Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür Sistemi (MMC) kullanılarak Otomatik Mikrobiyal Yetiştirme ve Uyarlanabilir Evrim

Mikrobiyal tarım, mikroorganizmaların izolasyonu, tanımlanması, yeniden yapılandırılması, taranması ve evriminde yaygın olarak kullanılan mikrobiyolojik bilimsel araştırmalar ve endüstriyel uygulamalar için önemli bir temeldir ^1,2,3. Geleneksel mikrobiyal yetiştirme yöntemleri esas olarak test tüplerini, sallama şişelerini ve katı plakaları yetiştirme kapları olarak kullanır, ayrıca sallama inkübatörleri, spektrofotometreler, mikro plaka okuyucuları ve mikrobiyal yetiştirme, tespit ve tarama için diğer ekipmanlarla birleştirilir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin hantal işlemler, düşük verim, düşük verimlilik ve büyük işgücü ve reaktif tüketimi gibi birçok sorunu vardır. Son yıllarda geliştirilen yüksek verimli yetiştirme yöntemleri esas olarak mikroplakaya dayanmaktadır. Ancak mikroplaka düşük çözünmüş oksijen seviyesine, zayıf karıştırma özelliğine ve şiddetli buharlaşma ve termal etkiye sahiptir, bu da genellikle zayıf büyüme durumuna ve mikroorganizmaların deney paralelliğine yol açar 4,5,6,7; Öte yandan, otomatik yetiştirme ve proses tespiti elde etmek için sıvı taşıma iş istasyonları ve mikro plaka okuyucular gibi pahalı ekipmanlarla donatılması gerekir ^8,9.

Mikroakışkan teknolojisinin önemli bir dalı olan damlacık mikroakışkanları, son yıllarda geleneksel sürekli akışlı mikroakışkan sistemlere dayanarak geliştirilmiştir. Dağınık mikro damlacıklar üretmek ve bunlar üzerinde çalışmak için iki karışmaz sıvı fazı (genellikle yağ-su) kullanan ayrık akışlı bir mikroakışkan teknolojisidir¹⁰. Mikro damlacıklar küçük hacimli, geniş spesifik yüzey alanı, yüksek iç kütle transfer hızı özelliklerine sahip olduğundan ve bölümlere ayırmanın neden olduğu çapraz kontaminasyon olmadığından ve damlacıkların güçlü kontrol edilebilirliği ve yüksek veriminin avantajlarına sahip olduğundan, yüksek verimli ekim, eleme ve mikroorganizmaların evriminde damlacık mikroakışkan teknolojisini uygulayan birçok araştırma türü olmuştur¹¹ . Bununla birlikte, damlacık mikroakışkan teknolojisinin popülerleşmesini ve yaygın olarak uygulanmasını sağlamak için hala bir dizi önemli konu vardır. İlk olarak, damlacık mikroakışkanlarının çalışması hantal ve karmaşıktır, bu da operatörler için yüksek teknik gereksinimlere neden olur. İkincisi, damlacık mikroakışkan teknolojisi optik, mekanik ve elektrikli bileşenleri birleştirir ve biyoteknoloji uygulama senaryolarıyla ilişkilendirilmesi gerekir. Çok disiplinli bir işbirliği yoksa, tek bir laboratuvar veya ekibin verimli damlacık mikroakışkan kontrol sistemleri kurması zordur. Üçüncüsü, küçük hacimli mikro damlacık nedeniyle (pikoliter (pL) mikrolitreye (μL)), alt ekim, sıralama ve örnekleme gibi bazı temel mikrobiyal işlemler için damlacıkların hassas otomatik kontrolünü ve gerçek zamanlı çevrimiçi tespitini gerçekleştirmek çok zordur ve entegre bir ekipman sistemi oluşturmak da zordur¹².

Yukarıdaki sorunları çözmek için, damlacık mikroakışkan teknolojisine dayanan otomatik bir Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür sistemi (MMC) başarıyla geliştirilmiştir¹³. MMC dört işlevsel modülden oluşur: damlacık tanıma modülü, damlacık spektrumu algılama modülü, mikroakışkan çip modülü ve örnekleme modülü. Tüm modüllerin sistem entegrasyonu ve kontrolü sayesinde, damlacıkların üretimi, yetiştirilmesi, ölçülmesi (optik yoğunluk (OD) ve floresan), bölünmesi, füzyonu, ayrıştırılması dahil olmak üzere otomatik işletim sistemi doğru bir şekilde kurulmakta, mikrobiyal damlacık yetiştiriciliği işleminin gerektirdiği aşılama, ekim, izleme, alt ekim, ayıklama ve numune alma gibi fonksiyonların entegrasyonu sağlanmaktadır. MMC, 200 sallama şişesi yetiştirme ünitesine eşdeğer olan 2-3 μL hacimli 200 kopya damlacık yetiştirme ünitesini tutabilir. Mikro-damlacık yetiştirme sistemi, mikroorganizmaların büyümesi sırasında kontaminasyonsuz, çözünmüş oksijen, karıştırma ve kütle-enerji değişimi gereksinimlerini karşılayabilir ve örneğin büyüme eğrisi ölçümü, uyarlanabilir evrim, tek faktörlü çok seviyeli analiz ve metabolit araştırması ve analizi (floresan tespitine dayalı) gibi çoklu entegre fonksiyonlar aracılığıyla mikrobiyal araştırmanın çeşitli ihtiyaçlarını ^{karşılayabilir13,14}.

