Yağ asidi β-oksidasyonu, hepatositler de dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinde enerji üretmekten sorumlu önemli bir metabolik yoldur. Burada, 14C etiketli palmitik asit kullanarak taze izole edilmiş primer hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yeni İzole Edilmiş Fare Hepatositlerinin Süspansiyonunda Yağ Asidi β-Oksidasyonunun Ölçülmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Yağ asidi β-oksidasyonu, karaciğerin enerji taleplerini karşılamak ve tüm vücut glikoz homeostazını korumak ve açlık durumunda ekstra-hepatik organ fonksiyonunu desteklemek için gerekli olan ketogenez ve glukoneogenez gibi ek işlemler için substratlar ve kofaktörler sağlamak için önemli bir metabolik yoldur. Yağ asidi β-oksidasyonu, mitokondri ve peroksizomlarda meydana gelir ve yağ asitlerinin alımı ve aktivasyonu, enzim ekspresyon seviyeleri ve koenzim A ve NAD + gibi kofaktörlerin mevcudiyeti dahil olmak üzere çoklu mekanizmalarla düzenlenir. Karaciğer homojenatlarında yağ asidi β-oksidasyonunu ölçen tahlillerde, hücre lizisi ve kofaktörlerin suprafizyolojik seviyelerinin yaygın olarak eklenmesi, bu düzenleyici mekanizmaların etkilerini maskelemektedir. Ayrıca, homojenatlardaki organellerin bütünlüğünün kontrol edilmesi zordur ve preparatlar arasında önemli ölçüde değişebilir. Bozulmamış primer hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunun ölçümü yukarıdaki tuzakların üstesinden gelir. Bu protokol, 14C etiketli palmitik asit ile inkübe edilmiş taze izole edilmiş birincil fare hepatositlerinin bir süspansiyonunda yağ asidi β-oksidasyonunun ölçülmesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Saatlerce kültürden kaçınarak, bu yöntem, beslenen farelere kıyasla oruç tutan farelerden izole edilen hepatositlerde gözlenen yağ asidi β-oksidasyonunun aktivasyonu da dahil olmak üzere, orijinal karaciğerin protein ekspresyon seviyelerini ve metabolik yol aktivitesini daha iyi koruma avantajına sahiptir.
Giriş
Yağ asidi β-oksidasyonu, lipid metabolizmasında önemli bir süreçtir ve yağ asidi sentezini ve diyetten alımını dengelemek için katabolik bir yol sağlar. Bu süreç, kalp kası, böbrek korteksi ve oruç tutmuş karaciğer dahil olmak üzere birçok organ için enerji üretir ve diyet, yağ dokusu lipolizi ve iç trigliserit depolarından elde edilen yağ asitlerini kullanır 1,2.
Yağ asidinin β-oksidasyon yolundan oksidasyonu, yağ açil zincirinin bir seferde iki karbon tarafından sırayla kısalmasına neden olur, asetil-CoA olarak salınır ve bu işlem hem mitokondride hem de peroksizomlarda gerçekleşi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Fareler (C57BL / 6J, erkekler, 9-11 haftalık) üzerindeki tüm deneysel prosedürler, Batı Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Hepatosit izolasyonu
- Hazırlık
- Hepatosit izolasyonundan önceki günlerde, Tablo 1'de listelenen tamponları ve hücre kültürü ortamını hazırlayın. Ameliyatın yapılacağı yere yakın sıcaklık 37 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosu kurun.
- Hepatosit izolasyonu gününde, laminer bir akış başlığı altında, 35 mL Tampon 1'i steril 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne ve 70 mL Tampon 2'yi 100 mL'lik steril bir beher veya şişeye ak....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada tarif edilen karaciğer perfüzyonu tipik olarak, tripan mavisi dışlaması ile tahmin edildiği gibi, ortalama% 80 canlılığa sahip 30-40 milyon hücre / karaciğer verir (Şekil 2). Perfüzyon Tamponları 1 ve 2'yi hazırlamak için kullanılan Krebs-Henseleit tamponundaki (KHB) tipik glikoz konsantrasyonu 11 mM'dir. Oruç tutan farelerden izole edilen hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunu ölçerken, KHB'deki glikoz konsantrasyonu, açlık durumunu daha iyi temsil etmek için düşürülebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Karaciğer perfüzyonu sırasında, karaciğerdeki mikrokılcal damarları bloke ettiklerinden, tampon dolaşımını önledikleri veya kısıtladıkları ve genel olarak hepatosit verimini ve canlılığını azalttıkları için hava kabarcıklarının girmesini önlemek çok önemlidir20,21. IVC'nin kanülasyonundan önce tampon dolu giriş hattının yakından incelenmesi ve burada açıklandığı gibi Tampon 2'ye geçmek için Tampon 1'i içeren tüpten giriş hattının kaldırılmasından kaçınılması gibi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından Roberta Leonardi'ye R35GM119528 hibesi ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| (R) - (+) - Etomoksir sodyum tuzu | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C] -Palmitik asit, 50– 60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | Amerikan Radyoaktif İşaretli Kimyasallar | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, steril | Corning | 25060CI | |
| 10 & mikro; L Pozitif deplasmanlı pipet için tek kullanımlık kılcal damarlar/pistonlar | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 & L, 200 ve mikro; L ve 10 &mikro; L pipetler ve uçlar | |||
| 5 mL, 10 mL ve 25 mL serolojik pipetler | |||
| 50 mL steril santrifüj tüpleri | CellTreat | 229421 | |
| %70 Perklorik asit | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, yağ asidi içermeyen | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihidrat | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-Glikoz | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Altın Biyoteknoloji | E-217 | |
| Etanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Filtre Sistemi, 0.22 & mu; m PES Filtre, 500 mL, Steril | CellTreat | 229707 | |
| Gentamisin sülfat | Altın Biyoteknoloji | G-400-25 | |
| HDPE, 6,5 mL sintilasyon şişeleri | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hemositometre | |||
| Hipodermik iğneler 22 G, BD'de 1.5 | Biosciences | 305156 | |
| İzofluran | VetOne | ||
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Araştırma Sınıfı | MilliporeSigma | 5401119001 | Orta konsantrasyonda termolizin M199 ortamı ile saflaştırılmış kollajenaz I ve II'nin tanımlanmış karışımı |
| MilliporeSigma | M5017 | ||
| MgSO4 heptahidrat | MilliporeSigma | M1880 | |
| Mikrosantrifüj | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Mikrodiseksiyon Makası | Roboz Cerrahi Alet Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | ||
| Palmitik asit | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penisilin / streptomisin (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Pozitif yer değiştirmeli pipet MR-10, 10 ve mikro; L | Mettler Toledo | 17008575 | |
| 50 mL konik borular için ek parçalı soğutmalı santrifüj | Eppendorf | 5810 R | |
| Yuvarlak tabanlı, 14 mL, polipropilen kültür test tüpleri | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Sintilasyon sayacı | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD kokteyli | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Çalkalamalı su banyosu, 30 L kapasiteli | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
| Steril hücre süzgeçleri, 100 & mikro; m | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Başparmak Pansuman Forseps | Roboz Cerrahi Alet Co | RS-8120 | |
| Tripan Blue | Corning | 25900CI | |
| Değişken akışlı peristaltik pompa | Fisher Scientific | 138762 | |
| Su banyoları, 2– 2,5 L kapasite |
Kaynaklar
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. Triglyceride Metabolism in the Liver. Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
