Yöntem makalesi

İnositol Pirofosfatların Kapiler Elektroforez Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometrisi ile Mutlak Kantitasyonu

DOI:

10.3791/62847

⸱

13 Ağustos 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Organic Chemistry, University of Freiburg, 2Medical Research Council, Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli hücre ekstraktlarından inositol pirofosfatların mutlak kantitasyonu için kılcal elektroforez elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi için bir prosedür tanımlanmıştır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnositol pirofosfatlar (PP-InsP'ler) hücre içi sinyal moleküllerinin önemli bir grubudur. İnositol fosfatlardan (InsP) türetilen bu moleküller, miyo-inositol halkasında en az bir enerjik pirofosfat köstebeğinin varlığına sahiptir. Ökaryotlarda her yerde bulunurlar ve fosfat homeostazını, insülin duyarlılığını ve hücresel enerji yükünü araştıran metabolik haberciler olarak çalışırlar. Bu metabolitlerde bir kromofor bulunmaması, çok yüksek bir yük yoğunluğu ve düşük bolluk nedeniyle, analizleri radyoaktif izleyici gerektirir ve bu nedenle kıvrımlı ve pahalıdır. Burada, çalışma, kılcal elektroforez elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (CE-ESI-MS) ile memeli hücrelerinden inositol pirofosfatların mutlak ve yüksek verimli kantitasyonunu gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, memeli hücrelerinde biyolojik olarak ilgili tüm PP-InsPs türlerinin hassas profillemesini sağlayarak regioizomerlerin taban çizgisinde ayrılmasını sağlar. Minör izomerler de dahil olmak üzere PP-InsP'lerin mutlak hücresel konsantrasyonları ve HCT116 hücrelerindeki zamansal değişikliklerinin çeşitli deneysel koşullar altında izlenmesi sunulmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1993 yılında miyo-inositol pirofosfatların (PP-InsP) ilk keşfinden bu yana 1,2, biyosentezlerini, cirolarını ve fonksiyonlarını aydınlatmak için önemli ilerlemeler kaydedilmiştir3. İnositol pirofosfatlar ökaryotik hücrelerde her yerde görülür4 ve fosfat homeostazı5,6, insülin duyarlılığı 7, kalsiyum salınımları 8,9, veziküler kaçakçılık 10, apoptoz 11, DNA onarımı 12, immün sinyalizasyon 13 gibi kritik öneme sahip metabolik sinyal molekülleri olarak işlev görür. ve diğerleri. İnositol pirofosfatların kontrolü altındaki önemli süreçlerin bolluğu, hücresel bolluklarının, dalgalanmalarının ve lokalizasyonlarının daha derin bir şekilde anlaşılmasını gerektirir.

Her ne kadar InsPs ve PP-InsP'ler disiplinler arasında dikkat çekse de, bolluklarının analizi, 80'lerde geliştirilen ve tritiated inositol ile hücrelerin etiketlenmesinden oluşan, ekstrakte edilen PP-InsP'leri güçlü anyon değişim kromatografisi Sax-HPLC ile çözen bir yöntem kullanılarak rutin olarak gerçekleştirilir. Kütle spektrometresine dayanan yeni yöntemler hala önemli zorluklarla karşı karşıyadır: sekiz fosfat ünitesine kadar olan inositol pirofosfatlar, fosfat esterleri ve anhidritleri barındırır ve iyonizasyon sırasında önemli bir negatif yüke ve potansiyel fosfat kaybına yol açar. Memelilerde bulunan dört ana PP-InsP türü vardır (Şekil 1): 1,5-(PP)2-InsP 4 (veya 1,5-InsP8), 5-PP-InsP 5 (veya 5-InsP 7), 1-PP-InsP 5 (veya 1-InsP7) ve 5-PP-Ins (1,3,4,6)P 4 (veya 5-PP-InsP 4)3,14. PP-InsP'lerin fizyolojik seviyeleri tipik olarak nano--düşük-mikromolar aralıktadır, 5-PP-InsP 5, 0.5 - 5 μM'lik hücresel konsantrasyonlarla en bol olanıdır. 1,5-(PP)2-InsP 4 ve 1-PP-InsP 5'in,5-PP-InsP 5 havuzunun yaklaşık% 10'una kadar olduğuna inanılmaktadır ve birçok hücrede izlenmesi zor kalmaktadır15. Serbest bir OH grubuna sahip 5-PP-InsP4, bolca daha da düşüktür ve genellikle fosfat hidrolazları sodyum florür (NaF) 16 ile inhibe edildiğinde tespit edilebilir hale gelir.

PP-InsP'lerin yüksek yük yoğunluğu, ayrılmalarını zorlaştırır ve PP-InsP regioizomerlerinin oluşumu bu çabaları daha da zorlaştırır. Sonuç olarak, çoğu deney, [3H]-inositol kullanılarak hücrelerin metabolik radyoaktif etiketlenmesiyle kantitasyona dayanıyordu, çünkü matristen arka plan hariç tutuldu ve yüksek duyarlılık elde edildi17,18. Bununla birlikte, bu yöntem maliyetlidir, zaman alıcıdır ve ilgili PP-InsP regioizomerlerinin doğru bir şekilde ayırt edilmesine izin vermez. Ayrıca, [3H]-inositol etiketlemesi, glikozdan endojen inositol sentezini hesaba katmaz. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) tabanlı bir yöntem, yaygın olarak uygulanan ucuz bir alternatiftir, ancak duyarlılığı 19,20,21,22 ile sınırlıdır. İyon kromatografisi ve ardından kolon sonrası türevlendirme UV-tespiti23, hidrofilik etkileşim kromatografisi (HILIC)24 veya kütle spektrometrisi (MS) 25 ile birlikte zayıf anyon değişimi (WAX) dahil olmak üzere radyoetiketlemeyi önleyen diğer yaklaşımlar yayınlanmıştır. Bununla birlikte, klasik [3H]-inositol SAX-HPLC protokolü ile (henüz) eşit değildirler.

