Kardiyak Trabeculae Ex Vivo'nun Eşzamanlı Brightfield, Floresan ve Optik Tutarlılık Tomografik Görüntülemesi

Summary

Bu protokol, aktif olarak kasıtlı bir kardiyak trabecula ex vivo'dansarkom, kalsiyum ve makroskopik geometrik verilerin bir koleksiyonunu sunar. Bu eşzamanlı ölçümler üç görüntüleme yönteminin entegrasyonu ile mümkün olmaktadır.

Abstract

Kalp kasında hücre içi Ca²⁺ geçiciler kasılma miyofilamentlerini aktive ederek kasılma, makroskopik kısaltma ve geometrik deformasyona neden olur. Bu olaylar arasındaki iç ilişkilere ilişkin anlayışımız sınırlıdır, çünkü ne kasın içini 'görebiliriz' ne de heyecan-kasılma dinamiklerinin mekansal-zamansal doğasını tam olarak takip edebiliriz. Bu sorunları çözmek için, bir dizi görüntüleme modalitesini birleştiren bir cihaz inşa ettik. Özellikle, sarkom uzunluğu ve doku zorlanmasının yerel değişikliklerini ölçmek için parlak alan mikroskobu, Ca²⁺ geçicisini görselleştirmek için bir floresan mikroskobu ve bir kalp döngüsünün zaman dilimi boyunca dokunun geometrik değişikliklerini yakalamak için optik bir tutarlılık tomografı entegre eder. Burada görüntüleme altyapısını ve ilişkili veri toplama çerçevesini sunuyoruz. Veriler trabeculae carneae olarak bilinen izole çubuk benzeri doku yapılarından toplanır. Cihazımızda, bir çift konum kontrollü platin kanca, bir ex vivo kas örneğinin her ucunu tutarken, besin bakımından zengin salin çözeltisi ile sürekli olarak aşılanır. Kancalar bağımsız kontrol altındadır ve kas uzunluğunun ve kuvvetinin gerçek zamanlı kontrolüne izin verilir. Uzunlamasına çeviri, mikroskop görüntüleme penceresinin göreli boyutu (540 μm ile 540 μm) ve tipik bir trabecula (>2000 μm) uzunluğu ile ilişkili sınırlamaların üstesinden gelen numunenin parça parça taranmasına olanak tanır. Kas odasının her iki ucundaki platin elektrotlar trabecula'yı kullanıcı tanımlı bir hızda uyarır. Stimülasyon sinyalini, her görüntüleme penceresindeki verileri senkronize etmek için bir tetikleyici olarak kullanıyoruz ve tüm örnek seğirmeyi sabit durum koşullarında yeniden yapılandırıyoruz. Bu parlak alan görüntüleme verilerine görüntü işleme tekniklerinin uygulanması doku yer değiştirme ve sarkom uzunluğu haritaları sağlar. Böyle bir veri koleksiyonu, bir deney modelleme boru hattına dahil edildiğinde, fizyoloji ve patofizyolojide kas kontrtilasyon homojenliği ve heterojenliği hakkında daha derin bir anlayış sağlayacaktır.

Introduction

İzole kardiyak kas dokusu preparatlarının superfüzyonu, kardiyak iyonik aktivasyon ve mekaniği incelemek için standart ve yaygın olarak kullanılan bir protokoldür¹. Özellikle, trabeculae, çubuk benzeri yapıların ventrikül duvarlarından izolasyonu, kasılma^2'ninuzunluğa bağlı aktivasyonu, kasılma^3,4'ünstreç bağımlı yanıtı ve kardiyak dokunun diyastolik viskoelastisite⁵ dahil olmak üzere fenomenlerin değerlendirilmesini sağlamıştır. Ter Keurs, izole trabeculae superfusing bu tekniğin başlatıcısı, başlangıçta Ca^{2 +} ölçümleri için floresan görüntüleme ve sarkom uzunlukları belirlemek için lazer kırınım bir kombinasyonu kullandı^2,5. Bu ilk çalışmalardan bu yana, parlak alan mikroskopi görüntülerinde 2D hızlı Fourier dönüşümü (FFT) tabanlı teknikler⁶ kullanarak sarkom uzunluğu bilgilerini daha büyük bir mekansal çözünürlükle çıkarmak giderek yaygınlaşmıştır. İki görüntüleme sistemi, Ca²⁺ salınımı ile sarkom uzunluğuna bağımlı kuvvet üretimi arasındaki temel ilişkinin kısmi olarak değerlendirilmesini sağlar.

Kalp kası, kalın ve kalın filamentlerden oluşan alttaki bir dizi kontrtil ünite ile ilişkili görünür bantlama ile çizgili. Sarkomları oluşturan bu kurucu filamentlerin etkileşimi, kuvvet üretimine şu şekilde başlar: depolarize edici bir elektrik sinyali veya eylem potansiyeli, hücre zarında voltaja bağımlı L tipi Ca²⁺ kanallarının açılmasına neden olur; Ca 2+ hücresel akını, Ca²⁺ indüklenen Ca²⁺ sürümü⁷olarak bilinen bir süreçte, hücre içi bir Ca²⁺ deposu olan sarkoplazmik retikulumdan (SR) Ca²⁺salınımını tetikler; hücre içi Ca²⁺ konsantrasyonundaki bu ani artış nanomolardan mikromolar aralığa kadar kuvvet üretiminin gerçekleşmesini sağlar; Ca²⁺ pompaları, sitozolden SR ve hücre dışı bölmeye sürekli olarak Ca²⁺ ekstrüde eder; hücre içi Ca²⁺ konsantrasyonu nanomolar aralığa geri döndüğünde, kuvvet üretimi durur ve kas gevşer. Kuvvet üretimi sırasında, kurucu kalın ve ince filamentler birbirlerinin üzerine kayar. Sarkom uzunluğu, örtüşmemiş uzayının göreceli boyutunu ve bu nedenle kasın makroskopik olarak kuvvet üretimi potansiyelini belirler.

Bu yazıda, bu floresan-parlak alan görüntüleme tekniklerini optik tutarlılık tomografisini (OCT) içerecek şekilde genişletiyoruz. OCT, fiziksel girişim prensibini kullanır ve kas kontrtil heterojenliğini anlamak için dokunun geometrik deformasyonunu toplayabilir⁸. Cihazımız(Şekil 1)spektral etki alanı OCT (SD-OCT) sistemi kullanır. SD-OCT'de bir ışın ayırıcı, ışığı geniş bant kısa tutarlılık uzunluğundaki süperlüminesan diyottan referans ve ölçüm kollarına böler. Referans kolu sabit bir ayna içerir ve ölçüm kolu ışığı yönlendirmek için bir 2D galvanometre içerir. Numuneden geriye doğru saçılan ışık toplanır ve bir parazit deseni oluşturmak için referans kolundaki yansıyan ışığa müdahale eder. Derinlik bilgisi spektral saçak frekansında kodlanmıştır. Bilgileri ayıklamak için sinyal bir spektrometreden geçirilir ve sonuca ters bir FFT uygulanır. karşılık gelen 1D sinyal, kırılma indisi^9'daki (A-scan) değişikliklere karşılık gelen farklı derinliklerdeki yapıları temsil eder. Lazeri tek bir eksende yönlendirerek, ilgi örneğinin bir kesitini (B taraması) oluşturabilir ve benzer şekilde, işlemi kalan eksende adım adım bir desende tekrarlayarak, üç boyutlu bir görüntü oluşturulabilir (C-taraması). Uzantı olarak, harici bir tetikleyiciye dayalı olarak yinelenen bir zaman değişen konu için tek bir dilimde bir dizi B taraması toplayabilir ve zaman değişen düzlemsal görüntü^10'utemsil eden üç boyutlu bir tarama oluşturmak için tekrarlayabilir.