Burada protokol, MMC'nin otomatik ve mikrobiyal yetiştirme ve uyarlanabilir evrimi ayrıntılı olarak yürütmek için nasıl kullanılacağını tanıtmaktadır (Şekil 1). Büyüme eğrisi ölçümünü göstermek için vahşi tip Escherichia coli (E. coli) MG1655'i ve MMC'deki adaptif evrimi göstermek için metanol esansiyel E. coli suşu MeSV2.2^15'i örnek olarak aldık. MMC için bir operasyon yazılımı geliştirildi, bu da işlemi çok basit ve net hale getiriyor. Tüm süreçte, kullanıcının ilk bakteri çözeltisini hazırlaması, MMC'nin koşullarını ayarlaması ve ardından bakteri çözeltisini ve ilgili reaktifleri MMC'ye enjekte etmesi gerekir. Daha sonra, MMC damlacık oluşturma, tanıma ve numaralandırma, yetiştirme ve uyarlanabilir evrim gibi işlemleri otomatik olarak gerçekleştirecektir. Ayrıca, damlacıkların yüksek zaman çözünürlüğüne sahip çevrimiçi tespitini (OD ve floresan) gerçekleştirecek ve ilgili verileri (dışa aktarılabilen) yazılımda görüntüleyecektir. Operatör, sonuçlara göre yetiştirme işlemini istediği zaman durdurabilir ve sonraki deneyler için hedef damlacıkları çıkarabilir. MMC'nin kullanımı kolaydır, daha az emek ve reaktif tüketir ve nispeten yüksek deneysel verime ve geleneksel yetiştirme yöntemlerine kıyasla önemli avantajlara sahip olan iyi veri paralelliğine sahiptir. Araştırmacıların ilgili mikrobiyal araştırmaları yürütmeleri için düşük maliyetli, operasyon dostu ve sağlam bir deneysel platform sağlar.

1. Cihaz ve yazılım kurulumu

1. MMC için ayrılmış kalıcı alan olarak temiz ve steril bir ortam (temiz bir tezgah gibi) seçin. MMC'yi alana sabit bir şekilde yükleyin.
   NOT: MMC'yi güçlü elektrik alanlarının, manyetik alanların ve güçlü ısı radyasyon kaynaklarının parazitinden uzak tutun. Optik algılama bileşenlerini etkilemekten kaynaklanan şiddetli titreşimlerden kaçının. MMC'ye AC220 V, 50 HZ güç kaynağı sağlayın. MMC hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na ve MMC¹⁶ web sitesine bakın.
2. MMC.zip dosyasından işlem yazılımını yükleyin
   Not: MMC.zip dosyası için yazarlara başvurun.
   1. Özel bir klasör oluşturun ve zip dosyasını içine kaydedin.
   2. "Kurulum Dizini" olarak başka bir özel klasör oluşturun. MMC.zip sıkıştırmasını açın ve dosyaları yeni klasöre kaydedin.
      NOT: Bilgisayar yapılandırması karşılamak için en iyisidir: (1) Windows 7 64 bit işletim sistemi veya üstü; (2) CPU: i5 veya üstü; (3) bellek: 4 GB veya üstü; (4) sabit disk: 300 GB veya üstü (7200 rpm'den veya katı hal diskinden daha büyük dönme hızı).

2. Hazırlıklar

1. Şırınga iğnesini (iç çap 0,41 mm ve dış çap 0,71 mm), hızlı konektör A'yı ve reaktif şişesini (Şekil 2C) bağlayın ve 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav yapın.
   NOT: Sterilizasyon sırasında reaktif şişesinin kapağını hafifçe sökün. Kullanım için her seferinde birkaç reaktif şişesi daha hazırlanabilir.
2. MMC yağını filtrelemek için 0,22 μm poliviniliden florür (PVDF) filtresi kullanın. Mikroakışkan çipi (Şekil 2B) ve MMC yağını önceden temiz tezgaha koyun ve kullanmadan önce 30 dakika boyunca ultraviyole ışınlama ile sterilize edin.
   NOT: Hızlı konektör A, reaktif şişesi, MMC yağı ve mikroakışkan çipin ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın.
3. Mikroakışkan çipi takın
   1. Operasyon odasının kapısını açın (Şekil 2A) ve optik fiber probu kaldırın.
   2. Elektrik alan deliklerini elektrik alan iğneleriyle hizalayın ve çipi yavaşça talaş kaidesine yerleştirin. Ardından iki konumlandırma sütununu konumlandırma deliklerine yerleştirin ve optik fiber probu yerleştirin (Şekil 2D).
   3. Çip üzerindeki hızlı konektör A'yı, konum numarasına göre MMC'nin ilgili bağlantı noktasına bağlayın (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Ardından operasyon odasının kapısını kapatın.
4. MMC yağını (yaklaşık 80 mL'ye kadar) yağ şişesinde doldurun ve kullanmadan önce atık sıvıyı atık şişesinde boşaltın.
   NOT: Atık sıvı genellikle organik atıktır. Lütfen deneysel düzeneğe bağlı olarak değişikliğe tabi olan bertaraf üzerine bölgesel yasa ve yönetmeliklere bakın.