Son zamanlarda, kılcal elektroforez elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (CE-ESI-MS),yukarıda tartışılan tüm gereksinimleri karşılayan InsPs ve PP-InsPs metabolizmasının analizi için dönüştürücü bir strateji olarak tanıtıldı. Perklorik asit ile mevcut son teknoloji ürünü InsP ekstraksiyonu ve ardından titanyum dioksit boncukları26 ile zenginleştirme ile birleştirilen CE-ESI-MS, mayadan bitkilere ve memelilere kadar şimdiye kadar test edilen her organizmada başarılı oldu. Tüm olası regioizomerler de dahil olmak üzere InsPs ve PP-InsP'lerin eşzamanlı profillemesi kolayca sağlandı. Kararlı izotop etiketli (SIL) iç standartlar, matris etkilerinden bağımsız olarak hızlı ve hassas bir mutlak niceleme sağladı. MS izotopik kütle farklılıklarını yakalayabildiğinden, CE-ESI-MS, InsPs ve PP-InsP'lerin bölümlere ayrılmış hücresel sentez yollarını incelemek için de uygulanabilir, örneğin hücreleri [13 C 6]-miyo-inositol veya [13C6]-D-glikoz ile besleyerek.

Burada açıklanan, PP-InsPs ve InsP'lerin memeli hücrelerinden CE-ESI-MS tarafından mutlak kantitasyonu için ayrıntılı bir adım adım protokoldür. Majör 5-PP-InsP 5 izomerinin yanı sıra, 1,5-(PP)2-InsP 4 ve 1-PP-InsP5 de düşük bolluklarına rağmen bu çalışmada nicelleştirilmiştir. Farklı laboratuvarlardan (NIH, UCL) iki HCT116 hücre hattı incelenmiştir ve HCT116UCL hücrelerinin HCT116NIH'de bulunandan 7 kat daha yüksek seviyelerde 1,5-(PP)2-InsP 4 içerdiği, 5-PP-InsP5 konsantrasyonlarının karşılaştırılabilir olduğu doğrulanmıştır. Ek olarak, HCT116 UCL'de 1-PP-InsP5 sentezi önemli ölçüde artmamıştır. Ayrıca, sodyum florür kullanarak defosforilasyonlarını bloke ederek PP-InsP seviyelerinin arttırılması kantitatif olarak incelenmiştir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. CE-ESI-MS sisteminin kurulması

  1. Ticari bir CE sisteminden ve bir Agilent Jet Stream (AJS) elektrosprey iyonizasyon (ESI) kaynağı ile donatılmış üçlü bir dörtlü dörtlü tandem kütle spektrometresinden oluşan bir CE-ESI-MS sistemi kurun. Bir CE-ESI-MS dua kiti ve bir izokratik LC (Sıvı Kromatografisi) pompası gereklidir.
  2. Kılıf akış 1:100 ayırıcıyı (CE-MS püskürtme kitine dahildir) ve izokratik LC pompa çıkışını bağlayın.
  3. CE sistemi giriş şişesinin, kütle analizörünün püskürtücü ucu ile aynı yükseklikte olduğundan emin olun.
  4. Tüm sistemi kontrol etmek ve veri toplama ve analiz için MassHunter İş İstasyonu'nu (Sürüm 10.1) veya benzer MS yazılımını kullanın.

2. Tampon, kılcal damar ve CE-MS sisteminin hazırlanması

  1. CE çalışma tamponunu hazırlayın: 40 mM amonyum asetatın pH'ını amonyum hidroksit ile 9.0'a ayarlayın. 250 mL hacimsel şişe önerilir. 250 mL'lik tamponu 0,2 μm gözenek boyutunda membran filtrelerle filtreleyin. Sadece ultra saf deiyonize su ve MS sınıfı reaktifler kullandığınızdan emin olun.
    NOT: Bu tampon oda sıcaklığında 2-3 hafta veya buzdolabında birkaç ay saklanabilir.
  2. Kılıf sıvısı hazırlayın: 250 mL'lik bir şişede 100 mL ultra saf su ve 100 mL LC-MS sınıfı izopropanolü karıştırın. Kılıf sıvısını haftada en az bir kez değiştirin. Yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresi kullanırken kılıf sıvısına kütle referansı ekleyin.
  3. Kılıf sıvısı takın: 5 dakika boyunca 5 mL / dak'da temizleyin ve akış hızını 1 mL / dak'ya ayarlayın (CE-MS püskürtücüsüne 10 μL / dak). Pompa basıncı yaklaşık 180 bar olacaktır. Geri dönüşüm borusunun, çözücüyü yeniden kullanmak için kılıf sıvı şişesine tekrar bağlandığından emin olun.
  4. Kılcal damar hazırlayın: UV algılama pencereli bir CE-MS kılcal damar (50 μm i.d. ve 125 cm uzunluğunda 365 μM o.d.) satın alın. Kullanıcı ayrıca uzman distribütörlerden çok daha ucuz çubukla kaynaşmış silika kılcal damarlar elde edebilir. 100 cm uzunluğunda bir kılcal damar kesin. Her iki kılcal ucu da döner elmas bıçaklı kılcal bir sütun kesici ile düzgün bir şekilde kesin ve her iki uçtaki 2-3 cm poliimid kaplamayı bir çakmakla çıkarın. Kılcal yüzeyi izopropanol ile temizleyin.
  5. Kılcal damarı takın: Kılcal damarı CE-MS kasetiyle eşleştirin. Kaseti Değiştir düğmesine tıklayın ve kaseti CE cihazına takın. Kılcal damarın giriş ucu elektrottan yaklaşık 2 mm daha düşüktür. Enjeksiyon işlemi sırasında giriş ucunun numunenin yüzeyinden daha düşük olduğundan emin olun.
  6. Kılcal damarı etkinleştirin: İlk kullanımdan önce, kılcal damarı 1 M NaOH, ardından 10 dakika su ve 15 dakika boyunca CE çalışma tamponu ile yıkayın.
  7. Kılcal ucu CE-MS püskürtücüye yerleştirin: Kılcal damarı yavaşça CE-MS püskürtücüye yerleştirin ve kılcal ucun püskürtücü ucundan yaklaşık 0,1 mm dışarı çıkıntı yapmasını sağlayın. Kılcal çıkış ucunun bir büyüteç ve püskürtücüdeki ayar vidası ile hassas bir şekilde ayarlandığından emin olun. Püskürtücüyü tekrar iyon kaynağına takın ve ayar vidasına dokunmaktan kaçının. MS, bu işlemi gerçekleştirirken Bekleme modundadır.
  8. ESI spreyini kontrol et: Tam tarama modunda ESI püskürtücünün stabilitesini kontrol edin. Toplam iyon elektroferogramlarının dalgalanması% 5 içinde olmalıdır.
  9. InsP standartlarıyla bir test çalışması gerçekleştirin: 10 s (10 nL) için 50 mbar'da bir enjeksiyonla test çalışmaları için 2 μM InsP 3-InsP8 standartlarının (nicel31 P NMR 15,27 ile ayarlanmış) bir karışımını kullanın. Ayrıntılı ESI ve MS parametrelerini Tablo 1'de gösterildiği gibi ayarlayın. CE akımı yaklaşık 26 μA'dır. Tepe genişliği yaklaşık 0.4-0.5 dakikadır. Sinyal-gürültü oranının en az 400'e ulaştığından emin olun.