Üç görüntüleme sistemini entegre ederken, aşağıdaki iki ilkeyi göz önünde bulundurduk. Birincisi, görüntüleme sensörleri ışığı alternatif bir görüntüleme yönteminden algılamamalı ve ikincisi, fiziksel tasarım en az üç eşzamanlı görüntüleme düzlemleri için boş alan içermelidir. İlk gereksinimi gidermek için brightfield mikroskobu, numuneyi ters bir konfigürasyonda aydınlatmak için 660 nm dalga boyu LED'i kullanır. Floresan mikroskobu, yayılan ışığın hem çıkarılması hem de toplanması için aynı objektif lensin kullanıldığı bir epifluoresans konfigürasyonundadır. Heyecan ışığı 340 nm ile 380 nm arasında bir dalga boyuna sahiptir ve bir fotomultiplier tüp (PMT) yayılan ışığı 510 nm dalga boyunda ölçer. Bir çift dikroik ayna, bu iki optik yolu ters ölçüme müdahale etmeden aynı fiziksel ayak izini paylaşmasını sağlar (Şekil 2). Son olarak, OCT, diğer iki modaliteden farklı olarak merkezi dalga boyu 840 nm olan geniş bant (100 nm spektral genişlik) ışığı kullanır. OCT için kullanılan ışığın düşük tutarlılık doğası nedeniyle, parlak alan floresan kaynaklarından gelen dağınık ışık, derinlik bilgilerini kodlayan parazit desenine katkıda bulunmaz. İkinci gereksinim için, kılcal boru için gövde tasarımı, numunenin ön, alt ve üstün düzlemlerine erişilebilir optik yollara sahiptir. Deneyler sırasında, iki platin kanca, oksijenli Krebs-Henseleit (KH) çözeltisi ile perfüzyona uğramış bir kılcal tüp içinde bir trabecula tutar. OCT'nin galvanometre kafası, üçüncü ortogonal optik düzlemden yararlanmak için ortogonal olarak parlak alan floresan görüntüleme yoluna yönlendirilir (Şekil 3).

Bu makalede, kalsiyum, sarkom uzunluğu ve kas geometrisini aynı anda görüntüleyebilen bir cihaz oluşturmak için tasarım konuları özetlenmiştir. Bu ölçüm yeteneklerini göstermek için, bir ventrikül trabeculasının izole edilmesi, gerekli tampon çözeltilerinin hazırlanması ve bir ex vivo trabecula'nın taşınması ve floresan yüklenmesinde yer alan kritik adımları açıklıyoruz. Son olarak, bu makalede veri kümesini daha kullanışlı görselleştirmelere çevirmek için gereken işlemler özetlenmiştir.

Protocol

Auckland Üniversitesi Hayvan Etik Kurulu, sıçanların işlenmesini ve doku örneklerinin hazırlanmasını onayladı.

1. Görüntüleme kalibrasyonu

1. Brightfield mikroskop piksel kalibrasyonu
   1. Ölçüm odasını damıtılmış su ile doldurun.
   2. Ölçüm odasına μm başına bilinen çizgilere sahip bir kırınım ızgarası yerleştirin.
   3. Yakalamayı etkinleştirmek için F1 tuşuna basın ve kırınım ızgarası net bir şekilde görünene kadar Kare Hızını [Hz] ayarlayın (Şekil 4A). Kırınım ızgarasının çerçevenin kenarıyla paralel çalıştığından emin olun. Yakalamayı durdurmak için F1 tuşuna tekrar basın.
   4. Yakalamak için Toplam Görüntü'yü bir olarak ayarlayın, verileri diske akış için Ctrl + Shift + S tuşlarına basın ve kırınım ızgarasının görüntüsünü yakalamak için F1 tuşuna basın.
   5. ImageJ'yi açın ve kırınım ızgara görüntüsünü içe aktarın(Dosya > Aç > Kalibrasyon görüntüsünü seçin). Kaydırmayı tutarak, kırınım ızgarasının 20 açık ve koyu bandını kapsayan bir çizgi çizin.
   6. Görüntüyü kalibre edin (> Set Ölçeğini Analiz Edin). Adım 1.1.5'teki çizginin uzunluğu Uzaklık değerini Piksel cinsinden ayarlar. Bilinen Mesafe değerini μm ölçüm başına çizgilerin 20 katına ve Uzunluk Birimi'ni μm olarak ayarlayın. Ölçeğin tersi, bir pikselle temsil edilen mikrometre sayısıdır.
2. OCT derinlik çözünürlüğü kalibrasyonu
   1. Vernier kaliperleri kullanarak cam mikroskop kaydırağı kalınlığını ölçün.
   2. OCT lazer kaynağını açın.
   3. Galvanometre kafasını örtün ve arka plan parazit desenini ölçmek ve ölçümden çıkarmak için BG Al'ı tıklatın (Şekil 4B).
   4. Ölçülen cam mikroskop kaydıranı (Adım 1.2.1'den itibaren) OCT'nin ölçüm koluna sıkıştırın.
   5. OCT görüntüsünü görüntülemek için Canlı Akış'ı tıklatın. Cam mikroskop kaydıranı B taramasında görünene kadar ayarlayın.
   6. B tarama görüntüsünü yakalamak için, Aralık Y'yi (Adımlar) bir olarak ayarlayın, Akış B tarama Verileri?öğesini tıklatın ve Edin'i tıklatın.
   7. B tarama görüntüsünü ImageJ'ye alın(Dosya > Aç > B taramasını seçin). Kaydırmayı tutun, cam mikroskop slaytının sınırları arasında bir çizgi çizin.
   8. Ölçeği ayarlayın (Ölçeği > Analiz Et). Bilinen Mesafeyi Adım 1.2.1'de toplanan ölçüme ayarlayın.
   9. Havadaki derinlik çözünürlüğünü hesaplamak için, piksel başına ölçümün_camla çarparak mikroskop slaydının kırılma indisi (n cam =^{1.5175) 11} için düzeltin.
      NOT: Alıntılanan n_cam borosilikat cam içindir. Mikroskop slaytları farklı malzemelerden yapılabilir. Ölçülen slayt için uygun kırılma dizinini kullanın.
   10. Miyokard için derinlik çözünürlüğünü ölçeklendirmek için değeri Adım 1.2.9'dan bölün. n_miyokard = 1,38 (daha önce bildirilen değer^12).