3. MMC'de büyüme eğrisi ölçümü

1. İlk bakteriyel çözelti için hazırlık
   1. Luria-Bertani (LB) ortamını ve otoklavı 121°C'de 15 dakika boyunca hazırlamak için ilgili standart yönetmeliklere uyun.
      NOT: LB ortamının bileşenleri: NaCl (10 g / L), maya ekstraktı (5 g / L) ve tripton (10 g / L).
   2. E. coli MG1655 suşunu gliserol stoğundan çıkarın ve 5-8 saat boyunca 37 ° C'de sallanan bir inkübatörde (200 rpm) 10 mL LB ortamı ile 50 mL'lik bir sallama şişesinde yetiştirin.
      NOT: Yetiştirme süresi belirli suşlara bağlıdır. Suşu logaritmik döneme/faza yetiştirmek en uygunudur.
   3. İlk bakteri çözeltisini elde etmek için kültürlenmiş E. coli MG1655 çözeltisini taze ortamla_0.05-0.1'lik bir OD 600'e seyreltin (yaklaşık 10 mL hazırlayın).
2. MMC'yi başlatmak için Başlatma'ya tıklayın. Başlatma arayüzü göründükten sonra, yetiştirme sıcaklığını 37 °C ve fotoelektrik sinyal değerini 0,6 olarak ayarlayın (Şekil 3A). Başlatma yaklaşık 20 dakika sürecektir.
3. Başlatma sırasında UV lambasını (dalga boyu 254 nm) açın.
4. İlk bakteri çözeltisini ve MMC yağını reaktif şişesine enjekte edin.
   1. Temiz tezgahta sterilize edilmiş bir reaktif şişesi çıkarın ve kapağı sıkın.
   2. Yan tüpün şırınga iğnesinden 3-5 mL MMC yağı enjekte etmek için 10 mL steril bir şırınga kullanın. Yağın iç duvara tamamen sızmasını sağlamak için reaktif şişesini yavaşça eğin ve döndürün.
   3. Yaklaşık 5 mL başlangıç bakteri çözeltisi enjekte edin ve daha sonra 5-7 mL yağı tekrar enjekte ederek reaktif şişesini doldurun.
   4. Numune enjeksiyon işlemini tamamlamak için bağımsız hızlı konektör A'yı dışarı çekin ve reaktif şişesinin hızlı A konektörünü hızlı B konektörüne takın (Şekil 4A).
5. Başlatmanın bitmesini bekleyin ve ardından UV lambasını kapatın (dalga boyu 254 nm).
6. Operasyon odasının kapısını açın ve reaktif şişesini metal banyoya koyun.
7. Çipin C2 konektörünü ve reaktif şişesinin hızlı A konektörünü dışarı çekin. Reaktif şişesinin yan boru konektörünü C2 konektörüne ve üst boru konektörünü O2 konektörüne bağlayın. Ardından operasyon odasının kapısını kapatın.
8. Büyüme eğrisi ölçümünün işlevini seçmek için Büyüme Eğrisi'ne tıklayın (Şekil 3A). Parametre ayarı arayüzünde, Sayıyı 15 olarak girin, OD algılama anahtarını açın ve Dalga Boyunu 600 nm olarak ayarlayın. Damlacık oluşturmaya başlamak için Başlat'a tıklayın. Yaklaşık 10 dakika sürecek.
   NOT: Burada, Sayı , oluşturulacak damlacıkların sayısını ifade eder. Dalga boyu , tespit edilecek OD'nin dalga boyunu ifade eder. Deney gereksinimlerine göre Sayı (maksimum 200) ve Dalga Boyu'nu (350-800 nm) ayarlayın.
9. Ana arayüzde "C2 ve O2 arasındaki reaktif şişesini çıkarın, ardından lütfen tamamlandıktan sonra Tamam düğmesine tıklayın" diyen bir açılır pencere göründüğünde, reaktif şişesini çıkarmak ve C2 ve O2 konektörlerini bağlamak için işlem odasının kapısını açın.
10. Kapıyı kapatın ve damlacıkları otomatik olarak yetiştirmek ve OD değerlerini algılamak için açılır penceredeki Tamam düğmesine tıklayın.
    NOT: MMC, damlacık optik fiber probu geçtiğinde OD değerini algılar. Bu nedenle, algılama süresi üretilen damlacıkların sayısına bağlıdır.
11. Büyüme eğrisi durağan aşamaya ulaştığında, OD verilerini dışa aktarmak için Veri Dışa Aktarma düğmesini tıklatın. Veri kaydetme yolunu seçin ve yetiştirme döneminde kaydedilen OD değerini, uygun yazılım (örneğin, Microsoft Excel) tarafından açılabilen .csv biçiminde dışa aktarın. Ardından, büyüme eğrisini çizmek için bir haritalama yazılımı (örneğin, EXCEL ve Origin 9.0) kullanın.
    NOT: Yetiştirme işlemi sırasında, mevcut tüm damlacıkların OD verilerini dışa aktarmak için herhangi bir zamanda Veri Dışa Aktarma'ya tıklamak mümkündür.