3. Çözünür inositol fosfatların memeli hücrelerinden ekstraksiyonu

NOT: HCT116NIH hücreleri, Stephen Shears28'in nazik bir armağanıydı. HCT116UCL hücreleri Saiardi'nin Laboratuvarı26'dandı.

  1. Tohumlama hücreleri
    1. Kültür HCT116NIH veya HCT116UCL hücreleri, T75 şişelerinde% 5 yüksek nemli CO2 atmosferinde (ayrıca standart koşullar olarak adlandırılır)% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş modifiye kartal ortamında (DMEM).
    2. HCT116NIH ve HCT116 UCL stok kültürlerini fosfat tamponlu salin (PBS) (5 mL) ile yıkayın ve hücreleri tamamen ayrılana kadar standart koşullar altında tripsin-etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) (3mL , % 0.25) ile inkübe edin. Tripsin aktivitesini orta (7 mL) ekleyerek söndürün, hücreleri bir santrifüj tüpüne toplayın ve santrifüj yapın (200 x g, 3 dakika).
    3. Süpernatantı çıkarın ve hücreleri orta (10 mL) olarak yeniden askıya alın. Hücreleri sayın ve tripan mavisi dışlama yoluyla canlılığı belirleyin.
    4. Hücreleri (tahlil başına 6 milyon HCT116 hücre) 150 mm'lik bir kaba tohumlayın ve toplamda 20 mL hücre kültürü ortamını ayarlayın. Çanaktaki hücrelerin eşit dağılımını elde etmek için tohumlamadan önce ortamı ve hücreleri bir santrifüj tüpünde önceden karıştırın. Hücre numarasına göre normalleştirme gerektiğinde paralel bir çanak hazırlayın.
    5. Hücreleri 72 saat boyunca standart koşullar altında kültürleyin. Hücreler yaklaşık% 80 -% 90 birleşmeye ulaşacaktır.
  2. NaF ve hücre hasadı ile inositol fosfat seviyelerinin modülasyonu
    1. NaF muamelesi: Ortama hasattan 1 saat önce NaF (10 mM) ekleyin. Plakayı/pipetlemeyi döndürerek ortamı karıştırın ve standart koşullar altında hücreleri 60 dakika boyunca inkübe edin.
    2. NaF tedavisinden sonra, ortamı hücrelerden çıkarın ve hücreleri buzun üzerine yerleştirin.
    3. Hücreleri PBS (5 mL, 4 °C) ile iki kez yıkayın ve PBS'yi tabaktan tamamen çıkarın.
    4. Perklorik asit (PA) ekleyin (1 mL, 1 M, 4 °C). Tüm yüzeyi PA ile kapladığınızdan emin olun (proteinler çökeldikçe hücreler beyaza dönecektir). Hücreleri 4 ° C'de bir eğim masasında 10 dakika boyunca inkübe edin.
    5. PA'yı bir santrifüj tüpüne toplayın ve kirletici kalıntıları santrifüjleme yoluyla temizleyin (17.000 x g, 5 dakika, 4 ° C). InsP'lerin çekilmesi için hazırlanan TiO2 boncuklarına süpernatant ekleyin.
    6. Ekstraksiyon sonrası kabı deasitifikasyon için PBS (5 mL, r.t.) ile iki kez yıkayın; PBS'yi çanaktan tamamen çıkarın.
    7. Hücre lizis tamponu ilavesiyle plaka üzerindeki proteinleri çözündürün (1.5 mL, r.t.; 0.1 M NaOH'de% 0.1 sodyum dodesil sülfat [SDS]). Çanağı r.t.'deki bir eğimli masada 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Hücre lizatını bir santrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın (17.000 x g, 5 dakika, 4 °C). Kalibrasyon standardı olarak sığır serum albümini kullanarak DC protein testi ile protein konsantrasyonu belirlenene kadar süpernatantı -80 ° C'de saklayın (genellikle, 150 mm'lik bir çanak yaklaşık 10 mg protein içerir).
    8. Paralel bulaşıklardan hücre sayılarının belirlenmesi: Adım 3.1.2'de açıklandığı gibi tripsin yoluyla paralel çanağın hücrelerini toplayın (150 mm'lik çanak için 5 mL tripsin-EDTA kullanın) ve ortamı çıkarın. Hücre peletini PBS'de (5 mL) yeniden askıya alın, düzgün bir şekilde karıştırın ve hücreleri sayın. Temsili hücre sayımları elde etmek için hasattan hemen önce doğrudan söndürme yoluyla bu adımı gerçekleştirin. Ek olarak, hücrelerin hacmini uygun bir yöntemle (örneğin, bir multisizer makinesiyle) ölçün.
  3. TiO2 inositol fosfatların zenginleştirilmesi
    NOT: Fosforile bileşiklerin asidik ayrışmasını önlemek için, buz üzerinde elüsyona kadar tüm zenginleştirme adımlarını uygulayın ve tüm reaktifleri 4 ° C'ye soğutun. Ekstraksiyon süresini minimumda tutun (1.5-2 saat). Tüm ekstraksiyon adımlarını 1 M PA ile gerçekleştirin.
    1. Boncukların hazırlanması: TiO 2 boncukları (numune başına 5 mg) ddH2 O (1 mL) ve santrifüj (3.500 x g, 1 dakika, 4 °C) ile yıkayın. ddH2O'yu çıkarın ve boncukları PA (1 mL) ile yıkayın. PA'yı santrifüjleme ile çıkarın (3.500 x g, 1 dakika, 4 °C). Boncukları PA cinsinden yeniden askıya alın (numune başına 50 μL).
    2. Fosforile bileşikler içeren süpernatantı (bölüm 3.2, adım 3.2.5'i karşılaştırın) boncuk süspansiyonuna, girdaba ekleyin ve ardından numuneyi 4 ° C'de 20 dakika döndürün.
    3. Numuneyi santrifüj edin (3.500 x g, 1 dakika, 4 °C) ve süpernatanı atın. Boncukları PA (500 μL) ve santrifüj (3.500 x g, 1 dakika, 4 °C) ile yıkayın. Süpernatantı atın ve yıkama adımını tekrarlayın.
    4. Boncuklara NH4OH (200 μL, %3) ekleyin ve tekrar askıya alın. Numuneyi r.t.'de 5 dakika döndürün.
    5. Numuneyi santrifüj edin (3.500 x g, 1 dakika) ve süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
    6. Elüsyon adımları 3.3.4 ve 3.3.5'i tekrarlayın ve elüentleri birleştirin. Boncukları atın.
    7. Çözünmeyen kalıntıları gidermek için kombine elüentleri (17.000 x g, 1 dakika, 4 °C) santrifüj yapın.
    8. Süpernatantı vakum buharlaşması altında tamamen kurutun (70 dk, 60 °C, V-AQ). InsPs içeren kurutulmuş ekstraktlara ddH2O (50 μL) ekleyin. Tamamen çözünene kadar numuneyi karıştırmak için vorteks. CE-ESI-MS analizine kadar numuneyi -20 °C'de saklayın.

