Method Article

Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür Sistemi (MMC) kullanılarak Otomatik Mikrobiyal Yetiştirme ve Uyarlanabilir Evrim

DOI:

10.3791/62800

⸱

February 18th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biochemical Engineering Research Group, School of Chemical Engineering and Technology, Xi’an Jiaotong University, 5Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, 6School of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, otomatik mikrobiyal yetiştirme ve uyarlanabilir evrim yürütmek için Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültürü sisteminin (MMC) nasıl kullanılacağını açıklamaktadır. MMC, mikroorganizmaları otomatik ve sürekli olarak yetiştirebilir ve alt yetiştirebilir ve nispeten yüksek verim ve iyi paralelleştirme ile büyümelerini çevrimiçi olarak izleyebilir, işçiliği ve reaktif tüketimini azaltabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel mikrobiyal yetiştirme yöntemleri genellikle hantal operasyonlara, düşük verime, düşük verimliliğe ve büyük miktarda işgücü ve reaktif tüketimine sahiptir. Ayrıca, son yıllarda geliştirilen mikroplaka bazlı yüksek verimli yetiştirme yöntemleri, düşük çözünmüş oksijen, zayıf karışım ve şiddetli buharlaşma ve termal etkileri nedeniyle zayıf mikrobiyal büyüme durumuna ve deney paralelliğine sahiptir. Mikro damlacıkların küçük hacim, yüksek verim ve güçlü kontrol edilebilirlik gibi birçok avantajı nedeniyle, damlacık bazlı mikroakışkan teknolojisi, yüksek verimli mikrobiyal ekim, tarama ve evrim araştırmalarında kullanılan bu sorunların üstesinden gelebilir. Bununla birlikte, önceki çalışmaların çoğu laboratuvar yapımı ve uygulaması aşamasında kalmaktadır. Yüksek operasyonel gereksinimler, yüksek inşaat zorluğu ve otomatik entegrasyon teknolojisinin eksikliği gibi bazı önemli konular, mikrobiyal araştırmalarda damlacık mikroakışkan teknolojisinin geniş çapta uygulanmasını kısıtlamaktadır. Burada, damlacık mikroakışkan teknolojisine dayanan otomatik bir Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür sistemi (MMC) başarıyla geliştirildi ve mikrobiyal damlacık yetiştiriciliği sürecinin gerektirdiği aşılama, ekim, çevrimiçi izleme, alt ekim, sıralama ve örnekleme gibi fonksiyonların entegrasyonu sağlandı. Bu protokolde, vahşi tip Escherichia coli (E. coli) MG1655 ve metanol esansiyel bir E. coli suşu (MeSV2.2), MMC'nin otomatik ve nispeten yüksek verimli mikrobiyal ekim ve uyarlanabilir evrimi ayrıntılı olarak yürütmek için nasıl kullanılacağını tanıtmak için örnek olarak alınmıştır. Bu yöntemin kullanımı kolaydır, daha az emek ve reaktif tüketir ve geleneksel yetiştirme yöntemlerine kıyasla büyük avantajlara sahip olan yüksek deneysel verime ve iyi veri paralelliğine sahiptir. Bilimsel araştırmacıların ilgili mikrobiyal araştırmaları yürütmeleri için düşük maliyetli, operasyon dostu ve sonuç açısından güvenilir bir deneysel platform sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiyal tarım, mikroorganizmaların izolasyonu, tanımlanması, yeniden yapılandırılması, taranması ve evriminde yaygın olarak kullanılan mikrobiyolojik bilimsel araştırmalar ve endüstriyel uygulamalar için önemli bir temeldir 1,2,3. Geleneksel mikrobiyal yetiştirme yöntemleri esas olarak test tüplerini, sallama şişelerini ve katı plakaları yetiştirme kapları olarak kullanır, ayrıca sallama inkübatörleri, spektrofotometreler, mikro plaka okuyucuları ve mikrobiyal yetiştirme, tespit ve tarama için diğer ekipmanlarla birleştirilir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin hantal işlemler, düşük verim, düşük verimlilik ve büyük işgücü ve reaktif tüketimi gibi birçok sorunu vardır. Son yıllarda geliştirilen yüksek verimli yetiştirme yöntemleri esas olarak mikroplakaya dayanmaktadır. Ancak mikroplaka düşük çözünmüş oksijen seviyesine, zayıf karıştırma özelliğine ve şiddetli buharlaşma ve termal etkiye sahiptir, bu da genellikle zayıf büyüme durumuna ve mikroorganizmaların deney paralelliğine yol açar 4,5,6,7; Öte yandan, otomatik yetiştirme ve proses tespiti elde etmek için sıvı taşıma iş istasyonları ve mikro plaka okuyucular gibi pahalı ekipmanlarla donatılması gerekir 8,9.