4. MMC'de uyarlanabilir evrim

1. İlk bakteriyel çözelti için hazırlık
   1. MeSV2.2 için özel sıvı ortam ve katı plakaları ve 121 °C'de otoklav için 15 dakika boyunca hazırlamak üzere ilgili standart yönetmeliklere uyun.
      NOT: Özel ortamın bileşenleri için Tablo 1 ve Malzeme Tablosuna bakınız.
   2. MeSV2.2'yi katı plakayı (çap = 90 mm) kullanarak 37 °C sabit sıcaklık inkübatöründe 72 saat boyunca yetiştirin. Daha sonra bağımsız bir koloni seçin ve 72 saat boyunca 37 ° C'de sallanan bir inkübatörde (200 rpm) 10 mL özel sıvı ortam ile 50 mL'lik bir sallama şişesinde yetiştirin.
   3. Kültürlenmiş MeSV2.2 çözeltisini ortamla_0.1-0.2'lik bir OD 600'e kadar seyreltin (toplam hacmin 10 mL'den az olmadığından emin olun) ve ilk bakteri çözeltisini elde etmek için sallama şişesinde 5 saat boyunca yetiştirmeye devam edin.
      NOT: MeSV2.2, metanol esansiyel bir E. coli suşudur. Özel sıvı ortam, MeSV2.2 için güçlü bir stres olan ve çok yavaş büyümeye neden olan 500 mmol / L metanol içerir. İlk bakteri çözeltisinin burada elde edilmesinin, adım 3.1'de açıklanandan farklı olduğunu unutmayın.
2. MMC'yi adım 3.2, 3.3 ve 3.5'te açıklandığı gibi başlatın.
3. Biri ilk bakteri çözeltisi ve diğeri taze ortam için olmak üzere iki sterilize reaktif şişesi çıkarın. İlk bakteri çözeltisini (5 mL), taze ortamı (12-15 mL) ve MMC yağını adım 3.4'te açıklandığı gibi reaktif şişelerine enjekte edin.
   NOT: Uyarlanabilir evrim, birden fazla alt yetiştirmeyi içeren uzun vadeli bir süreç olduğundan, MMC'de mümkün olduğunca fazla taze ortam depolayın. Ortam, deneme çalışırken yenilenemez.
4. İki reaktif şişesini adım 3.6'da açıklandığı gibi MMC'ye takın. Birini C2 ve O2 konektörü arasındaki ilk bakteri çözeltisi için, diğerini ise C4 ve O4 konektörü arasındaki taze ortam için takın.
5. Uyarlanabilir evrimin işlevini seçmek için ALES'e tıklayın (Şekil 3B). Parametre ayarı arabiriminde, OD Algılama anahtarını açın.
6. Sayıyı 50, Dalga Boyunu 600 nm, Konsantrasyonu %0, Zaman Türü, Parametreyi 30 saat ve Tekrarları 99 olarak ayarlayın. Damlacık oluşturmaya başlamak için Başlat'a tıklayın. Yaklaşık 25 dakika sürecektir.
   NOT: Burada "Konsantrasyon", adaptif evrim için kimyasal faktörlerin maksimum konsantrasyonunu ifade eder. Farklı damlacıklar için, MMC'de farklı büyüme koşulları sağlamak için farklı konsantrasyonlarda kimyasal faktörler tanıtmak mümkündür. Aşağıdaki denklemi kullanarak tanıtılan konsantrasyonları hesaplayın:
   