4. CE-ESI-MS çalıştırmalarını gerçekleştirme

  1. 40 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 80 μM [13 C 6]5-PP-InsP5, 80 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 400 μM [13 C 6]InsP 6 ve 400 μM [13 C6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 içeren dahili standartların bir karışımını hazırlayın. SIL IS çözeltilerinin konsantrasyonlarını, sertifikalı bir referans standardı, yani fosfoasetik asit yardımıyla kantitatif 31P ve 1H NMR ile belirleyin.
    NOT: %96'dan daha yüksek saflıklara sahip yukarıdaki tüm SIL iç standartları (IS) sentezlenmiş ve Fiedler grubu15,27 tarafından sağlanmıştır. Nükleotidlerde olduğu gibi, bu IS birçok kristal su molekülü ve çeşitli karşı iyonlar taşıyabilir. Maddenin tartılması ve konsantrasyonun hesaplanması yerine, kantitatif 31P NMR ile 13C6 standart çözeltilerin konsantrasyon tayini önerilir.
  2. Bir CE numune şişesinde numunenin 10 μL'sini 0,5 μL dahili standart karışımı ile karıştırın. 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4, 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5, 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP 5, 20 μM [13 C 6]InsP 6 ve 20 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5, numunelerin içindeki son konsantrasyonlardır.
  3. Yenileme sistemini kullanırken, Şişeyi Değiştir düğmesine tıklayın, hazırlanan 250 mL CE çalışma tamponunu elektrolit şişesine koyun ve Tüpleri Temizle'ye tıklayın. İkmal iğnesini bir su şişesinde tutun.
  4. ESI ve MS parametrelerini Tablo 1'de gösterildiği gibi ayarlayın. İnositol polifosfat standartlarının bir karışımına sahip bir Kaynak İyileştirici kullanarak kaynak parametrelerini optimize edin. Tüm standartlarda Masshunter Optimizer'ı kullanarak çoklu reaksiyon izleme (MRM) ayarlarını edinin. Farklı araçlar için ESI ve MS/MS ayarlarını yapın.
  5. InsP özetleri için bir çalıştırma gerçekleştirin ve sonucu kontrol edin (Şekil 2). Daha fazla örnek olduğunda bir sıra ayarlayın.
  6. Ölçümlerden sonra MS'in Bekleme modunda olmasına izin verin. LC pompayı kapatmayın. Kılıf sıvısının akışı, püskürtücü iğnesini korur. Kılıf sıvı beslemesi olmadığında CE-ESI-MS Püskürtücüyü bir LC-ESI-MS Püskürtücü ile değiştirin.