Mikroakışkan teknolojisinin önemli bir dalı olan damlacık mikroakışkanları, son yıllarda geleneksel sürekli akışlı mikroakışkan sistemlere dayanarak geliştirilmiştir. Dağınık mikro damlacıklar üretmek ve bunlar üzerinde çalışmak için iki karışmaz sıvı fazı (genellikle yağ-su) kullanan ayrık akışlı bir mikroakışkan teknolojisidir10. Mikro damlacıklar küçük hacimli, geniş spesifik yüzey alanı, yüksek iç kütle transfer hızı özelliklerine sahip olduğundan ve bölümlere ayırmanın neden olduğu çapraz kontaminasyon olmadığından ve damlacıkların güçlü kontrol edilebilirliği ve yüksek veriminin avantajlarına sahip olduğundan, yüksek verimli ekim, eleme ve mikroorganizmaların evriminde damlacık mikroakışkan teknolojisini uygulayan birçok araştırma türü olmuştur11 . Bununla birlikte, damlacık mikroakışkan teknolojisinin popülerleşmesini ve yaygın olarak uygulanmasını sağlamak için hala bir dizi önemli konu vardır. İlk olarak, damlacık mikroakışkanlarının çalışması hantal ve karmaşıktır, bu da operatörler için yüksek teknik gereksinimlere neden olur. İkincisi, damlacık mikroakışkan teknolojisi optik, mekanik ve elektrikli bileşenleri birleştirir ve biyoteknoloji uygulama senaryolarıyla ilişkilendirilmesi gerekir. Çok disiplinli bir işbirliği yoksa, tek bir laboratuvar veya ekibin verimli damlacık mikroakışkan kontrol sistemleri kurması zordur. Üçüncüsü, küçük hacimli mikro damlacık nedeniyle (pikoliter (pL) mikrolitreye (μL)), alt ekim, sıralama ve örnekleme gibi bazı temel mikrobiyal işlemler için damlacıkların hassas otomatik kontrolünü ve gerçek zamanlı çevrimiçi tespitini gerçekleştirmek çok zordur ve entegre bir ekipman sistemi oluşturmak da zordur12.

Yukarıdaki sorunları çözmek için, damlacık mikroakışkan teknolojisine dayanan otomatik bir Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür sistemi (MMC) başarıyla geliştirilmiştir13. MMC dört işlevsel modülden oluşur: damlacık tanıma modülü, damlacık spektrumu algılama modülü, mikroakışkan çip modülü ve örnekleme modülü. Tüm modüllerin sistem entegrasyonu ve kontrolü sayesinde, damlacıkların üretimi, yetiştirilmesi, ölçülmesi (optik yoğunluk (OD) ve floresan), bölünmesi, füzyonu, ayrıştırılması dahil olmak üzere otomatik işletim sistemi doğru bir şekilde kurulmakta, mikrobiyal damlacık yetiştiriciliği işleminin gerektirdiği aşılama, ekim, izleme, alt ekim, ayıklama ve numune alma gibi fonksiyonların entegrasyonu sağlanmaktadır. MMC, 200 sallama şişesi yetiştirme ünitesine eşdeğer olan 2-3 μL hacimli 200 kopya damlacık yetiştirme ünitesini tutabilir. Mikro-damlacık yetiştirme sistemi, mikroorganizmaların büyümesi sırasında kontaminasyonsuz, çözünmüş oksijen, karıştırma ve kütle-enerji değişimi gereksinimlerini karşılayabilir ve örneğin büyüme eğrisi ölçümü, uyarlanabilir evrim, tek faktörlü çok seviyeli analiz ve metabolit araştırması ve analizi (floresan tespitine dayalı) gibi çoklu entegre fonksiyonlar aracılığıyla mikrobiyal araştırmanın çeşitli ihtiyaçlarını karşılayabilir13,14.