2. Kas örneği hazırlama

1. Diseksiyon teçhizatını hazırlayın.
   1. Diseksiyon çözeltisinin bir kısmını (Tablo 1'deözetlenmiştir) küçük bir metal kaseye dökün ve kalp eksizyondan yaklaşık bir saat önce dondurucuya yerleştirin.
   2. Diseksiyon çözeltisinin iyi oksijenli (%100 oksijen) olmasını ve boru hatlarının her birini yıkamasını sağlayan bir diseksiyon makinesi kurun. Diseksiyon odasını oksijenli diseksiyon çözeltisi ile doldurun ve perfüzyon kateterinin etrafına 3/0 dikişi gevşek bir şekilde bağlayın.
2. Kalbi genişlet.
   1. Gazlı izofluran kullanarak 8-10 haftalık Wistar sıçanı uyuşturmak (<% 5 oksijen). Kuyruk sıkışması ile anesteziyi onaylayın.
   2. Uyuşturulmış sıçanı sırtüstü bir pozisyonda yerleştirin ve heparin çözeltisi (1000 IU/kg) ile karın bölgesine deri altı enjekte edin. Heparinin dolaşması için anesteziyi beş dakika daha koruyun.
   3. Diseksiyon çözeltisi içeren metal hazneyi dondurucudan alın ve ötenazi tezgahının yanına yerleştirin.
      NOT: Diseksiyon çözeltisini tamamen dondurarak parçalanmış kalbin tamamen batırılmasını sağlayın.
   4. Uyuşturulan sıçanı ötenazi kürsüsüne aktarın ve servikal çıkık ile ötenazi.
   5. Sıçan göğsünü makasla açın, önce göğüs kafesinin alt kısmı boyunca vücut duvarını, ardından diyaframı, göğüs kafesinin yanal sınırları boyunca ilerlemeden önce kesin. Göğsünü yoldan çek.
   6. Kalbi bir elinizle tutun, diğer el ise bağlantı damarlarını kesmek için bir çift kavisli makas kullanır (aort, vena kava, vb.).
   7. Kalbi hızlı bir şekilde soğuk diseksiyon çözeltisi içine batırın.
3. Bir trabecula izole et.
   1. Kalp metal kaptayken aortu tanımlayın, ardından kalbi diseksiyon odasına aktarın. İki kavisli toparlama kullanarak, aortu perfüzyon kanülü üzerine çekin.
   2. Aortu bir asa ile yerinde tutun. Bu arada, diseksiyon çözeltisinin perfüzyon kanülden akmasını sağlamak için boru hattını açın.
      NOT: Kalp eksizyonunu takip eden dakika içinde perfüzyonu tamamlamayı hedefleyin.
   3. Koroner vaskülat kandan temizlendikten ve kalp diseksiyon çözeltisi ile tamamen perfüzyona maruz kaldıktan sonra, perfüzyon akışını durdurun ve dikişi kullanarak aortu yerine sabitleyin. Akışı tekrar açın ve konserve kalbi perfüze edin.
   4. Kanülleri, sol koroner arterin üst yüzeyde görülebilmesi için döndürün. Kalbin tepesini diseksiyon odasının altına sabitle(Şekil 5A). Her iki aryayı da kesin (Şekil 5B).
   5. Bir dizi yay makası ile, septumun sağ tarafı boyunca kalbin tepeye kesin (Şekil 5B'debelirtildiği gibi). Açılan sol ventrikülü diseksiyon odasının tabanına sabitle. Daha sonra septumun sol tarafı boyunca kesin, sağ ventrikülü açın ve diseksiyon odasının tabanına da sabitleyin (Şekil 5C).
      NOT: Ventrikülleri açık bir pozisyonda sabitlemek için bazı papiller kasların kesilmesi gerekecektir. Sağ ventrikülde serbest çalışan bir trabecula tanımlayın (Şekil 5D-E).
   6. Yay makası ve bir tostluk kullanarak, trabecula'yı çevreleyen duvar dokusunu kesin, sonra duvar dokusunu trabecula yönüne ortogonal olarak ikiye bölün. Duvar dokusunu, boyutu kullanılan montaj konfigürasyonuna uygun olana kadar kırpın. Bu durumda, bir susam tohumunun yaklaşık yarısı büyüklüğünde (Şekil 5F).
      NOT: Trabeculae sağ ve sol ventriküllerden ayrılabilir, ancak soldan gelenler genellikle daha bulanıktır ve sarkom ve geometri ölçümleri için daha az uygulanabilir.
   7. Eksizlenmiş trabeculayı diseksiyon odasında bırakın, diseksiyon çözeltisi ile sürekli olarak süperfüzyon.

3. Deneysel protokol

NOT: Bu deneme için kullanılan^{cihaz 13} şirket içinde oluşturulmuş ve özel kontrol kodu kullanır. Bu verileri çoğaltmak için üretilen bir cihazın tasarımı için gerekli hususlar, bağımsız olarak çalışan iki montaj kancası, üç optik olarak net eksenli bir ölçüm odası (Şekil 3) ve brightfield ve OCT kameralarını uyarıcı ile senkronize eden harici bir tetik hattıdır. PMT voltajı ve kuvvet sinyali analog DAQ kartları kullanılarak, OCT ve brightfield mikroskopundan görüntüler Camera Link çerçeve tutucu kartları kullanılarak, uyarıcı sinyal ise dijital I/O kartı kullanılarak toplanarak toplanmıştı. Veriler, zamansal hizalamayı korumak için bir dizi üretici tüketici döngüsü kullanılarak çevrimdışı depolandı.