   Burada "C", damlacıklara sokulan kimyasal faktörlerin konsantrasyonunu ifade eder; "a", C4 ve O4 konektörü arasındaki reaktif şişelerindeki kimyasal faktörlerin konsantrasyonunu ifade eder; "b", C6 ve O6 konektörü arasındaki reaktif şişelerindeki kimyasal faktörlerin konsantrasyonunu ifade eder; ve "i" mevcut konsantrasyonu ifade eder. MMC'de sekiz konsantrasyon vardır. Buradaki kimyasal faktör tek bir konsantrasyona (500 mmol / L metanol) sahip olduğundan ve ortamın bileşenlerinden biri olduğundan, kimyasal faktörü içeren sadece bir reaktif şişesi buraya monte edilir ve Konsantrasyon % 0 olarak ayarlanır. Tip , üç türe ayrılan alt yetiştirme modunu ifade eder: zaman modu, OD değer modu ve floresan modu. Birincisi, damlacıkları sabit bir süre boyunca yetiştirmek ve daha sonra alt yetiştirmek anlamına gelirken, son ikisi damlacıkları önceden tanımlanmış OD değerine / floresan yoğunluğuna yetiştirmek ve daha sonra alt yetiştirmek anlamına gelir. Parametre , bir alt yetiştirme modu seçerken gerekli olan ilgili parametreyi ifade eder. Tekrarlar , alt -uygulamaların sayısını ifade eder.
7. C2 ve O2 konektörü arasına yerleştirilen reaktif şişesini adım 3.8'de açıklandığı gibi çıkarın.
8. Her bir alt yetiştirme döneminde damlacıkların maksimum OD değerlerinin önemli ölçüde artıp artmadığını gözlemleyin. Artış gerçekleşirse ve deneme gereksinimlerini karşılıyorsa, adım 3.9'da açıklandığı gibi OD verilerini dışa aktarmak için Veri Dışa Aktarma düğmesine tıklayın.
   NOT: Burada, alt yetiştirme süresi Parametreye bağlıdır. Örneğin, Zaman ve Parametre olarak Tür 30 saat olarak ayarlanırken, alt yetiştirme süresi 30 saattir. Her alt yetiştirme döneminde, damlacıkların maksimum OD değerleri vardır. Maksimum OD değerlerinin artmasıyla uyarlanabilir evrimin deney gereksinimlerini karşılayıp karşılamadığını tahmin edin (Artış, suşun gerçek yetiştirme sürecine bağlıdır, örneğin,% 20'den fazla artmıştır).
   DİKKAT: Depolanan taze ortamın tükenmiş olup olmadığına dikkat edin. Ortam tükendikten sonra bile önemli bir artış meydana gelmediyse, daha iyi büyüyen damlacıkları çıkarın ve yeni bir adaptif evrim turu gerçekleştirin.
9. Hedef damlacıkları MMC'den ayıklayın.
   1. Damlacık ekstraksiyonunun işlevini seçmek için Tarama düğmesine tıklayın (Şekil 3C). Topla seçeneğini seçin, hedef damlacıkların sayısına tıklayın ve ardından Tamam'a tıklayın.
      NOT: Damlacık taraması "Topla", "At" ve "Ekstrakt tohum çözeltisi" ni içerir. "Tohum çözeltisini ekstrakte et", alt yetiştirme işleminden sonra kalan damlacıkları¹³ toplamak anlamına gelir.
   2. Açılır pencerenin "Lütfen CF hızlı konektörünü çıkarın ve EP tüpüne yerleştirin" uyarısını yapmasını bekleyin. CF hızlı konektörünü, yazılım istemine göre toplanmak üzere mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve ardından Tamam'a tıklayın (Şekil 4D).
   3. 1-2 dakika sonra, yazılım arayüzü "Lütfen konektörü geri takın ve bittiyse Tamam'ı tıklayın" diyen yeni bir pencere açılacaktır. Ardından, CF hızlı bağlayıcısını geri takın ve MMC'nin çalışmaya devam etmesini sağlamak için Tamam'a tıklayın (Şekil 4D). Bir sonraki hedef damlacık damlacık tanıma sitesine ulaştığında, toplamak için 4.9.2-4.9.3'ü tekrarlayın.
      NOT: Tüm hedef damlacıklar toplandıktan sonra, MMC kalan damlacıkları yetiştirmeye devam edecektir. Yetiştirme gerekli değilse, işlemi doğrudan sonlandırmak için Durdur'a tıklayın.
   4. Damlacığı 2,5 μL'lik bir pipet kullanarak çıkarın, 90 mm agaroz plakasına bırakın ve yan uzunluğu 3 cm olan üçgen bir cam serpme çubuğu ile eşit şekilde yayın. Daha sonra 72 saat boyunca 37 ° C sabit sıcaklık inkübatöründe yetiştirin.
   5. 3-5 bağımsız koloni seçin ve bunları 48-72 saat boyunca 37 ° C'de sallanan bir inkübatörde (200 rpm) 10 mL taze ortam ile 50 mL sallama şişelerinde ayrı ayrı yetiştirin. Sonraki deneyler için kültürlenmiş bakteri çözeltisini gliserol tüpünde depolamak için ilgili standart düzenlemeleri izleyin.

5. MMC'nin temizlenmesi

1. Denemeyi tamamladıktan sonra, tüm işlemleri durdurmak için Durdur'a tıklayın. Ardından çipi ve tüpleri temizlemek için Temizle'ye tıklayın. Yaklaşık 15 dakika sürecek.

Bu protokol, MMC'de otomatik ve nispeten yüksek verim stratejisi ile mikrobiyal ekimi ve metanol esansiyel adaptif evrimi göstermek için örnek olarak E. coli MG1655 ve bir MeSV2.2 suşu kullanır. Büyüme eğrisi ölçümü esas olarak mikrobiyal ekimi karakterize etmek için kullanılmıştır. Adaptif evrim, otomatik sürekli alt ekimle gerçekleştirildi ve her bir alt yetiştirme sırasında seçici basınç olarak yüksek konsantrasyonda metanol eklendi. Uyarlanabilir evrimin gerçekleşip gerçekleşmediği, her bir alt yetiştirme döneminde damlacıkların maksimum OD değerinin değişim eğilimi ile tahmin edildi. MMC'nin ayarlanabilir parametreleri ve doğruluk parametreleri Tablo 2'de gösterilmiştir.

Büyüme eğrisi ölçümünün sonuçları
Yetiştirme işlemi sırasında tespit edilen 15 damlacığın OD600 değerleri, yaklaşık 20 saat boyunca ekimden sonra MMC'den ihraç edilmiştir (Şekil 5A). Tespitin yaklaşık her 14 dakikada bir yapıldığı gözlemlenebilir. Bu algılama süresi, üretilen damlacıkların sayısına bağlıdır, çünkü damlacıklar yetiştirme için tüplerde ileri geri döndürülür ve algılama modülü, damlacıklar optik fiber probu geçtiğinde yalnızca OD değerlerini algılar (OD değerinin tespiti ve hesaplanması Ek Şekil 1'de gösterilmiştir). Bu nedenle, 14 dakika çok kısa bir algılama süresidir ve mikroorganizmaların büyümesini daha doğru bir şekilde yansıtmak için yüksek zaman çözünürlüklü bir algılama işlemi sağlar.