Burada protokol, MMC'nin otomatik ve mikrobiyal yetiştirme ve uyarlanabilir evrimi ayrıntılı olarak yürütmek için nasıl kullanılacağını tanıtmaktadır (Şekil 1). Büyüme eğrisi ölçümünü göstermek için vahşi tip Escherichia coli (E. coli) MG1655'i ve MMC'deki adaptif evrimi göstermek için metanol esansiyel E. coli suşu MeSV2.215'i örnek olarak aldık. MMC için bir operasyon yazılımı geliştirildi, bu da işlemi çok basit ve net hale getiriyor. Tüm süreçte, kullanıcının ilk bakteri çözeltisini hazırlaması, MMC'nin koşullarını ayarlaması ve ardından bakteri çözeltisini ve ilgili reaktifleri MMC'ye enjekte etmesi gerekir. Daha sonra, MMC damlacık oluşturma, tanıma ve numaralandırma, yetiştirme ve uyarlanabilir evrim gibi işlemleri otomatik olarak gerçekleştirecektir. Ayrıca, damlacıkların yüksek zaman çözünürlüğüne sahip çevrimiçi tespitini (OD ve floresan) gerçekleştirecek ve ilgili verileri (dışa aktarılabilen) yazılımda görüntüleyecektir. Operatör, sonuçlara göre yetiştirme işlemini istediği zaman durdurabilir ve sonraki deneyler için hedef damlacıkları çıkarabilir. MMC'nin kullanımı kolaydır, daha az emek ve reaktif tüketir ve nispeten yüksek deneysel verime ve geleneksel yetiştirme yöntemlerine kıyasla önemli avantajlara sahip olan iyi veri paralelliğine sahiptir. Araştırmacıların ilgili mikrobiyal araştırmaları yürütmeleri için düşük maliyetli, operasyon dostu ve sağlam bir deneysel platform sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cihaz ve yazılım kurulumu

  1. MMC için ayrılmış kalıcı alan olarak temiz ve steril bir ortam (temiz bir tezgah gibi) seçin. MMC'yi alana sabit bir şekilde yükleyin.
    NOT: MMC'yi güçlü elektrik alanlarının, manyetik alanların ve güçlü ısı radyasyon kaynaklarının parazitinden uzak tutun. Optik algılama bileşenlerini etkilemekten kaynaklanan şiddetli titreşimlerden kaçının. MMC'ye AC220 V, 50 HZ güç kaynağı sağlayın. MMC hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na ve MMC16 web sitesine bakın.
  2. MMC.zip dosyasından işlem yazılımını yükleyin
    Not: MMC.zip dosyası için yazarlara başvurun.
    1. Özel bir klasör oluşturun ve zip dosyasını içine kaydedin.
    2. "Kurulum Dizini" olarak başka bir özel klasör oluşturun. MMC.zip sıkıştırmasını açın ve dosyaları yeni klasöre kaydedin.
      NOT: Bilgisayar yapılandırması karşılamak için en iyisidir: (1) Windows 7 64 bit işletim sistemi veya üstü; (2) CPU: i5 veya üstü; (3) bellek: 4 GB veya üstü; (4) sabit disk: 300 GB veya üstü (7200 rpm'den veya katı hal diskinden daha büyük dönme hızı).

2. Hazırlıklar

  1. Şırınga iğnesini (iç çap 0,41 mm ve dış çap 0,71 mm), hızlı konektör A'yı ve reaktif şişesini (Şekil 2C) bağlayın ve 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav yapın.
    NOT: Sterilizasyon sırasında reaktif şişesinin kapağını hafifçe sökün. Kullanım için her seferinde birkaç reaktif şişesi daha hazırlanabilir.
  2. MMC yağını filtrelemek için 0,22 μm poliviniliden florür (PVDF) filtresi kullanın. Mikroakışkan çipi (Şekil 2B) ve MMC yağını önceden temiz tezgaha koyun ve kullanmadan önce 30 dakika boyunca ultraviyole ışınlama ile sterilize edin.
    NOT: Hızlı konektör A, reaktif şişesi, MMC yağı ve mikroakışkan çipin ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın.
  3. Mikroakışkan çipi takın
    1. Operasyon odasının kapısını açın (Şekil 2A) ve optik fiber probu kaldırın.
    2. Elektrik alan deliklerini elektrik alan iğneleriyle hizalayın ve çipi yavaşça talaş kaidesine yerleştirin. Ardından iki konumlandırma sütununu konumlandırma deliklerine yerleştirin ve optik fiber probu yerleştirin (Şekil 2D).
    3. Çip üzerindeki hızlı konektör A'yı, konum numarasına göre MMC'nin ilgili bağlantı noktasına bağlayın (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Ardından operasyon odasının kapısını kapatın.
  4. MMC yağını (yaklaşık 80 mL'ye kadar) yağ şişesinde doldurun ve kullanmadan önce atık sıvıyı atık şişesinde boşaltın.
    NOT: Atık sıvı genellikle organik atıktır. Lütfen deneysel düzeneğe bağlı olarak değişikliğe tabi olan bertaraf üzerine bölgesel yasa ve yönetmeliklere bakın.

