Zebrafish Gastrula'da İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Derin ve Mekansal Kontrollü Hacim Ablasyonları

Summary

Embriyonik gelişim, hücre hareketinin büyük ölçekli koordinasyonunu gerektirir. İki fotonlu ekscitasyon aracılı lazer ablasyon, büyük derin hücre gruplarının mekansal olarak kontrol edilen 3 boyutlu ablasyonunu sağlar. Ek olarak, bu teknik , in vivo olarak toplu olarak göç eden hücrelerin mekanik ortamlarındaki pertürbasyonlara reaksiyonlarını araştırabilir.

Abstract

Morfogenez, hücreleri dokulara ve organlara düzenlemek için birçok hücre hareketini içerir. Doğru gelişim için, tüm bu hareketlerin sıkı bir şekilde koordine edilmesi gerekir ve kanıtların birikmesi, bunun en azından kısmen mekanik etkileşimlerle başarılmasını göstermektedir. Bunu embriyoda test etmek doğrudan fiziksel pertürbasyon gerektirir. Lazer ablasyonlar, mekanik kısıtlamaların giderilmesine veya iki hücre popülasyonunun fiziksel olarak birbirinden izole edilmesine izin veren giderek daha fazla kullanılan bir seçenektir. Bununla birlikte, birçok ablasyon, sınırlı eksenel çözünürlük ve doku penetrasyonu sunan ultraviyole (UV) lazer ile gerçekleştirilir. Burada iki fotonlu mikroskop kullanarak derin, önemli ve mekansal olarak iyi tanımlanmış hacimleri alevlendirmek için bir yöntem açıklanmıştır. Ablasyonlar, eksenel mezendodermdeki yeşil floresan proteini ifade eden transgenik bir zebra balığı hattında gösterilir ve ektodermi veya alttaki yumurta sarısı hücresini etkilemeden eksenel mezendodermi kesmek için kullanılır. Hücre davranışı ablasyon öncesi ve sonrası canlı görüntüleme ile izlenir. Ablasyon protokolü farklı gelişim aşamalarında, herhangi bir hücre tipinde veya dokuda, birkaç mikrondan yüzden fazla mikrona kadar değişen ölçeklerde kullanılabilir.

Introduction

Hücre-hücre etkileşimleri gelişimde hayati roller oynar. Hücreler, doğrudan komşularının veya daha uzaktaki hücrelerin algılayabildiği sinyaller sağlar, böylece kaderlerini ve/ veya davranışlarını etkileri. Bu sinyallerin çoğu doğada kimyasaldır. Örneğin, iyi karakterize indüksiyon olaylarında, bir hücre grubu başka bir hücre popülasyonunun kaderini etkileyen difüzör moleküller ^üretir1. Bununla birlikte, diğer sinyaller mekaniktir; hücreler, komşuların algıladığı ve yanıt verdiği komşuları üzerinde kuvvetler ve kısıtlamalar ^uygular2.

Bu hücre-hücre etkileşimlerinin vivodaki önemini in....

Protocol

Tüm hayvan çalışmaları Etik Komitesi N 59 ve Ministère de l'Education Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche tarafından APAFIS#15859-2018051710341011v3 dosya numarası altında onaylanmıştır. Aşağıda açıklanan adımlardan bazıları ekipmanımıza ve yazılımımıza özgüdir, ancak farklı ekipmanlara kolayca uyarlanabilir.

1. Enjeksiyon hazırlığı

1. Embriyo Ortamı'nda (EM) %1 agarose çözeltisinin 75 mL'sini hazırlayın.
2. Enjekte kalıbını 90 mm Petri kabına yerleştirin ve kalıbın yüzmesi için yeterli olan yaklaşık 50 mL agarose dökün. Agarose katılaşmaya bırakın ve enjekte kalıbını çıkarın.
3. 30 mm Petri kabına....