5. Veri analizi

  1. Kantitatif Analiz (QQQ için) yazılımını açın, tüm numuneler için bir toplu iş oluşturun.
  2. Alınan MRM verilerinden yeni bir yöntem oluşturun. [13C6]InsP'yi dahili standartlar - (ISTD) olarak ayarlayın. MRM bileşik kurulumunu, bekletme süresi ayarını, ISTD kurulumunu, konsantrasyon kurulumunu ve niteleyici kurulumunu kontrol edin. Yöntemi geçerli toplu işleme uygulamak için doğrulamayı geçin ve çıkın. Yöntemi kaydedin.
  3. Toplu işlemdeki her tepe noktasının düzgün bir şekilde entegre edilip edilmediğini kontrol edin; aksi takdirde, tepe noktasını manuel olarak entegre edin.
  4. Sonuçları bir e-tabloya aktarın. Analit tepe tepkisini, bilinen konsantrasyonlara sahip SIL IS'nin ilgili tepe yanıtı ile karşılaştırarak inositol (piro) fosfatların kantitatasyonunu gerçekleştirin. Teorik ve deneysel kalibrasyon eğrileri, doğrusal aralıklı 5-PP-InsP 5, InsP 6 ve Ins(1,3,4,5,6)P5 için Tablo 2'de gösterilmiştir.
    NOT: Teorik kalibrasyon eğrisini uygulayan ön koşul, hedeflenen analitlerin yüksek kaliteli izotopik paterninin ve güvenilir konsantrasyonun kullanılmasıdır. Doğrusal aralığı değerlendirin. Yukarıda belirtilen izotopik standartların tam olarak elde edilmesi pratik olmadığında mutlak nicelik için bir kalibrasyon eğrisi gereklidir.
  5. InsP ekstrakt çözeltisinde ölçülen konsantrasyon ve hacmi ile mutlak miktarları hesaplayın. Ayrıca, miktarı hücre sayımlarına veya protein içeriğine göre normalleştirin. Hücre sayılarına ve HCT116'nın (1.68 fL) ortalama hücre hacmine göre hücresel konsantrasyonu hesaplayın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada gösterilen sonuçlar CE-ESI-MS analizinin potansiyelini göstermeyi amaçlamaktadır. Bildirilen rakamlar, teknik olarak kusursuz bir CE-ESI-MS çalışmasının tanımlayıcısıdır. İlk olarak, inositol pirofosfat standartlarının (Şekil 1) ve bir memeli hücre ekstraktının (Şekil 2) bir karışımı sunulmaktadır. İkinci olarak, iki HCT116 hücre çizgisinin (Şekil 3) ve NaF ile tedavi edilen HCT116 (Şekil 4) hücrelerinin karşılaştırılması sağlanmıştır.

2 μM konsantrasyonda inositol (piro)fosfat standartlarının ekstrakte edilmiş iyon elektroferogramları (EIE'ler) Şekil 1'de gösterilmiştir. Memelilerde inositol pirofosfatların basitleştirilmiş yapıları ile metabolizması eklenir. Memelilerdeki dört inositol pirofosfat, 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5, 1-PP-InsP 5 ve5-PP-Ins(1,3,4,6)P4, tarif edilen yöntem kullanılarak iyi ayırt edilir. HCT116 UCL'nin bir CE-ESI-MS çalışması Şekil 2'de gösterilmiştir. Kararlı izotop etiketli (SIL) iç standartların yardımıyla, sinyal tepkisini bilinen konsantrasyondaki çivili SIL ile karşılaştırarak mutlak bir nicelik kolayca elde edilebilir. InsP5'ten (PP)2-InsP 4'e kadar inositol fosfatın entegre EIE'leri ve izotopik modellerinin entegre edilmemiş EIE'leri görüntülenir. Altı teknik tekrardan elde edilen tüm analitlerin RSD'leri% 4 içindedir. Ölçülen konsantrasyon ve ekstraktların hacmi ile analitlerin miktarı hesaplanabilir. Hücre sayıları ve hücre hacmi veya protein içeriği ile, mutlak hücresel konsantrasyon (μM) veya protein içeriği (pmol / mg protein) tarafından normalleştirilen miktar genellikle böyle bir analizin nihai sonuçlarıdır.

Daha önceki bir çalışmaya göre, iki grup farklılaşmış HCT116 hücresi InsP 8 seviyelerinin bir varyasyonuna sahiptir, HCT116UCL hücreleri, HCT116NIH hücrelerinden 6 kat daha yüksek InsP8 seviyeleri içerir29. CE-MS yöntemiyle, HCT116NIH'deki 1,5-(PP)2-InsP 4 kolayca ölçülebilir (Şekil 3) ve HCT116UCL hücreleri, HCT116NIH'den 7 kat daha yüksek InsP8 seviyeleri içerir. Ek olarak, HCT116UCL hücrelerinde 1,5-(PP)2-InsP 4'ün önemli ölçüde birikmesi, şimdi Şekil 3'te nicel olarak gösterilen, önemli ölçüde artmış bir 1-PP-InsP5 ile paraleldir.

PP-InsPs seviyeleri, sodyum florür kullanarak defosforilasyonlarını inhibe ederek artar. NaF ile tedavi edilen HCT116NIH hücrelerinin CE-ESI-MS analizi, -5-PP-InsP 5 yüksekliğini, InsP 6'da bir azalma ve 5-PP-Ins (1,3,4,6) P4 görünümünü gösterdi (Şekil 4). Ayrıca, InsP8 seviyelerinin yükselmesi fark edilirken, 1-PP-InsP5 bir dereceye kadar azalır. 1-PP-InsP5, NaF ile muamele edilmiş HCT116NIH'de tamamen bulunmaz, ancak çoğunlukla tespit veya kantitasyon sınırının altındadır.