3. MMC'de büyüme eğrisi ölçümü

  1. İlk bakteriyel çözelti için hazırlık
    1. Luria-Bertani (LB) ortamını ve otoklavı 121°C'de 15 dakika boyunca hazırlamak için ilgili standart yönetmeliklere uyun.
      NOT: LB ortamının bileşenleri: NaCl (10 g / L), maya ekstraktı (5 g / L) ve tripton (10 g / L).
    2. E. coli MG1655 suşunu gliserol stoğundan çıkarın ve 5-8 saat boyunca 37 ° C'de sallanan bir inkübatörde (200 rpm) 10 mL LB ortamı ile 50 mL'lik bir sallama şişesinde yetiştirin.
      NOT: Yetiştirme süresi belirli suşlara bağlıdır. Suşu logaritmik döneme/faza yetiştirmek en uygunudur.
    3. İlk bakteri çözeltisini elde etmek için kültürlenmiş E. coli MG1655 çözeltisini taze ortamla0.05-0.1'lik bir OD 600'e seyreltin (yaklaşık 10 mL hazırlayın).
  2. MMC'yi başlatmak için Başlatma'ya tıklayın. Başlatma arayüzü göründükten sonra, yetiştirme sıcaklığını 37 °C ve fotoelektrik sinyal değerini 0,6 olarak ayarlayın (Şekil 3A). Başlatma yaklaşık 20 dakika sürecektir.
  3. Başlatma sırasında UV lambasını (dalga boyu 254 nm) açın.
  4. İlk bakteri çözeltisini ve MMC yağını reaktif şişesine enjekte edin.
    1. Temiz tezgahta sterilize edilmiş bir reaktif şişesi çıkarın ve kapağı sıkın.
    2. Yan tüpün şırınga iğnesinden 3-5 mL MMC yağı enjekte etmek için 10 mL steril bir şırınga kullanın. Yağın iç duvara tamamen sızmasını sağlamak için reaktif şişesini yavaşça eğin ve döndürün.
    3. Yaklaşık 5 mL başlangıç bakteri çözeltisi enjekte edin ve daha sonra 5-7 mL yağı tekrar enjekte ederek reaktif şişesini doldurun.
    4. Numune enjeksiyon işlemini tamamlamak için bağımsız hızlı konektör A'yı dışarı çekin ve reaktif şişesinin hızlı A konektörünü hızlı B konektörüne takın (Şekil 4A).
  5. Başlatmanın bitmesini bekleyin ve ardından UV lambasını kapatın (dalga boyu 254 nm).
  6. Operasyon odasının kapısını açın ve reaktif şişesini metal banyoya koyun.
  7. Çipin C2 konektörünü ve reaktif şişesinin hızlı A konektörünü dışarı çekin. Reaktif şişesinin yan boru konektörünü C2 konektörüne ve üst boru konektörünü O2 konektörüne bağlayın. Ardından operasyon odasının kapısını kapatın.
  8. Büyüme eğrisi ölçümünün işlevini seçmek için Büyüme Eğrisi'ne tıklayın (Şekil 3A). Parametre ayarı arayüzünde, Sayıyı 15 olarak girin, OD algılama anahtarını açın ve Dalga Boyunu 600 nm olarak ayarlayın. Damlacık oluşturmaya başlamak için Başlat'a tıklayın. Yaklaşık 10 dakika sürecek.
    NOT: Burada, Sayı , oluşturulacak damlacıkların sayısını ifade eder. Dalga boyu , tespit edilecek OD'nin dalga boyunu ifade eder. Deney gereksinimlerine göre Sayı (maksimum 200) ve Dalga Boyu'nu (350-800 nm) ayarlayın.
  9. Ana arayüzde "C2 ve O2 arasındaki reaktif şişesini çıkarın, ardından lütfen tamamlandıktan sonra Tamam düğmesine tıklayın" diyen bir açılır pencere göründüğünde, reaktif şişesini çıkarmak ve C2 ve O2 konektörlerini bağlamak için işlem odasının kapısını açın.
  10. Kapıyı kapatın ve damlacıkları otomatik olarak yetiştirmek ve OD değerlerini algılamak için açılır penceredeki Tamam düğmesine tıklayın.
    NOT: MMC, damlacık optik fiber probu geçtiğinde OD değerini algılar. Bu nedenle, algılama süresi üretilen damlacıkların sayısına bağlıdır.
  11. Büyüme eğrisi durağan aşamaya ulaştığında, OD verilerini dışa aktarmak için Veri Dışa Aktarma düğmesini tıklatın. Veri kaydetme yolunu seçin ve yetiştirme döneminde kaydedilen OD değerini, uygun yazılım (örneğin, Microsoft Excel) tarafından açılabilen .csv biçiminde dışa aktarın. Ardından, büyüme eğrisini çizmek için bir haritalama yazılımı (örneğin, EXCEL ve Origin 9.0) kullanın.
    NOT: Yetiştirme işlemi sırasında, mevcut tüm damlacıkların OD verilerini dışa aktarmak için herhangi bir zamanda Veri Dışa Aktarma'ya tıklamak mümkündür.