İhraç edilen verilere göre ortalama OD600 değerleri ve her zaman noktasında 15 damlacığın standart sapması (SD) hesaplanmış ve E. coli MG1655'in büyüme eğrisi çizilmiştir (Şekil 5B). Sonuçlar, büyüme eğrisinin, klasik mikrobiyal büyüme modeliyle çok tutarlı olan gecikme fazı, logaritmik faz ve durağan faz dahil olmak üzere bir "S" şekli sunduğunu göstermektedir. Aynı zamanda, 15 damlacığın standart sapmaları çok küçüktür, bu da iyi büyüme tutarlılığı ve paralelliği gösterir. Böylece, MMC'nin iyi mikrobiyal yetiştirme ve tespit performansını tam olarak göstermektedir. Ayrıca, ekim sırasında damlacıklar arasında çok az çapraz konuşma olduğu da doğrulanmıştır (Ek Şekil 2 ve Ek Tablo 1).

Uyarlanabilir evrimin sonuçları
MMC'de MeSV2.2'nin uzun vadeli uyarlanabilir bir evrimini gerçekleştirdik. 18. günde, yazılım arayüzünde görüntülenen büyüme eğrilerinden her bir alt yetiştirme döneminde damlacıkların maksimum OD600 değerlerinin artan eğilimine göre, 50 damlacıkta iyi bir adaptif evrim elde edildiğine inandık. OD600 verileri dışa aktarıldı ve nispeten iyi büyüme performansına sahip 8 damlacık (damlacık 6 dahil) çıkarıldı13. Şekil 6A, tüm adaptif evrim sürecinde 50 damlacığın büyüme eğrilerini göstermektedir. 18 gün içinde, MMC otomatik olarak 13 alt yetiştirme işlemi gerçekleştirdi. Şekil 6A'dan MeSV2.2'nin önce yavaş ve daha sonra hızlı büyüdüğü görülebilir, bu da MeSV2.2'deki uyarlanabilir evrimin izini gösterir. Bir seçim basıncı sağlamak için, metanol MeSV2.2 ortamına eklendi. Başlangıçta, metanol hücre büyümesini inhibe etti. Adaptif evrimden sonra, metanole adapte olmuş zenginleştirilmiş hücreler daha yüksek bir büyüme oranına sahipti. Tüm adaptif evrim sürecindeki damlacık 6'nın büyüme eğrisi ayrı ayrı çizilmiştir (Şekil 6B). Birinci nesil ve son alt yetiştirme döneminde maksimum OD600 değerleri sırasıyla 0,37 ve 0,58 iken, V,8 oranında artmıştır. Damlacık 6'daki suşun bariz bir adaptif evrim gerçekleştirdiğini gösterir.

Daha sonra, damlacık 6 suşu ve sallama şişelerindeki ilk suş yetiştirildi ve büyüme eğrileri karşılaştırıldı (Şekil 6C). Literatürde verilen yöntemlere göre17,18 damlacık 6 suşu ve başlangıç geriniminin maksimum spesifik büyüme hızları (μmaksimum) hesaplanmış olup, bunlar sırasıyla 0.096 h-1 ve 0.072 h-1 idi. Şekil 6C, damlacık 6 suşunun daha yüksek bir maksimum spesifik büyüme hızı sergilediğini (% 54.8 oranında artarak) ve sabit fazda, sallanma şişelerinde yetiştirildiğinde ilk suştan daha yüksek bir hücre konsantrasyonuna sahip olduğunu (% 20.0 oranında artarak) ortaya koymaktadır, bu da MeSV2.2'deki adaptif evrimin gerçekleştiğini göstermektedir.

Şekil 1: MMC'de büyüme eğrisi ölçümü ve uyarlanabilir evrimin genel iş akışı. (A) MMC'de büyüme eğrisi ölçümü. İlk olarak, ilk bakteriyel çözeltiyi hazırlamak için suşları sallama şişesinde yetiştirin. Daha sonra, ilk bakteri çözeltisini reaktif şişesine enjekte edin. Ardından, damlacıkları MMC'de oluşturun. MMC, damlacıkların mikroakışkan çipte ve tüplerde ileri geri dönmesini sağlayarak onları yetiştirmesini sağlar. Damlacıklar algılama bölgesini geçtiğinde, OD verileri algılanır ve kaydedilir. Son olarak, analiz için verileri dışa aktarın. (B) MMC'de uyarlanabilir evrim. Agaroz plakasından tek bir koloni seçin ve ilk bakteriyel çözeltiyi hazırlamak için sallanan bir şişede yetiştirin. İlk bakteri çözeltisini reaktif şişesine enjekte ettikten sonra, MMC'de adaptif evrimi gerçekleştirin. Adaptif evrim, damlacık bölünmesi ve füzyonu yoluyla otomatik olarak çalıştırılabilen sürekli alt ekimi içerir. Uyarlanabilir evrimden sonra, verileri analiz için dışa aktarın. Hedef damlacıklar ekstrakte edilebilir ve daha sonra tek koloniler elde etmek için plakaya yayılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: MMC'nin yapısı ve temel araçları. (A) MMC'nin dış ve operasyon odası. (B) MMC'nin mikroakışkan çipi. Çipin yedi kanalı vardır (C1-C6 ve CF). (C) Reaktif şişesi. Bir üst tüp ve bir yan tüp vardır. Numuneyi reaktif şişesine enjekte etmeden önce, önce bir şırınga iğnesini hızlı bir konektör A'ya bağlaması ve ardından hızlı konektör A'yı yan tüpe bağlaması gerekir. (D) Mikroakışkan çipin montajı. Mikroakışkan çip kaide üzerine monte edilmiştir. Daha sonra yedi kanal (sırasıyla C1-C6 ve CF) MMC'nin (O1-O6 ve OF) ilgili bağlantı noktalarına bağlanır.