figure-results-1
Şekil 1: Tanımlanan protokol kullanılarak CE-ESI-MS analizinde inositol (piro)fosfat standartlarının tipik ekstrakte edilmiş iyon elektroferogramları (EIE'ler). Her analitin konsantrasyonu 2 μM'dir. Enjekte edilen numune hacmi, 10 s için 50 mbar'da bir enjeksiyonla yaklaşık 10 nL'dir. Ekler memelilerde inositol pirofosfatların metabolizmasını gösterir. IPPK: inositol pentakisfosfat 2-kinaz, IP6K: inositol hekzakifosfat kinaz, PPIP5K: difosfoinositol pentakisfosfat kinaz, DIPP1: difosfoinositolpolifosfat fosfohidrolaz 1. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: HCT116UCL hücrelerinin temsili InsP profili. (A) HCT116 NIH'deki ana inositol (piro)fosfatların EIE'leri ve çivili SIL IS'ler 2 μM [13 C 6]1,5-(PP)2-InsP 4 (1), 4 μM [13 C 6]5-PP-InsP 5 (2), 4 μM [13 C 6]1-PP-InsP5 (3), 20 μM [13C 6]InsP 6 (4), ve 20 μM [13C 6]Ins(1,3,4,5,6)P 5 (5). Ekler, CE-ESI-MS tarafından InsP analizinin altı teknik tekrarını gösterir, veriler SD ± araçlar olarak sunulur. (B) İnsan hücre hatlarında PP-InsPs ve InsP'lerin hücresel konsantrasyonu HCT116UCL ve (C) PP-InsPs ve InsPs miktarı protein içeriği ile normalleştirilmiştir. Veriler, SEM'i üç bağımsız deneyden ± anlamına gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: İki farklı HCT116 hücresi arasındaki InsP 8 düzeylerindeki varyasyon. (A) HCT116 UCL ve HCT116 NIH'deki inositol pirofosfatın EIE'leri. HCT116 UCL'deki InsP8, HCT116NIH'den belirgin şekilde daha fazladır. (B) Her iki HCT116 hücresinde inositol pirofosfatın InsP6'ya oranı (%). HCT116UCL hücreleri, HCT116NIH'ye kıyasla 7 kat daha yüksek InsP8 seviyeleri içerirken, 5-PP-InsP5 seviyeleri eşittir. Veriler, SEM'i üç bağımsız deneyden ± anlamına gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: NaF tedavisi ile HCT116NIH hücrelerinde inositol (piro)fosfat seviyeleri. (A) HCT116NIH'de sodyum florür muamelesi ile inositol (piro)fosfat EIE'leri (NaF, 10 mM). 1,5-(PP)2-InsP 4, 5-PP-InsP 5 ve 5-PP-Ins(1,3,4,6)P4 dahil inositol pirofosfat seviyeleri, NaF kullanarak defosforilasyonlarını bloke ederek artar. (B) Tedavi edilmemiş ve NaF ile muamele edilmiş HCT116NIH hücrelerinde inositol (piro) fosfat seviyeleri (miktarlar protein içeriği ile normalleştirilir). Veriler, SEM'i üç bağımsız deneyden ± anlamına gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: CE-ESI-MS parametre ayarları. Kaynak parametresi ve iFunnel parametreleri, Source ve iFunnel Optimizer tarafından optimize edilir. İnositol (piro) fosfatlar için MSM parametre ayarları MassHunter Optimizer tarafından optimize edilmiştir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: Teorik ve deneysel regresyon denklemi. [13C 6]5-PP-InsP 5 [13 C 6]InsP 6 ve [13C 6]Ins (1, 3, 4, 5, 6)P5 konsantrasyonu sırasıyla 4 μM, 20 μM ve 20 μM'dir. Regresyon denklemi için, 5-PP-InsP 5 konsantrasyonu 0.04 μM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.4 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 8 μM, 16 μM, 24 μM. InsP 6 ve Ins (1, 3, 4, 5,6)P 5 konsantrasyonu 0.2 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM,5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 120 μM. x konsantrasyondur, y (Alan InsP) 12C / (Alan InsP) 13C'dir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan, memeli hücrelerinde yüksek yüklü inositol pirofosfatların kantitasyonu için pratik ve hassas bir yöntemdir. Bu analiz yaklaşımını perklorik asit ile mevcut son teknoloji ürünü InsP ekstraksiyonu ve ardından TiO2 ile zenginleştirme ile birleştiren CE-ESI-MS analizi, benzeri görülmemiş avantajlara sahiptir. Verimi, hassasiyeti, kararlılığı, mutlak kantitasyonu, izomer tanımlaması ve matris bağımlılığı açısından bu yöntem diğer yaklaşımlara kıyasla öne çıkmaktadır. Bu protokol memeli hücrelerine uygulanabilir, ancak aslında bu strateji birçok farklı örnekte (örneğin, maya, bitkiler, parazitler, fare dokuları, vb.)

Uygulanan ekstraksiyon protokolü, PP-InsPs ve InsP6'yı memeli hücre ekstraktlarından 16,19'dan tamamen kurtarır. Ayrıca, diğer birçok anyonik metaboliti, özellikle fosfat içeren türleri, örneğin şeker fosfatlarını ve nükleotidleri çıkaracaktır. Bu protokol ile kullanıcının analitleri için geri kazanım ve ayrışmanın değerlendirilmesi gerekli olacaktır.

Genel olarak, CE-ESI-MS sistemi sorunsuz çalışır ve bu protokolü kullanarak her hafta yaklaşık 200 numuneyi barındırabilir. Bununla birlikte, HPLC'den farklı olarak, CE, uzun süredir uzmanlar ve uzman kişiler için bir yöntem olarak kabul edilmiş, bu da pazarını kısıtlamış ve uygulamasını sınırlandırmıştır. Bu nedenle, bir CE-ESI-MS cihazı genellikle analitik fakültelerde yoktur. CE-ESI-MS analizi yapmak isteyen kişiler muhtemelen CE deneyiminden yoksundur ve sorun giderme için daha fazla zaman harcayacaktır. Burada kritik adımlar vurgulanmaktadır. İlk ve en önemlisi kılcal kesimin kalitesidir. ESI spreyin hassasiyeti ve stabilitesi çoğunlukla birinci sınıf kılcal kesime dayanır. İkincisi, kılcal çıkış ucu, püskürtücü ucundan tam olarak 0,1 mm uzakta olmalıdır. Püskürtücü iğne ve CE kılcal damar eksenel yönde olmalıdır. ESI spreyinin kalitesi kantitasyon için kritik öneme sahiptir; tekrarlanabilirliği değerlendirmek için teknik çalışmalar yapılmalıdır.