4. MMC'de uyarlanabilir evrim

  1. İlk bakteriyel çözelti için hazırlık
    1. MeSV2.2 için özel sıvı ortam ve katı plakaları ve 121 °C'de otoklav için 15 dakika boyunca hazırlamak üzere ilgili standart yönetmeliklere uyun.
      NOT: Özel ortamın bileşenleri için Tablo 1 ve Malzeme Tablosuna bakınız.
    2. MeSV2.2'yi katı plakayı (çap = 90 mm) kullanarak 37 °C sabit sıcaklık inkübatöründe 72 saat boyunca yetiştirin. Daha sonra bağımsız bir koloni seçin ve 72 saat boyunca 37 ° C'de sallanan bir inkübatörde (200 rpm) 10 mL özel sıvı ortam ile 50 mL'lik bir sallama şişesinde yetiştirin.
    3. Kültürlenmiş MeSV2.2 çözeltisini ortamla0.1-0.2'lik bir OD 600'e kadar seyreltin (toplam hacmin 10 mL'den az olmadığından emin olun) ve ilk bakteri çözeltisini elde etmek için sallama şişesinde 5 saat boyunca yetiştirmeye devam edin.
      NOT: MeSV2.2, metanol esansiyel bir E. coli suşudur. Özel sıvı ortam, MeSV2.2 için güçlü bir stres olan ve çok yavaş büyümeye neden olan 500 mmol / L metanol içerir. İlk bakteri çözeltisinin burada elde edilmesinin, adım 3.1'de açıklanandan farklı olduğunu unutmayın.
  2. MMC'yi adım 3.2, 3.3 ve 3.5'te açıklandığı gibi başlatın.
  3. Biri ilk bakteri çözeltisi ve diğeri taze ortam için olmak üzere iki sterilize reaktif şişesi çıkarın. İlk bakteri çözeltisini (5 mL), taze ortamı (12-15 mL) ve MMC yağını adım 3.4'te açıklandığı gibi reaktif şişelerine enjekte edin.
    NOT: Uyarlanabilir evrim, birden fazla alt yetiştirmeyi içeren uzun vadeli bir süreç olduğundan, MMC'de mümkün olduğunca fazla taze ortam depolayın. Ortam, deneme çalışırken yenilenemez.
  4. İki reaktif şişesini adım 3.6'da açıklandığı gibi MMC'ye takın. Birini C2 ve O2 konektörü arasındaki ilk bakteri çözeltisi için, diğerini ise C4 ve O4 konektörü arasındaki taze ortam için takın.
  5. Uyarlanabilir evrimin işlevini seçmek için ALES'e tıklayın (Şekil 3B). Parametre ayarı arabiriminde, OD Algılama anahtarını açın.
  6. Sayıyı 50, Dalga Boyunu 600 nm, Konsantrasyonu %0, Zaman Türü, Parametreyi 30 saat ve Tekrarları 99 olarak ayarlayın. Damlacık oluşturmaya başlamak için Başlat'a tıklayın. Yaklaşık 25 dakika sürecektir.
    NOT: Burada "Konsantrasyon", adaptif evrim için kimyasal faktörlerin maksimum konsantrasyonunu ifade eder. Farklı damlacıklar için, MMC'de farklı büyüme koşulları sağlamak için farklı konsantrasyonlarda kimyasal faktörler tanıtmak mümkündür. Aşağıdaki denklemi kullanarak tanıtılan konsantrasyonları hesaplayın:
    figure-protocol-1
    Burada "C", damlacıklara sokulan kimyasal faktörlerin konsantrasyonunu ifade eder; "a", C4 ve O4 konektörü arasındaki reaktif şişelerindeki kimyasal faktörlerin konsantrasyonunu ifade eder; "b", C6 ve O6 konektörü arasındaki reaktif şişelerindeki kimyasal faktörlerin konsantrasyonunu ifade eder; ve "i" mevcut konsantrasyonu ifade eder. MMC'de sekiz konsantrasyon vardır. Buradaki kimyasal faktör tek bir konsantrasyona (500 mmol / L metanol) sahip olduğundan ve ortamın bileşenlerinden biri olduğundan, kimyasal faktörü içeren sadece bir reaktif şişesi buraya monte edilir ve Konsantrasyon % 0 olarak ayarlanır. Tip , üç türe ayrılan alt yetiştirme modunu ifade eder: zaman modu, OD değer modu ve floresan modu. Birincisi, damlacıkları sabit bir süre boyunca yetiştirmek ve daha sonra alt yetiştirmek anlamına gelirken, son ikisi damlacıkları önceden tanımlanmış OD değerine / floresan yoğunluğuna yetiştirmek ve daha sonra alt yetiştirmek anlamına gelir. Parametre , bir alt yetiştirme modu seçerken gerekli olan ilgili parametreyi ifade eder. Tekrarlar , alt -uygulamaların sayısını ifade eder.
