Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yeni İzole Edilmiş Fare Hepatositlerinin Süspansiyonunda Yağ Asidi β-Oksidasyonunun Ölçülmesi

3.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62904

⸱

9 Eylül 2021

 ,  , 
1Department of Biochemistry, School of Medicine, West Virginia University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Yağ asidi β-oksidasyonu, hepatositler de dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinde enerji üretmekten sorumlu önemli bir metabolik yoldur. Burada, 14C etiketli palmitik asit kullanarak taze izole edilmiş primer hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

Yağ asidi β-oksidasyonu, karaciğerin enerji taleplerini karşılamak ve tüm vücut glikoz homeostazını korumak ve açlık durumunda ekstra-hepatik organ fonksiyonunu desteklemek için gerekli olan ketogenez ve glukoneogenez gibi ek işlemler için substratlar ve kofaktörler sağlamak için önemli bir metabolik yoldur. Yağ asidi β-oksidasyonu, mitokondri ve peroksizomlarda meydana gelir ve yağ asitlerinin alımı ve aktivasyonu, enzim ekspresyon seviyeleri ve koenzim A ve NAD + gibi kofaktörlerin mevcudiyeti dahil olmak üzere çoklu mekanizmalarla düzenlenir. Karaciğer homojenatlarında yağ asidi β-oksidasyonunu ölçen tahlillerde, hücre lizisi ve kofaktörlerin suprafizyolojik seviyelerinin yaygın olarak eklenmesi, bu düzenleyici mekanizmaların etkilerini maskelemektedir. Ayrıca, homojenatlardaki organellerin bütünlüğünün kontrol edilmesi zordur ve preparatlar arasında önemli ölçüde değişebilir. Bozulmamış primer hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunun ölçümü yukarıdaki tuzakların üstesinden gelir. Bu protokol, 14C etiketli palmitik asit ile inkübe edilmiş taze izole edilmiş birincil fare hepatositlerinin bir süspansiyonunda yağ asidi β-oksidasyonunun ölçülmesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Saatlerce kültürden kaçınarak, bu yöntem, beslenen farelere kıyasla oruç tutan farelerden izole edilen hepatositlerde gözlenen yağ asidi β-oksidasyonunun aktivasyonu da dahil olmak üzere, orijinal karaciğerin protein ekspresyon seviyelerini ve metabolik yol aktivitesini daha iyi koruma avantajına sahiptir.

Giriş

Yağ asidi β-oksidasyonu, lipid metabolizmasında önemli bir süreçtir ve yağ asidi sentezini ve diyetten alımını dengelemek için katabolik bir yol sağlar. Bu süreç, kalp kası, böbrek korteksi ve oruç tutmuş karaciğer dahil olmak üzere birçok organ için enerji üretir ve diyet, yağ dokusu lipolizi ve iç trigliserit depolarından elde edilen yağ asitlerini kullanır 1,2.

Yağ asidinin β-oksidasyon yolundan oksidasyonu, yağ açil zincirinin bir seferde iki karbon tarafından sırayla kısalmasına neden olur, asetil-CoA olarak salınır ve bu işlem hem mitokondride hem de peroksizomlarda gerçekleşir. Çoğu yağ asidi sadece β oksidasyona uğrarken, bazıları bu yola girmeden önce farklı karbonlarda oksitlenir. Örneğin, fitanik asit gibi 3-metil ikame edilmiş yağ asitleri, α-oksidasyon yoluna girmeden önce peroksizomlarda β-oksidasyon ile bir karbonun uzaklaştırılmasına uğrar. Benzer şekilde, bazı yağ asitleri ilk önce endoplazmik retikulumdaki terminal metil grubunun (ω-oksidasyon) oksidasyonu ile dikarboksilik yağ asitlerine dönüştürülür ve tercihen peroksizomlarda β-oksidasyon3 ile oksitlenir.