Açıklanan protokolle, PP-InsPs için kantitasyon sınırı (LOQ), 10 s (10 nL) için 50 mbar'da bir enjeksiyonla 40 nM'dir. Yöntem duyarlılığını daha da artırmak için çeşitli yaklaşımlar vardır. İlk olarak, 20 s (40 nL) için 100 mbar'da bir enjeksiyon, 5-PP-InsP 5 ve 1-PP-InsP5 regioizomerleri için hala iyi bir tepe şekli ve yeterli çözünürlük ile sonuçlanacaktır. İkincisi, InsP ekstraktları daha az miktarda su içinde çözülebilir. Üçüncüsü, kantitasyon için daha az MRM geçişi kullanıldığında bekleme süresi arttırılabilir. Ek olarak, ultra düşük kılıflı sıvı akışı kullanan bir CE-MS iyon kaynağı, hassasiyeti önemli ölçüde artıracaktır.

pH 9'lu CE çalışma tamponu, InsP6-InsP 8 arasında en iyi çözünürlüğü sağlar. PH'ı 9.7'ye yükseltirken, InsP3-InsP 6 arasındaki çözünürlük önemli ölçüde artacaktır. Mükemmel çözünürlük nedeniyle, verimi daha da artırmak için 72 cm'lik daha kısa bir kılcal uzunluk önerilir. Ayrıca, 40 °C'de daha yüksek bir CE kaset sıcaklığı, sulu elektroforetik tamponun viskozitesini azaltır ve EOF altındaki hareketlerini hızlandırır. Farklı araştırma taleplerine göre, bu yöntemin modifikasyonları InsPs ve PP-InsPs analizini daha da kolaylaştırabilir. Bu nedenle, tarif edilen CE-ESI-MS protokolleri, bu çok yönlü sinyal molekülleri ailesine yeni araştırma yolları açma potansiyeline sahiptir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu proje, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı (HJJ'ye 864246 no'lu hibe sözleşmesi) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi'nden (ERC) finansman almıştır. DQ, Brigitte-Schlieben-Lange-Programm'ın finansal desteğini kabul eder. AS, MRC program hibesi MR / T028904 / 1 tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Materials
1.5 mL mikrosantrifüj tüpleriGreiner Bio-One616201-15
cm doku kültürü kaplarıThermo Fisher
168381-2.0 mL mikrosantrifüj tüpleriGreiner Bio-One623201-50
mL santrifüj tüpleriGreiner Bio-One
DC protein tahlili için227261-96 kuyulu plakalarThermo Fisher260836
CE kaynaşmış silika kılcalCS Kromatografya10518050 & M kimlik 360 ve mikro; Öğr.
Pipet uçlarıStarlabI1054-0001, S1111-6701, S1113-1700, S1111-370010 mL, 1000 ve mikro; L, 200 ve mikro; L, 10 ve mikro; L pipet uçları
Serolojik pipetlerTPP94550, 94525, 94010, 9400550 mL, 25, mL, 10 mL, 5 mL serolojik pipetler
T75 şişeleriTPP90076-
Kimyasallar ve Reaktifler
NaOHAppliChemA6829,0500moleküler biyoloji için sodyum hidroksit peletleri, hücre hazırlanması için lizis tamponu
% 0.25 tripsin-EDTAGibco
25200056-Amonyum asetatThermo Fisher1677373HPLC sınıfı
BSAThermo Fisher23209albümin standardı (2.0 mg / mL) standart eğri hazırlama için
DC protein tahliliBiorad5000116DC protein tahlili reaktifleri paketi
DMEMGibco41966029yüksek glikoz, piruvat
FBSGibco10270106, 10500064 (ısı etkisizleştirilmiş)10270106 HCT116 < sup>UCL< / sup> için 10500064 < > < / sup>
İzopropanolCarl RothAE73.2%99,95 LC-MS sınıfı
NH4OH, %10Carl Roth6756.13 NH4OH
PBS hazırlanması içinGibco10010015-Perklorik
asit, 1 M perklorik asit hazırlanması için %70Carl Roth9216.1
SDSSERVA20760.02hücre lizis tamponunun hazırlanması için
Sodyum florürSigma AldrichS7920-TiO
2 boncuklarGL Sciences5020-750005 &mikro; m partikül boyutu
Tripan mavisi çözeltisiGibco15250061tripan mavisi lekesi (%0,4)
Ultra saf (Tip 1) suMilli-QZRQSVP3WWmodeli: Direct-Q 3 UV Su Arıtma Sistemi
Ekipman
Analitik teraziMettler Toledo30105893modeli: XPE26; boncukların tartılması için ( Örnek başına 5-6 mg)
Otomatik hücre sayacıLogos BiosystemsL40002modeli: LUNA-II Otomatik Hücre Sayacı
Masaüstü santrifüjHettich1401modeli: UNIVERSAL 320
Soğutmalı tezgah üstü santrifüjVWR521-1647Pmodeli: Microstar 17R
CE sistemiAgilentG7100A-CE
/MS Adaptör KitiAgilentG1603A-CE/
MS Püskürtücü KitiAgilentG1607A-Hücre
sayma slaytlarıLogolar BiyosistemlerL12001LUNA Hücre Sayma Slaytları
Santrifüj evaporatörEppendorf5305000304modeli: Yoğunlaştırıcı artı komple sistem
ESI kaynağıAgilentAJS ESI-Süper
Destek FilmiNisshin EM Co. Ltd, Tokyo647
Nemlendirilmiş inkübatörBinder9040-0088modeli: CB E6.1, memeli hücrelerinin yetiştirilmesi için
Buz kutusu-numuneler, yemekler vb. İçin yeterli alan sağlamalıdır.
İzokratik LC sistemiAgilentG7110B 1260 Iso Pompamodeli: Infinity II Kuaterner sistem
MSDAgilentG6495Cüçlü dört kutuplu
Çok plakalı okuyucuTecan30086375modeli: SPARK 10 M
Serolojik pipetler içindoldurucuThermo Fisher10072332
PipetlerMarka705884, 705880, 705878, 705872, 705870çeşitli pipetler
DöndürücüLabnetH5500modeli: Mini LabRoller Döndürücü
Shortix kılcal kolon kesiciSGTS0020-Test
tüpü çalkalayıcı (vorteks karıştırıcı)Carl RothHXH6.1modeli: Rotilabo-Mini Vortex
Eğimli masaLabnetS0600modeli: EDURO MiniMix Somunlama Mikseri
Su banyosuTermo FisherFSGPD05modeli: Isotemp GPD 05
Software
MassHunter İş İstasyonuAgilentSürüm 10.1-MassHunter
İş İstasyonu LC/MS Veri ToplamaAgilentSürüm 10.1-MassHunter
İş İstasyonu Optimize EdiciAgilentSürüm 10.1-
MassHunter İş İstasyonu Kalitatif AnalizAgilentSürüm 10.0-QQQ
Kantitaiyon AnaliziAgilentSürüm 10.1-
%pipet