  7. C2 ve O2 konektörü arasına yerleştirilen reaktif şişesini adım 3.8'de açıklandığı gibi çıkarın.
  8. Her bir alt yetiştirme döneminde damlacıkların maksimum OD değerlerinin önemli ölçüde artıp artmadığını gözlemleyin. Artış gerçekleşirse ve deneme gereksinimlerini karşılıyorsa, adım 3.9'da açıklandığı gibi OD verilerini dışa aktarmak için Veri Dışa Aktarma düğmesine tıklayın.
    NOT: Burada, alt yetiştirme süresi Parametreye bağlıdır. Örneğin, Zaman ve Parametre olarak Tür 30 saat olarak ayarlanırken, alt yetiştirme süresi 30 saattir. Her alt yetiştirme döneminde, damlacıkların maksimum OD değerleri vardır. Maksimum OD değerlerinin artmasıyla uyarlanabilir evrimin deney gereksinimlerini karşılayıp karşılamadığını tahmin edin (Artış, suşun gerçek yetiştirme sürecine bağlıdır, örneğin,% 20'den fazla artmıştır).
    DİKKAT: Depolanan taze ortamın tükenmiş olup olmadığına dikkat edin. Ortam tükendikten sonra bile önemli bir artış meydana gelmediyse, daha iyi büyüyen damlacıkları çıkarın ve yeni bir adaptif evrim turu gerçekleştirin.
  9. Hedef damlacıkları MMC'den ayıklayın.
    1. Damlacık ekstraksiyonunun işlevini seçmek için Tarama düğmesine tıklayın (Şekil 3C). Topla seçeneğini seçin, hedef damlacıkların sayısına tıklayın ve ardından Tamam'a tıklayın.
      NOT: Damlacık taraması "Topla", "At" ve "Ekstrakt tohum çözeltisi" ni içerir. "Tohum çözeltisini ekstrakte et", alt yetiştirme işleminden sonra kalan damlacıkları13 toplamak anlamına gelir.
    2. Açılır pencerenin "Lütfen CF hızlı konektörünü çıkarın ve EP tüpüne yerleştirin" uyarısını yapmasını bekleyin. CF hızlı konektörünü, yazılım istemine göre toplanmak üzere mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve ardından Tamam'a tıklayın (Şekil 4D).
    3. 1-2 dakika sonra, yazılım arayüzü "Lütfen konektörü geri takın ve bittiyse Tamam'ı tıklayın" diyen yeni bir pencere açılacaktır. Ardından, CF hızlı bağlayıcısını geri takın ve MMC'nin çalışmaya devam etmesini sağlamak için Tamam'a tıklayın (Şekil 4D). Bir sonraki hedef damlacık damlacık tanıma sitesine ulaştığında, toplamak için 4.9.2-4.9.3'ü tekrarlayın.
      NOT: Tüm hedef damlacıklar toplandıktan sonra, MMC kalan damlacıkları yetiştirmeye devam edecektir. Yetiştirme gerekli değilse, işlemi doğrudan sonlandırmak için Durdur'a tıklayın.
    4. Damlacığı 2,5 μL'lik bir pipet kullanarak çıkarın, 90 mm agaroz plakasına bırakın ve yan uzunluğu 3 cm olan üçgen bir cam serpme çubuğu ile eşit şekilde yayın. Daha sonra 72 saat boyunca 37 ° C sabit sıcaklık inkübatöründe yetiştirin.
    5. 3-5 bağımsız koloni seçin ve bunları 48-72 saat boyunca 37 ° C'de sallanan bir inkübatörde (200 rpm) 10 mL taze ortam ile 50 mL sallama şişelerinde ayrı ayrı yetiştirin. Sonraki deneyler için kültürlenmiş bakteri çözeltisini gliserol tüpünde depolamak için ilgili standart düzenlemeleri izleyin.