Spesifik organelden bağımsız olarak, bir yağ asidi önce β-oksidasyon yolundan oksitlenmek üzere bir koenzim A (CoA) tiyoesterine veya açil-CoA'ya dönüştürülmelidir. β-Mitokondriyal matriksteki uzun zincirli açil-CoAs'ın oksidasyonu, translokasyonları için karnitin mekiğine ihtiyaç duyar, burada karnitin palmitoyltransferaz 1 (CPT1), açil-CoAs'ın asilkarnitinlere dönüşümünü katalize eder ve bu işlemde hız sınırlayıcı enzimdir4. Mitokondriyal matrise aktarıldıktan sonra, açil-CoAs yeniden oluşturulur ve mitokondriyal β-oksidasyon makineleri için substratlar olarak işlev görür. Oruç tutulan durumda, hepatik mitokondride β-oksidasyon yoluyla üretilen asetil-CoA öncelikle ketogeneze kanalize edilir. Peroksizomlar, çok uzun zincirli, dallı zincirli ve dikarboksilik yağ asitlerinin β oksidasyonu için birincil bölge olarak işlev görür. Peroksizomlar, karnitin mekiğinin yağ asidi substratlarını ithal etmesini gerektirmez, bunun yerine ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları ABCD1-35'in aktivitesi yoluyla karşılık gelen açil-CoAs'ı ithal eder. Peroksizomlar içinde, açil-CoA'lar daha sonra mitokondriyal yağ asidi β-oksidasyon makinesinden farklı olarak özel bir enzim seti tarafından oksitlenir. Hem mitokondri hem de peroksizomlar, yağlı açil zincirlerini oksitlemek için NAD + ve serbest CoA tedariki gerektirir. Karaciğerdeki CoA seviyelerinin, açlığa yanıt olarak arttığı ve bu durumda meydana gelen yağ asidi oksidasyon oranının artmasını desteklediği gösterilmiştir6. Ayrıca, peroksizomlarda artan CoA bozunumu, peroksizomal yağ asidi oksidasyonunda seçici bir azalmaya nedenolur 7. Bu nedenle, hücre içindeki yağ asidi oksidasyon süreci, yağ asitlerinin aktivasyonu, taşınması ve oksidasyonunda yer alan enzimlerin ekspresyon seviyeleri ve aktivitelerinin yanı sıra çoklu hücre altı bölmeler boyunca kofaktörlerin ve diğer metabolitlerin konsantrasyonları ile düzenlenir.

Yağ asidi oksidasyonunu ölçmek için doku homojenatları kullanan prosedürler, bu süreci düzenleyen ve destekleyen hücresel mimariyi tahrip eder ve bu da in vivo metabolizmayı doğru bir şekilde yansıtmayan bir veri toplanmasına yol açar. Kaplanmış primer hepatositleri kullanan teknikler bu sistemi korurken, izole hücrelerin uzun süre kültürlenmesi, hala hayvan içinde yaşarken hücrelerde bulunan in vivo gen ekspresyon profilinin kaybına neden olur 8,9. Aşağıdaki protokol, primer hepatositleri izole etmek ve [1-14C] palmitik asit kullanarak, izolasyondan hemen sonra ve süspansiyonda yağ asidi β-oksidasyon kapasitelerini test etmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Tahlil, asitte çözünür metabolitler (ASM) veya [1-14 C] palmitik asit10,11'in β-oksidasyonu ile üretilen asetil-CoA gibi ürünlerle ilişkili radyoaktivitenin ölçümüne dayanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Fareler (C57BL / 6J, erkekler, 9-11 haftalık) üzerindeki tüm deneysel prosedürler, Batı Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Hepatosit izolasyonu

  1. Hazırlık
    1. Hepatosit izolasyonundan önceki günlerde, Tablo 1'de listelenen tamponları ve hücre kültürü ortamını hazırlayın. Ameliyatın yapılacağı yere yakın sıcaklık 37 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosu kurun.
    2. Hepatosit izolasyonu gününde, laminer bir akış başlığı altında, 35 mL Tampon 1'i steril 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne ve 70 mL Tampon 2'yi 100 mL'lik steril bir beher veya şişeye aktarın.
    3. Her iki tampona da gentamisin (50 μg / mL) ve penisilin / streptomisin (1x) antibiyotik ekleyin.
    4. Adım 1.1.3'te hazırlanan 20 mL Tampon 2'yi 100 mm'lik bir hücre kültürü kabına aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.
    5. Kalan 50 mL Tampon 2'yi steril 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Antibiyotik takviyeli Tampon 1 ve 2'yi içeren 50 mL tüpleri 37 ° C'de ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin ve perfüzyona başlamadan önce en az 15 dakika ısınmalarına izin verin.
      NOT: Bir seansta birden fazla hepatosit izolasyonu yapıyorsanız, buna göre hazırlanmak için Tampon 1 ve 2'nin antibiyotik takviyeli alikotlarının sayısını artırın.
    6. Bir aliquot kollajenaz çözeltisini çözün ve buz üzerinde tutun.
      NOT: Uygun şekilde saklanırsa, dondurulmuş ve 3 defaya kadar çözülmüş ve hazırlandıktan sonraki 3 hafta içinde kullanılan kollajenaz çözeltilerinde önemli bir enzim aktivitesi kaybı yoktur.
    7. Cerrahi aletleri ve peristaltik pompayı hazırlayın. Peristaltik pompanın hatlarını 15 mL% 70 etanol, ardından 15 mL steril su sirküle ederek sterilize edin.
    8. Çıkış hattına 22 G'lik bir iğne bağlayın (Şekil 1A). Bir kateterin içi boş filtresi bir konektör olarak iyi çalışır. Hatları Arabellek 1 ile doldurun ve hava kabarcığı sıkışmadığından emin olmak için çizgileri, konektörü ve iğneyi inceleyin.