1 - MMC'nin operasyon odası.
2 - MMC yağı içeren yağ şişesi.
3 - Atık sıvı toplamak için atık şişe.
4 - Sterilizasyon için UV lambası (dalga boyu 254 nm). Bu lamba, çipi ve tüpleri sterilize etmek için önceden açılabilir.
5 - Damlacık tanıma için lazer (620 nm). Lazerin çip üzerinde ışınlandığı nokta damlacık tanıma bölgesidir.
6 - Çalışma odasının içindeki sıcaklığı ölçmek için sıcaklık probu.
7 - Operasyon odası için ısıtıcı. Mikrobiyal yetiştiriciliğin sıcaklığını korumak için kullanılabilir. Ayarlanabilen sıcaklık aralığı 25 ± 0,5 °C ila 40 ± 0,5 °C'dir.
8 - OD veya damlacıkların floresansını ölçmek için optik fiber prob.
9 - Mikroakışkan çipi takmak için çip kaidesi.
10 - Reaktif şişelerini sabitlemek ve bir reaktifin sıcaklığını mikrobiyal yetiştirme sıcaklığına hızlı bir şekilde yükseltmek için ısıtmak için metal banyosu.
11 - Mikroakışkan çip için bağlantı noktaları (O1-O6 ve OF). Mikroakışkan çip MMC'ye bu portlar üzerinden bağlanır.
12 - Damlacık depolama ve yetiştirme tüpleri.
13 - Kurulum sırasında mikroakışkan çipi hızlı bir şekilde bulmak için mıknatıs bloklar.
14 - Numuneleri reaktif şişelerine enjekte etmek için şırınga iğnesi. İç çapı 0,41 mm, dış çapı 0,71 mm'dir.
15 - Hızlı konektör A. Hızlı konektör B ile bağlayın.
16 - Hızlı konektör B. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: MMC'nin işletim yazılımı arayüzü. (A) Yazılımın ana arayüzü. (1) Operasyon odasındaki sıcaklık. (2) Damlacık tanımanın fotoelektrik sinyal değeri. Damlacık geçtiğinde, sinyal değeri yüksektir (>2 V). Yağ geçtiğinde, sinyal değeri düşüktür (<1 V). (3) İşlev seçimi. Aralarından seçim yapabileceğiniz dört işlev vardır: büyüme eğrisi ölçümü (Büyüme Eğrisi), uyarlanabilir laboratuvar evrimi (ALE), tek faktörlü çok seviyeli analiz (Tek faktörlü) ve işlemleri deneysel ihtiyaçlara göre özelleştirme (Özelleştirme). (4) Parametre ayar arayüzü. Bir işlev seçtikten sonra ilgili deneysel parametreleri burada ayarlayın. (5) Komut çalıştırma alanı. (6) Kamera anahtarı. Kamera doğrudan çipin üzerine monte edilmiştir ve çipteki damlacıkları çevrimiçi olarak gözlemlemek için kullanılabilir. (7) İşlem görüntüleme alanı. Çalışma süresini, izleme verilerini ve yürütülen işlemi gösterir. (B) Uyarlanabilir evrimin parametre ayar arayüzü. (C) Damlacık tarama arayüzü. MMC, damlacıkları otomatik olarak numaralandırabilir. Burada hedef damlacıklar seçilebilir ve MMC'den çıkarılabilir. (D) Kamera gözlem arayüzü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Örnek enjeksiyonu, damlacık üretimi ve damlacık ekstraksiyonu. (A) Bakteri çözeltisi ve MMC yağı enjeksiyonundan sonra reaktif şişesi. Hem bakteri çözeltisi hem de MMC yağı yan tüpten enjekte edilir. Yağ fazı üst tabakadadır ve bakteri çözeltisi alt tabakadadır. Enjeksiyondan sonra, A ve B hızlı bağlayıcısını bağlayın ve ardından MMC'ye takın. (B) Mikroakışkan çipte damlacık oluşumu. Damlacıkların görünürlüğünü arttırmak için, damlacık oluşturma sürecini göstermek için kırmızı bir pigment çözeltisi kullanılmıştır. (C) Mikroskopla gözlemlenen tüpte depolanan damlacık. Ölçek çubuğu: 400 μm. (D) Açılır pencere istemleri ve ilgili işlemler. "Lütfen CF hızlı konektörünü çıkarın ve EP tüpüne yerleştirin" istemi göründüğünde, CF konektörünü dışarı çekin ve hedef damlacığı toplamak için EP tüpüne yerleştirin; "Lütfen konektörü geri takın" istemi göründüğünde, damlacık toplama işlemi tamamlandığında, CF konektörünü OF bağlantı noktasına geri takın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Veri dışa aktarma ve büyüme eğrisinin şekil çizimi. (A) Dışa aktarılan verilerin bir kısmının ekran görüntüsü. Dışa aktarılan veriler, oluşturulan 15 damlacığın her algılama zaman noktasını ve karşılık gelen OD600 değerlerini içerir. (B) E. coli MG1655'in büyüme eğrisi, dışa aktarılan verilere dayanarak çizilmiştir. Ortalama OD600 değerlerini ve her zaman noktasında 15 damlacığın standart sapmasını (SD) hesaplayın ve büyüme eğrisini çizin. Bu büyüme eğrisinin gecikme fazını, logaritmik fazı ve durağan fazı içerdiğini görmek açıktır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: MMC'de MeSV 2.2'nin uyarlanabilir evriminin sonuçları. (A) Tüm adaptif evrim sürecinde 50 damlacığın büyüme eğrileri. 18 günlük uyarlanabilir evrim süreci sırasında 50 damlacığın OD600 algılama verileri MMC'den dışa aktarıldı ve çizildi. 18. günde, damlacık 6 dahil olmak üzere 8 damlacık çıkarıldı. (B) Tüm adaptif evrim sürecinde damlacık 6'nın büyüme eğrisi. Birinci nesil ve son alt yetiştirme döneminde maksimum OD600 değerleri sırasıyla 0,37 ve 0,58 iken, V,8 oranında artmıştır. (C) Damlacık 6 suşu ile sallama şişesindeki ilk gerinimin karşılaştırılması. Damlacık 6 suşu ve ilk suş sallama şişelerinde yetiştirildi ve büyüme eğrileri (SD, n = 3 dahil) ölçüldü. Bu rakam Jian X. J. et al.13'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: MeSV2.2 için özel ortamın bileşenleri.