5. MMC'nin temizlenmesi

  1. Denemeyi tamamladıktan sonra, tüm işlemleri durdurmak için Durdur'a tıklayın. Ardından çipi ve tüpleri temizlemek için Temizle'ye tıklayın. Yaklaşık 15 dakika sürecek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, MMC'de otomatik ve nispeten yüksek verim stratejisi ile mikrobiyal ekimi ve metanol esansiyel adaptif evrimi göstermek için örnek olarak E. coli MG1655 ve bir MeSV2.2 suşu kullanır. Büyüme eğrisi ölçümü esas olarak mikrobiyal ekimi karakterize etmek için kullanılmıştır. Adaptif evrim, otomatik sürekli alt ekimle gerçekleştirildi ve her bir alt yetiştirme sırasında seçici basınç olarak yüksek konsantrasyonda metanol eklendi. Uyarlanabilir evrimin gerçekleşip gerçekleşmediği, her bir alt yetiştirme dö...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, otomatik mikrobiyal yetiştirme ve uzun vadeli adaptif evrim gerçekleştirmek için Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültürü sisteminin (MMC) nasıl kullanılacağını sunar. MMC minyatürleştirilmiş, otomatik ve yüksek verimli bir mikrobiyal yetiştirme sistemidir. Geleneksel mikrobiyal yüksek verimli yetiştirme yöntemleri ve cihazlarıyla karşılaştırıldığında, MMC düşük işçilik ve reaktif tüketimi, basit kullanım, çevrimiçi algılama (OD ve floresan), yüksek zaman çözünürlüklü veri toplama ve üstün paralelleştirme gibi birço...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2018YFA0901500), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Ulusal Anahtar Bilimsel Enstrüman ve Ekipman Projesi (21627812) ve Tsinghua Üniversitesi Girişimi Bilimsel Araştırma Programı (20161080108) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Prof. Julia A. Vorholt'a (Mikrobiyoloji Enstitüsü, Biyoloji Bölümü, ETH Zürih, Zürih 8093, İsviçre) metanol esansiyel E. coli suşu versiyon 2.2'nin (MeSV2.2) sağlanması için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