1. Kardiyomiyometreyi hazırlayın.
   1. Sıcak (~60 °C) suyu, damıtılmış suyu (oda sıcaklığı) yıkayın ve ardından çözeltiyi ölçüm odasından süperfüzyon yapın. Karbojen ile superfusate çözeltisini sürekli kabarcık.
   2. Brightfield mikroskop aydınlatma kaynağını açın ve yakalamayı etkinleştirmek için F1 tuşuna basın (Şekil 4A). Aşağı akış kancasını brightfield görüntüsünde ortalanana kadar manuel olarak ayarlayın. Motoru etkinleştirmek için Önce Sıfır Aşağı Akış Ekseni'ni, sonra Aşağı Akış Devre Dışı 'nı tıklatın (Şekil 4C). Kancanın sonu varsayılan ilgi alanının kenarıyla hizalanana kadar DS Setpoint [um] kaydırıcısını hareket ettirün.
      1. Aşağı akış eksenini yeniden sıfırla, sonra DS Setpoint [um] kaydırıcısını 1000'e taşıyın. İşlemi yukarı akış kancasıyla tekrarlayın, ancak ABD Setpoint [um] kaydırıcısını hareket ettirmeyin.
   3. Montaja Taşı ' yı tıklatın (Şekil 4C).
   4. Ana anahtarı değiştirerek denetleyici alt sistemlerini hızlı bir şekilde açmadan önce Lamba anahtarını değiştirerek floresan aydınlatma sistemini başlatın.
      NOT: Bazı UV ışık kaynakları büyük miktarlarda ozon üretir. Bu durumda, bir ozon çıkarıcıyı ışık kaynağının çıkış deliğine bağlayın ve floresan aydınlatma kaynağını açmadan önce çalıştığından emin olun.
   5. Ön paneldeki Mod düğmesine ve ardından 2, ardından 1tuşuna basarak çalışma modunu Turbo-Blanking'e geçirin. Denetim kodunun işlemi bilgilendirmesine izin vermek için Çevrimiçi düğmesine basın.
2. Trabecula dağı.
   1. Ölçüm odasından geçen süperfüzyon akışını duraklatın. Montaj haznesini diseksiyon çözeltisi ile doldurun.
   2. 1 mL şırıngam kullanarak trabeculayı diseksiyon odasından montaj odasına taşıyın (Şekil 5G).
   3. Trabecula'yı aktarmak için şırınnayı dikey olarak ve montaj odası çözeltisinin yüzeyiyle temas halinde yerleştirin. Trabecula'nın yerçekimi yoluyla montaj odasına inmesine izin verin (Şekil 5H).
   4. Montaj odasındaki sıvı seviyesini, kancaların orta kısmı ile aynı seviyede olacak şekilde düşürin.
   5. DS Setpoint [um] kaydırıcısını hareket ettirerek trabecula'nın bolluk uzunluğunu yansıtacak şekilde kancalar arasındaki mesafeyi ayarlayın.
   6. Görselleştirmeye yardımcı olmak için bir mikroskop kullanarak, uç doku parçalarından birini forsepsle hafifçe kavrayın ve yukarı akış kancasına monte edin. Diğer uç doku parçasını aşağı akış kancasına monte edin (Şekil 5I).
   7. Güvenli bir şekilde monte edildikten sonra, Odaya Taşı (Şekil4C)tuşuna basarak trabecula'yı ölçüm odasına (Şekil5J)geri taşıyın. Süperfüzyon akışına ve sıvı ekstraksiyona devam edin.
   8. Uyaran frekansı [Hz] 1'e, Uyaran süresini [ms] 10'a ve Uyaran Voltajı'yı 10'a ayarlayın. Uyaran Açık'a basarak uyarılmaya başlayın?
3. Trabecula'yı hazırlayın.
   1. Yaklaşık 1 saat iklimlendirmeden sonra, uyaran voltajını ve uyaran süresini sırasıyla 1 V ve 1 ms adımda kademeli olarak azaltın. Tipik bir değer kümesi 3 V ve 3 ms'dir.
   2. Brightfield aydınlatma sistemini açın. F1 tuşuna basın ve kullanıcı arabiriminde çizgili bir alanı içine alan bir ilgi alanı seçin. Vurgulanan bölgedeki ortalama sarkom uzunluğunu hesaplamak için İşlem SL? Ayırma Noktası [um] kaydırıcısını artırarak ortalama sarkom uzunluğu 2,32 μm olana kadar kas uzunluğunu artırın.
      NOT: SL hesaplanalım mı? Adım 4.3'te özetlenen bir 2D FFT kullanır. Ortalama sarkom uzunluğunu hesaplamak için kullanılan ilgi alanı genellikle 100 μm ila 150 μm karedir. Bu nedenle, kas optimal sarkom uzunluğuna yaklaştıkça, ortalama sarkom uzunluğunu hesaplamak için 43 ila 65 sarkom kullanılır.
   3. "Merkez ve Ayırma Kontrolü sekmesindeki(Şekil 4C) Merkez Setpoint [um] kaydırıcısını, aşağı akış kancasının kenarı brightfield görüntüsünde görünecek şekilde ayarlayarak kası hareket ettirin. On seğirme için floresan bilgilerini toplayın.
   4. Merkez Setpoint [um] değerini 200 artırın ve floresan bilgi değerinde on seğirme daha toplayın. Brightfield görüntüsü yukarı akış kancasını içerene kadar bu işlemi yineleyin. Son pencerenin floresan bilgilerini toplayın.
   5. Merkez Setpoint [um] değerini 0 olarak ayarlayarak trabecula'yı merkezi bir konuma döndürün.
   6. Uyaran frekansını 0,2 Hz'e düşürün ve KH superfusate'den Fura-2 yükleme çözümüne geçin (Tablo 1'deayrıntılı olarak açıklanmıştır).
   7. Uyarım ve Veri sekmesinde Floresan Kaynağını Etkinleştir'e tıklayarak floresan sinyalini her 10 dakikada bir ölçün. PMT Sinyali sekmesinde floresan sinyalini görselleştirin.
   8. 360 nm sinyali 10 kat arttıktan veya yükleme prosedürünün süresi 2 saati aştıktan sonra, uyaran frekansını 1 Hz'e döndürün ve KH süperfüzyon çözeltisine geri dönün.
   9. Oran ölçümü dengelenene kadar her 10 dakikada bir oran ölçümünü kontrol edin, bu noktada veri toplama başlayabilir.
4. Brightfield ve floresan görüntüleme verilerini toplayın.
   1. Kası, aşağı akış kancasının kenarının brightfield görüntüsünde bulunduğu konuma getirin. Donanım denetimi kullanıcı arabiriminin Stim ve Veri sekmesinde Verileri Diske Aktar'ı tıklatarak donanım verilerini akışına başlayın. Floresan Kaynağını Etkinleştir 'itıklatarak floresan bilgilerini yakalayın.
   2. Brightfield görüntüleme kullanıcı arabiriminde, yakalama modunu harici bir tetikleyiciye ayarlayın, kare hızını 100 Hz'e çıkarın ve yakalanacak görüntü sayısını 100'e ayarlayın. Bu pencerenin parlak alan görüntüleme verilerini kaydetmek için Ctrl + Shift + S tuşlarına ve ardından F1 tuşuna basın.
   3. Merkez Setpoint [um] değerini 200 artırın ve Adım 3.4.2'yi yineleyin. Adım 3.3.4'ten son pencere için görüntüleme verileri toplanana kadar tarama protokolüne devam edin.
   4. Merkez Setpoint [um] değerini 0 olarak ayarlayarak trabecula'yı merkezi bir konuma döndürün.
5. OCT görüntüleme verilerini toplayın.
   1. Ana anahtarı | çevirerek OCT lazer kaynağını açın sembolü, güç düğmesine ve ardından SLD'ler düğmesine basın.
   2. Galvanometre kafasını örtün ve arka plan parazit desenini ölçmek ve ölçümden çıkarmak için BG Al'ı tıklatın (Şekil 4B).
   3. Görüntü yakalama modunu canlı görüntü olarak ayarlayın.
   4. B tarama görüntüsü yalnızca yukarı akış kancasını içerene kadar ykonumunu ayarlayın. Kontrol ön panelinde görüntülenen kas uzunluğunu(Şekil 4B)ikiye bölün ve mevcut ypozisyonunu çıkarın. Bu değeri"y-ofset" girişine girin. Trabecula'nın kesitleri çerçevede ortalanana kadar"x-ofset" değerini ayarlayın.
   5. Trabecula ortalandığında, yukarı ve aşağı akış kancalarına karşılık gelen pozisyonları bulmak için ypozisyonunu ayarlayarak y ekseniboyunca tarayın. Bu konumları not edin. Aralık Y'yi (adımlar) bu değerler arasındaki mutlak farka ona bölün.
   6. Görüntü yakalama modunu Tetiklenen Uyarıcı olarak ayarlayın, X Aralığı (adımlar) 100 olarak ayarlayın ve Etkin Parametreleri Ayarla düğmesini tıklatın.
   7. Akış B Tarama Verileri?'nitıklatın, sonra Alın.
      NOT: Kapılı görüntüleme protokolü, ~3 dk 20 sn'lik bir yakalama süresine karşılık gelen 2 mm uzunluğundaki bir örnek için tüm kas geometrisini yakalamak için 200 seğirme gerektirir.