Results

Polster'ı ortasında kesmek için, 4. Polster GFP ekspresyasyonu ile tanımlandı ve embriyo, polster düzleminin optik eksene dik olması için monte edildi (Şekil 1B). Embriyoyu bu pozisyondan uzağa yatırmak prosedürü zorlaştıracaktır. Işığın ablasyon düzlemlerine ulaşmak için daha fazla dokudan geçmesi gerekecek ve ablasyon düzlemleri embriyonik eksenlere göre eğilecek. Tüm hücre çekirdeklerinin doğru etiketlendiğini doğruladıktan sonra, ablasyondan önce hücre hareketlerini yakalamak iç.......

Discussion

Burada, derin ve mekansal olarak iyi tanımlanmış hacim ablasyonları gerçekleştirmek için doğrusal olmayan optikler kullanan bir protokol açıklıyoruz. Protokolün en kritik adımı, aşırı döküntü veya kavitasyondan kaçınmak için ablasyonlara izin vermek için yeterli enerji sağlayan, ancak çok fazla enerji vermeyen tedavi koşulları bulmaktır. Hedef sahadaki enerji miktarı esas olarak şunları bağlıdır: (1) lazer çıkış gücü, (2) lazer hizalama kalitesi, (3) ablasyon düzlemine ulaşmak için ışığın geçtiği dokunun doğası, (4) abla.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25x suya daldırma objektifi	Olympus	XLPLN25XWMP2
Agarose	PanReac AppliChem	A8963,0500
Veri analiz yazılımı : Matlab	Math Works
Elektro-optik modülatör (EOM)	ConOptics	350-80LA
Embriyo Ortamı (EM) çözümü			Westerfield, M. Zebra Balığı Kitabı. Zebra Balığının Laboratuvar Kullanımı İçin Bir Kılavuz (Danio rerio), 5. Baskı. Oregon Üniversitesi Yayınları, Eugene (Kitap). (2000).
Çevre odası odası	Okolab	H201-T-UNIT-BL
EOM sürücü	ConOptics	302RM
Floresan kaynağı	Lümen	SOLA
Cam alt tabaklar	MatTek	P35G-0-10-C
Cam kılcal damarlar	Harvard	Aparatı 300085	Dış çap 1.0 mm, iç çap 0.58  mm
Cam pipetler	Volac	D810	Uç ateşle parlatılmış olmalıdır
Yeşil/ablasyon lazeri	Spectra Physics	Mai Tai HP DeepSee
Histone2B-mCherry mRNA			pCS2-H2B-mCherry plazmidinden sentezlenir (Dumortier& al. 2012)
Görüntü analiz yazılımı: IMARIS	Bitplane
ImSpector yazılımı	Abberior Enstrüman Geliştirme Ekibi
Enjeksiyon kalıbı	Adapative Bilim Araçları	I-34
Mikro yükleyici uçları	Eppendorf	5242956003
Mikromanipülatör	Narishige	MN-151
Mikropipet çektirme	Sutter	P-1000
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkripsiyon Kiti	Invitrogen	AM1340
Penisilin-Streptomisin	Thermofisher	15140-122	ml başına 10 000 birim penisilin ve 10 mgstreptomisin
Fotoçoğaltıcı tüp (PMT)	Hammamatsu	H7422-40
PicoPump (Hava enjektörü)	Dünya Hassas Aleti	PV820
Kırmızı lazer	Spectra Fizik	OPO/Insight DeepSee
RNAenjeksiyon için ücretsiz su	Sigma	W3500
Elektronik Tablo yazılımı: Excel	Microsoft
Stereomikroskop	Nikon	SMZ18
Tg(gsc:GFP) zebra balığı hattı			Doitsidou, M. et al. Kemokin SDF-1 ile ilkel germ hücresi göçünün rehberliği. Hücre. 111 (5), 647– 59, doi: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002).
TriM Kapsam II mikroskobu	La Vision Biotech