4< / sub> & middot

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μ m PVDF filtre membranıMerck Millipore Ltd.SLGPR33RBMMC yağını
4 ° C sterilize edin > C buzdolabıHaierBCD-289BSWReaktif depolama için
AgarBecton, Dickinson and Company214010Katı plaka hazırlama için
CaCl2· 2H2OSinopharm Kimyasal Reaktif Beijing Co., Ltd.20011160MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
Temiz tezgahPekin Donglian Har Enstrüman İmalatı Co., Ltd.DL-CJ-INDIIAseptik çalışma ve UV sterilizasyonu için
CoCl2· 6H2OSinopharm Kimyasal Reaktif Beijing Co., Ltd.10007216MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
BilgisayarLenovoE450Yazılım kurulumu ve MMC kontrolü
Sabit sıcaklık inkübatörüShanghai qixin scientific instrument co., LTDLRH 250kullanarak mikrobiyal yetiştirme için
; 5H2OSinopharm Kimyasal Reaktif Beijing Co., Ltd.10008218MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
Elektronik teraziOHAUSAR 3130EP tüpü reaktif tartımı için
Thermo Fisher1,5 mLDamlacık toplama için
FeCl3· 6H2OSinopharm Kimyasal Reaktif Beijing Co., Ltd.10011928MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
Dondurma TüpüThermo Fisher2.0 mLGerilim koruması için
GlukonatSigma-AldrichS2054MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
GliserolGENEL-REAKTİFG66258AGerilim koruması için
Yüksek Basınçlı Buharlı Sterilizasyon KabıSANYO ElektrikliMLS3020Otoklavlanmış sterilizasyon
için izopropil-β-d-tiyogalaktopiranosid (IPTG)Biyotepeli420322MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
Kanamisin sülfatSolarbioK8020MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
KH2PO4MACKLINP815661MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
MetanolMACKLINM813895MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
MgSO 4< / alt > ve orta nokta; 7H2OBIOBYING1305715MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
Mikrobiyal Mikro Damlacık Kültür Sistemi (MMC)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.  MMC-I: Büyüme eğrisi belirleme ve adaptif evrimin gerçekleştirilmesi. Lütfen http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
mikroakışkan çipLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.'MMC-ALE-ODdamlacık işlemleri için. Lütfen http://www.tmaxtree.com/en/
MMC yağıLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.'MMC-M/S-ODDamlacık mikroakışkanları için yağ fazı. Lütfen http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm Kimyasal Reaktifi Beijing Co., Ltd.'20026118MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
NaClGENEL-REAKTİFG81793JLB ortamının
bileşeni Na2< / sub>HPO4< sub> & middot; 12H2O GENELREAKTİFG10267B MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
NH < > 4< / alt > ClSinopharm Kimyasal Reaktif Beijing Co., Ltd.10001518MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
Petri kabıCorning Incorporated90 mmmu'nun hazırlanması için
; L, 10 & mu; L, 100μ L, 1000μ LSıvı kullanımı için
Hızlı bağlantı ALuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.—Her eklemin bağlantısı için. Lütfen http://www.tmaxtree.com/en/
Reaktif şişesiLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.'MMC-PCBBakteri çözeltisi ve reaktiflerinin örneklenmesi ve depolanması. Lütfen bakınız http://www.tmaxtree.com/en/
Çalkalama şişesiUnion-Biotech50 mLMikrobiyal yetiştirme için
Çalkalama inkübatörüShanghai Sukun Industrial Co., Ltd.SKY-210 2BÇalkalama şişesinde mikrobiyal yetiştirme için
Streptomisin sülfatSolarbioS8290MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
ŞırıngaJIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD10 mLSıvıyı çekin ve reaktif şişesine enjekte
Şırınga iğnesiOUBEL Hırdavat Mağazası22Gİç çap 0,41 mm ve dış çap 0,71 mm'dir.
TriptonOksoit Ltd.LP0042LB orta Ultra
düşük sıcaklık buzdolabınınSANYO Ultra düşükMDF-U4086SGerilim koruması için (-80 &�; C)
UV– Vis spektrofotometresiGeneral Electric CompanyUltrospec 3100 proOD değerlerinin ölçümü için
Vitamin B1SolarbioSV8080MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
Maya özüOxoid Ltd.LP0021LB ortamının
bileşeni ZnSO4< / sub>· 7H2OSinopharm Kimyasal Reaktif Beijing Co., Ltd.10024018MeSV2.2 için özel ortamın bileşeni.
Katı ortam CuSOye bakın. Çeşitli ye bakın.ye bakın. Katı ortam Pipeti eppendorf 2.5 & ye bakın. edin bileşeni

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
  3. Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  4. Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381(2019).
  5. Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
  6. Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
  7. Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
  8. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
  9. Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
  10. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  11. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
  12. Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
  13. Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  14. Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570(2020).
  15. Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508(2018).
  16. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
  17. Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
  18. Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
  19. Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
  20. Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
  21. Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
  22. Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998(2020).
  23. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  24. Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
  25. Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbial Microdroplet CultureAutomated Microbial CultivationAdaptive Laboratory EvolutionDroplet MicrofluidicsGrowth Curve MeasurementEscherichia Coli CultivationHigh Throughput ScreeningOnline MonitoringSub CultivationDroplet Extraction

Related Articles