4. Brightfield görüntü veri kümesini işleyin

1. Görüntüleri analize hazırlayın.
   1. Görüntüleri ImageJ'ye alma (Dosya > görüntü sırası > içe aktarma > Resim seçin).
   2. Görüntü kontrastını artırma(Görüntü > > Parlaklığı/Kontrastı Ayarla > Görüntü histogramını merkezileştirmek için minimum ve Maksimum kaydırıcıları hareket ettirın).
   3. Görüntüleri keskinleştirme(İşlem > Filtreleri > Keskinliği Azaltma Maskesi > Radius'u (Sigma) 1,0 piksele ve Maske Ağırlığını (0,1-0,9) 0,6'ya ayarlayın).
   4. Görüntü sırasını dışa aktarma(> Görüntü Sırası Olarak Kaydet > Biçimi PNG olarak ayarlayın,0'dan başlayın ve Basamaklar (1-8) 4'e ayarlayın).
2. Görüntüleri dikin, yerelleştirilmiş yer değiştirmeyi ölçün ve yerel sarkom uzunluklarını hesaplanın.
   1. "TrabeculaProcessing.m" (istek üzerine kullanılabilir) öğesini açın ve FolderPath değişkenini tüm verileri içeren ana klasöre ve ImagePath'i Adım 4.1.4'teki görüntü sırasının kaydedildiği klasöre ayarlayın. Bölümleri görüntüleme penceresi sayısına ve pencere başına yakalanan kare sayısına ayarlayın.
   2. Kodu çalıştır.
      NOT: Çıktılar, kullanıcı tarafından belirtilen çıktı klasörü yolunda bulunur. (Varsayılan olarak, yol FolderPath/Output olarak ayarlanır).
3. FFT sarkom uzunluğu tekniği
   1. Sarkomların yüksek oranda görünür olduğu görüntünün bir bölgesinde FFT gerçekleştirmek için görüntü işleme yazılımını kullanın.
   2. Μm kalibrasyon başına pikselleri, ilgi alanlarının mekansal frekans aralığını elde etmek için tersi hesaplamadan önce Adım 1.1.6'dan 1.6 μm ve 3.0 μm ile çarpın.
   3. Adım 4.3.2'de hesaplanan frekans aralığındaki frekans bilgilerini yoksayarak FFT sonucuna üstel bir uyum sağlar ve DC terimini kaldırmak için dönüştürme sonucundan çıkarın.
   4. Gauss eğrisini ilgi sıklığı bandına takın.
   5. Gauss eğrisinin zirvesinin tersini hesaplayın. Bu, ilgi alanı için ortalama sarkom uzunluğudur.
      NOT: FFT hesaplaması ve üstel ve Gauss denklemlerinin takılması özel LabVIEW kodu kullanılarak gerçekleştirildi.

5. Floresan verilerini işleyin

1. Pencereye bağımlı otomatik mağazacılığı ilgili pencereden çıkarın ve 340 nm ve 380 nm eksilme dalga boylarıyla ilişkili sinyallerin çekirdeğini hesaplayın.

6. OCT görüntüleme verilerini işleyin

1. OCT görüntü kümesini segmentasyon için hazırlayın.
   1. ImageJ'yi açın ve görüntüleri alın (Dosya > > Görüntü Sırası alın). Dosya gezgini penceresinde, bu açılır, görüntüleri bulun, birini seçin ve Aç'ı tıklatın.
      NOT: OCT denetim kodu görüntüleri ImageJ tarafından okunabilen bir biçimde depolamazsa, bunları PNG'ye dönüştürün.
   2. Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için, görüntü dizisini bir hiperstack(Görüntü > Hyperstacks > Yığını hiperstack)olarak düzenleyin. Açılan diyalog kutusunda, dilim sayısını dilim başına B tarama sayısına ve X'i trabecula uzunluğu boyunca dilim sayısına ayarlayın.
   3. Trabecula'yı içine alan bir dikdörtgen çizin. Hipertack penceresindeki kaydırıcıları kullanarak tüm birimi zaman içine aldığını onaylayın. Görüntüyü pencereye kırpın (Görüntü > Kırp).
   4. Montaj kancalarının görüntülerini içeren dilimleri kaldırın (Yığınlar > Araçları > Dilim Koruyucu). Yalnızca trabecula bilgilerini içeren dilim aralığını seçin.
2. WEKA segmentasyonunu eğitin.
   1. Weka segmentasyonunu açın (Eklentiler > Segmentasyonu > Eğitilebilir Weka Segmentasyonu).
   2. Seçim modunu Serbest Olarak ayarlayın.
   3. Ayarlar'ı tıklatın ve sınıflandırıcıyı ve eğitim ayarlarını yapın. (Bu model için aşağıdaki Eğitim özellikleri kullanılmıştır: Gauss bulanıklığı, Sobel filtresi, Hessian, Gaussların Farkı, membran projeksiyonları, bilateral ve Lipschitz. Membran kalınlığı 1, Membran yama boyutu 8, Minimum sigma 1 ve Maksimum sigma 32 olarak ayarlandı. Sınıflandırıcı FastRandomForest olarak ayarlandı ve sınıflandırıcı seçenekleri şu şekilde ayarlandı: batchSize 100, maxDepth to 32, numFeatures to 32, numThreads to 0 ve numTrees to 200.)
   4. Eğitim tatmin edici segmentasyonlarla sonuçlanana kadar görüntüleri el ile segmentlere ayır.
   5. Sınıflandırıcıyı kaydedin.
3. İşlenen B taramalarını segmentlere ayırın
   1. Adım 6.2.1'den sonra WEKA segmentasyonunu başlatın.
   2. Sınıflandırıcıyı Adım 6.2.5'ten yükleyin.
   3. Sonuç Oluştur 'utıklatın.
   4. Görüntüleri 8 bit'e dönüştürün (Resim > Tür > 8 bit).
   5. Görüntüleri ikiliye dönüştürme (İşlem > İkili > İkili > Varsayılan yöntem ve varsayılan arka plan yapın).
   6. Görüntü sırası (PNG) olarak kaydet.
4. Parçalı B tarama görüntülerindeki ortalama CSA'yı hesaplayın.
   1. İkili B tarama görüntüsündeki beyaz piksel sayısını sayın.
   2. Piksel alanını kalibre edilmiş derinlik çözünürlüğü (Adım 1,2'den) ve 10 μm (komşu A taramaları arasındaki mesafe) ile çarpın.
   3. Kancalar arasındaki tüm B taramaları için tekrarlayın ve ölçümlerin ortalamasını elde edin.
5. Parçalı görüntüyü kafese dönüştürün.
   1. "OCTmain.m" (istek üzerine kullanılabilir) açın ve imageDirectory'yi Adım 6.3.6'dan çıktıyı içeren klasöre ayarlayın. outputPath'i gerektiği gibi ayarlayın.
   2. Dilimleri "Aralık Y (adımlar)" (Adım 3.5.5) değerine ve çerçeveleri derinlik çözünürlüğüne (Adım 1.2.10) z_dim "X'i Yinele" (Adım 3.5.6) değerine ayarlayın ve x_dim & 10'a atanan değere y_dim.
   3. Çalıştır 'ıtıklatın.

