordon, S. Phagocytosis: An immunobiologic process. Immunity. 44 (3), 463-475 (2016).
  15. Ashok, D., Acha-Orbea, H. Timing is everything: dendritic cell subsets in murine Leishmania infection. Trends in Parasitology. 30 (10), 499-507 (2014).
  16. Carvalho, A. K., et al. Leishmania (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis promote differential expression of dendritic cells and cellular immune response in murine model. Parasite Immunology. 34 (8-9), 395-403 (2012).
  17. Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. International Journal of Parasitology. 37 (10), 1097-1106 (2007).
  18. Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (8), 3012-3017 (2012).
  19. Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1263-1272 (1994).
  20. Suzuki, H., et al. Activities of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-3 on monocytes. American Journal of Hematology. 75 (4), 179-189 (2004).
  21. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews. Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).
  22. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  23. Sanderson, M. J., et al. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 10, 1795(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dendritik H cre DiferansiyasyonuDendritik H cre Mark rlarAntijen SunumuBa kl k Yan t Mod lasyonuMHC II EkspresyonuKostim lat r Molek llerDC Olgunla masPatojen Yakalama
Video yakında

İlgili makaleler