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stephens, L., et al. The detection, purification, structural characterization, and metabolism of diphosphoinositol pentakisphosphate(s) and bisdiphosphoinositol tetrakisphosphate(s). The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 4009-4015 (1993).
  2. Menniti, F. S., Miller, R. N., Putney, J. W. Jr, Shears, S. B. Turnover of inositol polyphosphate pyrophosphates in pancreatoma cells. The Journal of Biological Chemistry. 268 (6), 3850-3856 (1993).
  3. Shears, S. B. Inositol pyrophosphates: Why so many phosphates. Advances in Biological Regulation. 57, 203-216 (2015).
  4. Irvine, R. F., Schell, M. J. Back in the water: the return of the inositol phosphates. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (5), 327-338 (2001).
  5. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  6. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  7. Chakraborty, A., et al. Inositol pyrophosphates inhibit Akt signaling, thereby regulating insulin sensitivity and weight gain. Cell. 143 (6), 897-910 (2010).
  8. Bittner, T., et al. Photolysis of caged inositol pyrophosphate InsP8 directly modulates intracellular Ca2+ oscillations and controls C2AB domain localization. Journal of the American Chemical Society. 142 (24), (2020).
  9. Hauke, S., et al. Photolysis of cell-permeant caged inositol pyrophosphates controls oscillations of cytosolic calcium in a β-cell line. Chemical Science. 10 (9), 2687-2692 (2019).
  10. Saiardi, A., Sciambi, C., McCaffery, J. M., Wendland, B., Snyder, S. H. Inositol pyrophosphates regulate endocytic trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14206-14211 (2002).
  11. Koldobskiy, M. A., et al. p53-mediated apoptosis requires inositol hexakisphosphate kinase-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (49), 20947(2010).
  12. Rao, F., et al. Inositol hexakisphosphate kinase-1 mediates assembly/disassembly of the CRL4-signalosome complex to regulate DNA repair and cell death. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16005(2014).
  13. Williams, S. P., Gillaspy, G. E., Perera, I. Y. Biosynthesis and possible functions of inositol pyrophosphates in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 67(2015).
  14. Wilson, M. S. C., Livermore, T. M., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates: between signalling and metabolism. The Biochemical Journal. 452 (3), 369-379 (2013).
  15. Harmel, R. K., et al. Harnessing 13C-labeled myo-inositol to interrogate inositol phosphate messengers by NMR. Chemical Science. 10 (20), 5267-5274 (2019).
  16. Qiu, D., et al. Analysis of inositol phosphate metabolism by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nature Communications. 11 (1), 6035(2020).
  17. Azevedo, C., Saiardi, A. Extraction and analysis of soluble inositol polyphosphates from yeast. Nature Protocols. 1 (5), 2416-2422 (2006).
  18. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of radioactive labelling to elucidate inositol polyphosphate signalling. Phosphate Labeling and Sensing in Chemical Biology. , 67-87 (2017).
  19. Wilson, M. S. C., Bulley, S. J., Pisani, F., Irvine, R. F., Saiardi, A. A novel method for the purification of inositol phosphates from biological samples reveals that no phytate is present in human plasma or urine. Open Biology. 5 (3), 150014(2015).
  20. Losito, O., Szijgyarto, Z., Resnick, A. C., Saiardi, A. Inositol pyrophosphates and their unique metabolic complexity: analysis by gel electrophoresis. PloS One. 4 (5), 5580(2009).
  21. Dong, J., et al. Inositol pyrophosphate InsP8 acts as an intracellular phosphate signal in arabidopsis. Molecular Plant. 12 (11), 1463-1473 (2019).
  22. Riemer, E., et al. ITPK1 is an InsP6/ADP phosphotransferase that controls systemic phosphate homeostasis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2020).
  23. Whitfield, H., et al. An ATP-responsive metabolic cassette comprised of inositol tris/tetrakisphosphate kinase 1 (ITPK1) and inositol pentakisphosphate 2-kinase (IPK1) buffers diphosphosphoinositol phosphate levels. The Biochemical Journal. 477 (14), 2621-2638 (2020).
  24. Ito, M., et al. Hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the quantitative analysis of mammalian-derived inositol poly/pyrophosphates. Journal of chromatography. A. 1573, 87-97 (2018).
  25. Mantilla, B. S., Amaral, L. D. D., Jessen, H. J., Docampo, R. the inositol pyrophosphate biosynthetic pathway of Trypanosoma cruzi. ACS Chemical Biology. 16 (2), 283-292 (2021).
  26. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Inositol phosphates purification using titanium dioxide beads. Bio-Protocol. 8 (15), 2959(2018).
  27. Puschmann, R., Harmel, R. K., Fiedler, D. Scalable chemoenzymatic synthesis of inositol pyrophosphates. Biochemistry. 58 (38), 3927-3932 (2019).
  28. Gu, C., et al. KO of 5-InsP7 kinase activity transforms the HCT116 colon cancer cell line into a hypermetabolic, growth-inhibited phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 11968-11973 (2017).
  29. Gu, C., Wilson, M. S. C., Jessen, H. J., Saiardi, A., Shears, S. B. Inositol Pyrophosphate Profiling of Two HCT116 Cell Lines Uncovers Variation in InsP8 Levels. PloS One. 11 (10), 0165286(2016).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Inositol Phosphate MetabolismMultiple Reaction MonitoringInternal StandardsCellular ConcentrationHCT116 Cells

İlgili makaleler