Results

Burada sunulan trabecula'nın tüm uzunluğu için bölgesel Ca²⁺ ve parlak alan bilgilerini yakalamak için yedi kas pozisyonu gerekiyordu. Şekil 6, seğirme kuvvetinin bu hareketle bozulmadığını ve aktif kuvvet üretiminin pozisyon bağımlılığı olmadığını ortaya koyuyor.

100 Hz hızında optik tutarlılık tomografisi kullanılarak toplanan B taramaları ImageJ eklentisi WEKA¹⁴ (Şekil 7A)kullanılarak segmentlere ayrılmıştır. Her kesit, yanal (10 μm) ve derinlik (1,73 μm (miyokardda)) çözünürlükleri arasındaki fark nedeniyle bozulmuş görünür. Bu bozulma, görüntünün derinlik ekseni yanal çözünürlük derinliği çözünürlük oranıyla ölçeklendirilerek düzeltildi. Şekil 7B,C, trabecula'nın ham C taramasını ölçeklendirdikten sonra geometride yaklaşık silindirik olduğunu göstermektedir. Ölçüm odası duvarının yansıması bazen kas verileriyle çakışabilir (Şekil 7A, B), ancak segmentasyon yazılımı bunu hesaba katmak için eğitilebilir ( Şekil7D, E). Segmentlere ayrıldığında, kasın uzunluğu boyunca kesitsel alan seğirme boyunca hesaplanabilir (Şekil 7F). Bu özel trabecula'nın küçük bir ek dallanma olduğunu unutmayın. Dalın hareketi trabecula boyunca ~ 0.75 mm belirgindir. Son olarak, parçalı görüntüler geometrik modellerin yapımına yardımcı olmak için kafeslere dönüştürülebilir (Şekil 7G).

Farklı trabecula pozisyonlarının her birinde 100 fps hızında yakalanan görüntüleme verileri, trabecula'nın tek bir tam görüntüsünü oluşturmak için birbirine dikilmiştir (Şekil 8A). Bu görüntülerin çözünürlüğü 0.535 μm/pikseldir. Komşu pencerelerin çakışan bölgelerinde doğrusal ağırlıklandırma işlevlerinin kullanılması görselleştirmeye yardımcı olur ve parlak alan görüntülerinde bulunan vinyetin etkisini en aza indirir. Floresan sinyali ölçmek için, trabecula'nın 540 μm'lik 540 μm'lik penceresi, 600 Hz hızında 340 nm, 365 nm ve 380 nm dalga boyu ışığı ile döngüsel olarak aydınlatılmıştır. 340 nm ve 380 nm eksitasyon ışığı ile ilişkili yayılan floresan oranı, trabecula Fura-2 ile yüklendikten sonra hücre içi kalsiyumla ilişkilidir. Bu ölçüm bir oran olduğu için etkili ölçüm oranı 200 Hz'dir. Herpencereden ortalama ( n = 10) hücre içi Ca²⁺ geçicileri görüntülendikleri bölgeyle hizalanır (Şekil 8B). Geçicilerin zirvesi oldukça tutarlı görünse de, diyastolik [Ca²⁺] trabecula boyunca 900 μm ile 1800 μm arasındaki bölgede daha düşüktür. Benzer şekilde, yer değiştirme takibi (Şekil 8C) ve sarkom uzunluğu (Şekil 8D) hesaplamalarının sonuçları da bölgesel değişkenliğin varlığını göstermektedir. Kullanılan işaretsiz izleme tekniği, yeterli kontrast verildiğinde her pikselin ötelemeyi işleyebilir. Sarkom uzunluklarının dağılımını postayla eşlerken, bölgesel sarkom uzunluğunu hesaplamak için 128 piksel ile 128 piksel (~67 μm x 67 μm) çapraz korelasyon alanı kullanılmıştır. Bu alan, numuneyi kapatmak optimal sarkom uzunluğuna yakın olduğunda yaklaşık 29 sarkomu kapsüller. Her çapraz korelasyon penceresinin centroidi arasındaki adım boyutu (hem x hem de yyönlerinde) bu verilerin işlenmesi için 50 piksel (~26 μm) olarak ayarlanmıştır. Sarkom uzunluğu tahminlerinin uygunluğu, Gauss'un FFT sinyaline uygun genişliğine ve genliğine göre test edilmiştir. Bu durumlar kas bölgesinde 0 μm ile 500 μm arasında karşılanmadı, bu nedenle orada sarkom uzunluğu bilgisi hesaplanamadı. İlişkili yer değiştirmeler göz önüne alındığında, bu bölgedeki sarkomların kontralma aşamasında uzaması muhtemeldir. Bu spekülasyona uygun olarak, trabecula'nın sağ tarafındaki ortalama sarkom uzunlukları bu dönemde kısalır. Panellerin her biri tarafından sağlanan bilgileri birleştirerek, en büyük kesit alanına sahip bölgenin en önemli kuvveti üretmediği görülmektedir. Ca²⁺ geçicilerinin bölgesel varyasyonunun yaklaşık olarak pürüzsüz bir gradyana sahip olduğu varsayımıyla, Şekil 8B, en büyük genlik Ca^{2 +} geçicinin trabecula boyunca 1300 μm ile 1600 μm arasında bir yerde meydana geldiğini göstermektedir. Yer değiştirme haritası, en az harekete geçen bölgenin tepe Ca²⁺ geçici ile iyi hizaladığını gösterir. Ancak, bu bölge numunenin en küçük kesitsel alanlarına sahiptir. Bu veriler göz önünde bulundurularak, bu bölgenin en fazla stresi yarattığı çıkarılabilir.