Tablo 2: MMC'nin ayarlanabilir parametreleri ve doğruluk parametreleri. Ayarlanabilir parametreler, kullanıcıların özel gereksinimlerine göre ayarlanabilen parametreleri ifade eder; doğruluk parametreleri, farklı akışkan işlemlerin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini yansıtan parametreleri ifade eder.

Ek Şekil 1: MMC'de damlacıkların tanınması ve tespiti. (A) MMC'deki bir damlacığın dalga formu. Bu dalga formu, MMC spektrometresinin ham spektral verilerinden gelir. Arka planda ham spektral verileri işledikten sonra, MMC ölçülen OD değerini verecektir. (B) MMC'deki damlacıkların OD hesaplaması. Damlacığın dalga formunda, 'a' damlacığın maksimum uzunluğunu, 'c' yağ fazı ve su fazı tarafından oluşturulan yay şeklindeki arayüzü ve 'b' damlacığın ana kısmını temsil eder. Lambert-Beer yasasına dayanarak, damlacığın OD değeri aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: OD değeri = lg (E / D) × 10. 'E', yağ fazının ortalama spektral sinyal değerini ifade eder; 'D', damlacığın ana kısmı b'nin ortalama spektral sinyal değerini ifade eder. MMC tarafından ölçülen OD değerinin, bir spektrofotometre ile ölçülenden farklı olduğu belirtilmelidir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Damlacıklar arasındaki çapraz konuşma testi. Uzun süreli ekim sırasında damlacıklar arasında çapraz konuşma olup olmadığını doğrulamak için, E. coli MG1655 çözeltisi çok düşük bir konsantrasyona seyreltildi (Poisson dağılımına göre, λ = 0.1) ve daha sonra 5 gün boyunca 200 damlacık üretildi ve yetiştirildi. OD'yi ölçtükten sonra, E. coli MG1655'in az sayıda damlacıkta büyüdüğü bulundu. Ve bu damlacıkların etrafındaki damlacıklarda neredeyse hiç bakteri büyümesi yoktu. Sonuç aynı zamanda damlacıklar arasında çok az çapraz konuşma olduğunu da göstermektedir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 1: MMC'de damlacık oluşumunun stabilitesi. Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi, damlacık sabit bir dalga formuna sahiptir. MMC'nin spektrometresi saniyede belirli sayıda veri noktası üretir, bu nedenle damlacık dalga formunun veri noktalarının sayısı damlacığın boyutunu yansıtabilir. MMC'de 397 damlacık oluşturmak için kırmızı boya çözeltisi kullanıldı ve OD değeri ölçüldü. Ham spektral veriler dışa aktarıldı, her damlacık dalga formunun veri noktaları sayıldı ve damlacık veri noktalarının varyasyon katsayısı (C.V) hesaplandı. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 2: MMC'de damlacık buharlaşması. Burada MMC'de damlacıklar oluşturmak için kırmızı boya çözeltisi kullanıldı ve damlacıklar yetiştirme tüpünde depolandı. Tüp daha sonra 30 gün boyunca 37 ° C sabit sıcaklık inkübatörüne yerleştirildi ve damlacık uzunluğu düzenli olarak ölçüldü (mikroskop altında fotoğraf çekin ve uzunluğu bir ölçek çubuğu ile ölçün). Damlacık hacminin 30 gün sonra yaklaşık% 12.3 oranında azaldığını gösterir, bu da damlacığın buharlaşmasının MMC'de çok küçük olduğunu gösterir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.