Şekil 1: Kardiyomiyometrenin açıklamalı görüntüsü. Ana optik bileşenlerin her biri özetlenmiştir. İç içe, ölçüm odasının altındaki mikroskop hedefininyakın çekim, arka görünümü içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Eş zamanlı parlak alan ve floresan mikroskopi için optik yol. Floresan mikroskobun aydınlatma kaynağı, çıkışı döngüsel olarak 340 nm, 365 nm ve 380 nm ışık arasında geçiş yapan bir Xenon ark lambasıdır. Ark lambası çıkış yolu, UV ışığını floresan mikroskop hedefine yönlendiren bir aynaya yansıtan 409 nm kesme dalga boyuna sahip dikroik bir ayna içerir. Lens, heyecan ışığını numuneye odaklar ve 510 nm daha uzun dalga boyu olan yayılan ışığı toplar. Bu yayılan ışık ilk dikroik aynadan geçer, ancak 552 nm'lik bir dalga boyu olduğu için ikinci aynadan geçmez. Alan lensi daha sonra yansıyan ışığı PMT sensörüne odaklar. Bu arada, brightfield mikroskobu için aydınlatma kaynağı (660 nm LED) numunenin üzerinde bulunur. İletilen ışık bir kondenser lens ile numuneye odaklanır ve 20 × floresan hedefi elde edilen iletim görüntüsünü yakalar. Parlak alan aydınlatması için kullanılan dalga boyu, her dikroik aynanın kesme dalga boyunu aşar, bu nedenle görüntü bir CMOS kameranın sensörüne odaklanmadan önce her ikisinden de geçer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Ölçüm odası tutucu tasarımı. (A) Optik yolların kaplantığı ölçüm odası tutucusunun izometrik görünümü. Brightfield aydınlatması üstün yüzeyden(zekseni) gerçekleşir; floresan aydınlatma alt yüzeyden(zekseni) meydana gelir ve ölçüm kolu OCT sinyali diğer aydınlatma eksenine(yekseni) ortogonaldir. Deney sırasında, iki platin kanca, ölçüm odası olarak işlev gören bir cam kılcal tüp içinde bir trabecula tutar. Ses bobini motorları her kancayı kontrol eder ve konumları lazer interferometri kullanılarak ölçülür. Geçerli konum, kullanıcı tanımlı bir küme noktasıyla karşılaştırılır ve FPGA içinde kodlanmış bir PID denetleyicisi kullanılarak hata en aza indirilür. (B) Parlak alan aydınlatması açıkken ölçüm odası yerinde. Arka görünüm Şekil 1 giriştegösterilir. (C) Ölçüm odası tutucusunun içinden süperfüzyon akışının şeması. Superfusate bloğun arkasına girer ve oklarla belirtilen yönde akar. Yukarı ve aşağı akış elektrotları, ölçüm odasında monte edilmiş bir trabecula'nın daralmasını ortaya çıkarır için alan stimülasyonunu oluşturur. Mavi gölgelendirme, bir deneme sırasında süperfüzyonun aktığı bölgeleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Görüntü alma ve kontrol yazılımının ön paneli. (A) Brightfield görüntüleme kullanıcı arayüzü. (B) OCT görüntüleme kullanıcı arayüzü. (C) Donanım denetimi kullanıcı arabirimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Trabecula diseksiyon ve montaj protokolü. (A) Diseksiyon odasında Langendorff perfüzyonlu sıçan kalbi. (B ) Atria ile aynı kalp çıkarılır. Kesik çizgiler ventrikülleri açmak için eksizyon yörüngesini gösterir. (C) Her iki ventriküllerin içini ortaya çıkarmak için açılmış bir kalp. Kesikli kutu, trabeculae'nin tipik olarak bulunduğu bölgeyi gösterir. (D) Ekscised sağ-ventrikül duvar bölgesi (C'deki kesikli kutu ile aynıdır). Kesik çizgiler üç trabeculae vurgular. (E) D.'deki üçlüden seçilen bir trabecula(F) Duvar dokusu çıkarılmış E panelinden trabecula. (G) 1 mL şırıncının sonunda izole edilmiş trabecula. (H) Montaj odasındaki trabecula. (I) İki platin kanca arasına monte edilmiş trabecula. (J) Ölçüm odası içinde kancalar arasına monte edilen trabecula (Şekil 3B). Yeşil nokta ilk dikroik filtreden bir eserdir. (K) Ölçüm odası içindeki monte edilmiş trabeculanın ikincil açısı. Trabecula ve mikroskop objektif lens arasındaki mesafe yaklaşık 1 mm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Kuvvet ölçümünün konum bağımlılığı. Görüntüleme pozisyonlarının her birinden kas tarafından üretilen kuvvet(n = 7) üst üste bindi. Ortalama aktif kuvvet üretimi 0.527 mN ± 0.003 mN, P daralma 77.1 ms ± 0.3 ms ve P gevşeme süresi 328.1 ms ± 0.9 ms idi (tüm veriler ortalama ± SE olarak sunulmaktadır). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: OCT görüntüleme analizi. (A) WEKA segmentasyonu örneği. Kasın parçalı kesitleri kırmızı, arka planı ise yeşil renkle vurgulanır. (B) Bir trabecula'nın ham C tarama verilerinin üstün görünümü. Görüntünün üst kısmına doğru parlak açılı çizgi, ölçüm odası duvarının yansımasıdır. (C) Bir trabecula'nın ham C tarama verilerinin yanal görünümü. (D) Segmentli OCT verilerinin üstün görünümü. (E) Segmentlere ayrılmıştır OCT verilerinin yanal görünümü. (F) Trabecula uzunluğu boyunca kesit alanı(xekseni) zaman boyunca (y-eksen). Kas uzunluğu boyunca ortalama kesit alanı 0.0326 mm² ± 0.0005 mm² idi (ortalama ± S.E.) (G) Trabecula'nın bir ağı. Mesh, F panelinin kesitsel alan çizimi ile yaklaşık olarak hizalanmıştır.

Şekil 8: Brightfield ve floresan görüntüleme analizi. (A) Trabecula dikişli görüntü (yedi görüntüleme penceresi). (B) Trabecula uzunluğu boyunca ca²⁺ geçicidir. (C) Her görüntüleme penceresinden ortalama x-yer değiştirme. Pozitif yer değiştirme, sağa doğru bir hareketi ve solda negatifi temsil eder. (D) Gerekli görüntü kontrastı olan her görüntüleme penceresinden ortalama sarkom uzunlukları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Çözüm Masası Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Bu çalışmada, brightfield, floresan ve OCT görüntülemeyi birleştiren üç optik sistemin aktif olarak kasılan bir ex vivo kardiyak trabeculadan veri toplamasını sağlayan bir konfigürasyon sunuyoruz (Şekil 1 ve Şekil 2). Böyle düzenlenmiş bir entegrasyon, OCT'nin parlak alan floresan eksenine ortogonal düzenini sağlamak için ölçüm odasının(Şekil 3)tasarımı nedeniyle mümkündür. Kas montaj sistemi, kardiyak kas çıkarma-kasılma dinamiklerinin karakterizeinde anahtar endekslerin eşzamanlı nicelemelerinin başarısında eşit derecede önemli bir rol oynar. Yeniliği, kasın mekanik performansında belirgin bir rahatsızlık olmadan kas tarama prosedürlerini etkinleştirmekte bulunur (Şekil 6). Kuvvet ölçümü için kombine görüntüleme konfigürasyonu ve motorlu kanca sistemi ile bu sistem, seğirme süresi boyunca bir müteahhit trabeculanın makroskopik geometrik bilgileri ile birlikte Ca²⁺ geçici, yer değiştirme ve sarkom uzunluğundaki bölgesel heterojenliği değerlendirebilir (Şekil 7 ve Şekil 8).

Kardiyak araştırma laboratuvarlarında brightfield-epifluorescence görüntüleme sistemlerinin her yerde bulunduğu göz önüne alındığında, bu sonuçların çoğaltılması bazı küçük donanım hususları ile elde edilebilir. Burada, alttaki contractile heterojenliğini analiz etmek için gerekli olan brightfield-epifluorescence ve OCT'yi birleştirmek için görüntü işleme araç setini sunuyoruz. OCT entegrasyonu engelsiz bir optik yol gerektirirken, kapılı görüntüleme, uyaran ile hem OCT hem de brightfield görüntüleme kamerası arasında harici bir tetik hattı ve numuneyi ölçüm odası boyunca hareket ettirebilen kas montaj kancaları gerektirir. Gerekli işlem sonrası yazılım ve yöntemler serbestçe kullanılabilir. Özellikle, kullanılan segmentasyon yazılımı, WEKA¹⁴, açık kaynaklıdır. Malzeme noktalarının işaretsiz takibi tekniği⁸, sarkom uzunluğu, kapılı hacimsel görüntüleme¹⁰ve örgü oluşturma kodları da aynı şekilde erişilebilir ve ilgili yazardan talep üzerine kullanılabilir hale getirilebilir.

Kas canlılığı, Fura-2'nin optimal yüklenmesi ve görüntü odağı, başarılı bir deneyin temellerini oluşturan üç sütundur. Kontrgürü önlemek için BDM içeren bir diseksiyon çözeltisi kullanmak, bir şırıngırda kasın taşınması, çözeltinin sürekli oksijenlenmesi ve bir deney gününde yeni deneysel çözümler hazırlamak, hepsi yüksek kas canlılık oranına katkıda bulunur. Trabecula'yı Fura-2AM ile yüklemeden önce, ölçülen Ca^{2 +} geçici¹⁵üzerinde önemli bir etkiye sahip olabileceğinden, çalışmakla ilgilenen her durum için otofluoresans toplanmalıdır. Fura-2AM yükleme çözeltisinin oksijenlenmesi, boya yüklemesine yardımcı olmak için yüzey aktif madde pluronic-F127'nin gerekli dahil edilmesiyle karmaşıktır. Bu yüzey aktif maddeden kaynaklanan aşırı kabarcık oluşumuyla mücadele etmek için, yükleme çözeltisinde küçük bir köpük önleyici damla, kullanıcının oksijenlenme oranını artırmasını sağlar, böylece trabecula'nın yükleme işlemi boyunca işlevsel canlılığı koruma şansını artırır. Son olarak, parlak alan ve floresan bilgilerinin sinyalden gürültü oranına oranını en üst düzeye çıkarmak için görüntüleme odağının kas uzunluğu boyunca düzgün olması gerekir.

Burada sunulan yöntemlerle göz önünde bulundurulacak iki sınırlama vardır. Birincisi floresan mikroskobun mekansal çözünürlüğüdür. OCT ve brightfield görüntülemenin mekansal çözünürlükleri yüksek olsa da, floresan mikroskobun çözünürlüğü, 540 μm ile 540 μm görüntüleme penceresinde yakalanan hacimden floresan integrali ile sınırlıdır. Sinyalin gürültü oranı pahasına floresan sinyalini yakalamak için PMT yerine yüksek kazançlı şarj bağlantılı bir cihaz kamerası kullanarak floresan mikroskopunun uzamsal çözünürlüğünü artırma kapsamı vardır¹⁶. İkincisi, ölçülebilir sarkom uzunluğu ve geometrik derinlik açısından çalışılabilen trabecula çapıdır. Sarkom uzunluğunu hesaplamak için pencereli FFT yaklaşımı, geliştirilmiş uzamsal çözünürlüğün yararından yararlanır, ancak daha az sağlamlıkla ilişkilidir (Şekil 8D). Bulanık veya büyük çaplı trabeculae'nin çalışılacağı durumlarda, daha büyük doku örneklerinde sarkolerik bantlama ile ilişkili kontrastın azalması nedeniyle FFT'nin çözünülmesi büyük ölçüde azalacaktır. Aynı şekilde, OCT içinde, 300 μm'den büyük bir görüntüleme derinliğinden gelen geri yansımalar segmentasyon aşamasında çözülemeyecek kadar zayıf olacaktır. Bu nedenle, tekniğimiz 300 μm'den daha az bir çapa sahip trabeculae ile sınırlıdır. Bununla birlikte, yüksek stimülasyon oranları sırasında kas çekirdeğinin difüzif oksijenasyonu ile ilgili sorunlar olabileceğinden büyük çaplı örneklerin incelenmesi önerilmez¹⁷.

Yöntemimiz, sağlıklı ve hastalıklı kaslarda kas geometrisi ile ilişkili olarak iyonik mekanik fonksiyonun değerlendirilmesini sağlayarak kalp kası fizyolojisini, patofizyolojisini ve farmakolojiyi anlamak için güçlü bir yaklaşım sağlar. Burada özetlenen görüntü işleme ardışık düzeni, kontrtil heterojenliğin daha derin bir şekilde anlaşılması için çok önemli olacak verileri ayıklar. Bu kadar zengin bir veri kümesinin potansiyelini tam olarak gerçekleştirmenin bir yolu, bu verileri entegre eden ve yorumlayan matematiksel modellerin inşasında ve cihazımızı kullanarak deneysel olarak test edilebilen tahminlerde bulunmaktır.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-Bütandion monoksim	Acros Organics	150375000
20 kez; mikroskop lensi	Nikon	CFI Super Fluor 20 kez;	NA 0.75
2D Galvanometre	Thorlabs	GVSM002/M
50-50 ışın ayırıcı	Thorlabs	FC850-40-50-APC
90-10 ışın ayırıcı	Thorlabs	TW850R2A2
Analog giriş modülü	National Instruments	NI-9205	PMT sinyalini 200 kHz'de kaydeder
Parlak alan görüntüleme ışık kaynağı	CoolLED	PE-2	660  nm LAM
Geniş bant ışık kaynağı	Superlum	Broadlighter-840
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Cameralink kartı	Ulusal Cihazlar	NI-1429	Brightfield görüntüleme çerçevesi yakalayıcı
Karbogen 5	BOC	Gaz kodu: 181
Kondenser lensi	Nikon	LWD 0.52
D (+) - Glikoz	Merck	108337
DAQ	Ulusal Enstrümanlar	NI-6259	Galvanometre hareketini tetikler
Dikroik ayna 1	Semrock	FF409-Di03
Dikroik ayna 2	Semrock	FF552-Di02
Kırınım ızgarası	Wasatch Fotonik	1200 satır/mm @ 840 nm
Dimetil sülfoksit	Sigma-Aldrich	276855
Direct-Q 3 UV Sistemi	Merck Millipore	ZRQSVR3WW	Damıtılmış su makinesi
Kuru banyo	Corning	6875-SB	LSE dijital kuru banyo
FIJI	ImageJ		Açık kaynaklı görüntü işleme yazılımı
Fura-2AM pentapotasyum tuzu	Thermofisher	F14186
Donanım FPGA kartı	Ulusal Aletler	NI-7813R	Ayrıca parlak alan yakalamanın tetiklenmesini kontrol eder
Heparin	Pfizer	61024
HEPES	PanReac AppliChem	A1069
Ters mikroskop	Nikon	TI-DH aydınlatma direği
İzofloran	MedSource	VAPDRUGISO250
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Çizgi taramalı kamera	Basler	spL2048-70km	Spektrometre kamera
Manyetik karıştırıcı	IKA	3810000	RCT temel
Matlab	Mathworks		Veri işleme kodu
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
MgSO4< / sub>.7H2< / sub>O	Sigma-Aldrich	M1880
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
NaH2< / sub>PO4< / sub>.2H2< / sub>O	Sigma-Aldrich	71505
NaHCO3< / sub>	Sigma-Aldrich	S6014
OCT FPGA kartı	Ulusal Aletler	NI-1483R
Oksijen tankı	BOC	Gaz kodu: 100D
pH metre	Mettler Toledo	MP220
Fotoçoğaltıcı tüp	Hamamatsu	H7422-20
Powerload	Thermofisher	P10020
Süper ışıldayan	diyot Broadlighter	D-840
Transempedans amplifikatörü	Özel
Tris(hidroksimetil)amino-metan	Sigma-Aldrich	252859
Wistar sıçan	Vernon Jansen Ünite		8 – 10 hafta
Ksenon ark lambası	Sutter Aleti	DG-4	Lambda DG-4