figure-protocol-1
Şekil 1: Perfüzyon aparatı ve perfüze karaciğer. (A) Karaciğeri kanüle etmek ve perfüze etmek için kullanılan iğneye bağlı çıkış hattına sahip peristaltik pompa. (B) Başarılı kanülasyon, karaciğerin derhal ve homojen bir şekilde ağartılması ile gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Karaciğer perfüzyonu ve ayrışması
    1. Bir fareyi, taşıyıcı gaz olarak tıbbi sınıf hava ile izofluran inhalasyonu yoluyla, indüksiyon için% 4 izofluran ve anesteziyi sürdürmek için% 1.5 izofluran kullanarak anestezi yapın. Pedal refleksinin kaybını değerlendirerek anestezi derinliğini doğrulayın.
    2. Ayak parmağını sıkıştırmaya yanıt olmadığında, fareyi bir ameliyat tahtasına sırtüstü pozisyonda yerleştirin, uzuvları uzatın ve pimlerle tahtaya sabitleyin.
    3. Farenin karnını ve göğsünü % 70 etanol ile serbestçe püskürtün.
    4. Forseps kullanarak, cildi ve karın duvarını karın tabanına yakın bir yere çekin ve organları açığa çıkarmak için orta hattın her iki tarafında ve diyaframa kadar yanal olarak kesin.
    5. Bağırsakları sağ tarafa hareket ettirerek ve karaciğerin loblarını hafifçe yukarı çevirerek inferior vena kavayı (IVC) ortaya çıkarın. IVC'yi hafifçe eğmek ve kanülasyonunu kolaylaştırmak için farenin arkasına iğne kapağı gibi küçük bir silindirik nesne yerleştirin (Şekil 1B).
    6. Pompayı en düşük hızda çalıştırın ve Tampon 1 akarken iğneyi IVC'ye yerleştirin.
    7. Basıncı hafifletmek ve kan ve perfüzyon tamponlarının drenajına izin vermek için portal damarı kesin, ardından akış hızını hemen 7 mL / dak'ya yükseltin. Doğru yapılırsa, karaciğer birkaç saniye içinde eşit şekilde beyazlayacaktır (Şekil 1B).
    8. Daha tutarlı sonuçlar için, iğneyi perfüzyonun tüm süresi boyunca elle yerinde tutun.
    9. Karaciğeri ılık Tampon 1 ile perfüze edin. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için, Tampon 1 içeren tüpe yerleştirilen hattın sürekli olarak suya batırıldığından emin olun.
    10. Perfüzyon meydana gelirken, Tampon 2'ye 130 μL kollajenaz çözeltisi ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetle pipetle veya 5 mL veya 10 mL serolojik pipetle karıştırarak karıştırın.
    11. Tampon 1'i içeren tüpteki hacim yaklaşık 5 mL'ye düştüğünde, tüpün yan tarafına pipet uygulayarak yavaşça Tampon 1'e 5 mL Tampon 2 ekleyin. Amaç, Tampon 1'den Tampon 2'ye geçerken hatta hava kabarcıkları girmekten kaçınmaktır.
    12. Ses seviyesi tekrar 5 mL'ye düşene kadar bekleyin ve yavaşça 5 mL'lik bir Arabellek 2 daha ekleyin. Bir kez daha tekrarlayın. Tampon 2, Tampon 1'in yerini aldığında ve ayrışma başladığında, karaciğer şişecektir.
    13. Kalan Tampon 2'yi, orijinal olarak Tampon 1'i içeren tüpe ekleyin. Tüpte yaklaşık 5-10 mL Tampon 2 kaldığında perfüzyonu durdurun.
      NOT: Tampon 2 karaciğeri perfüze ederken, portal ven aralıklı olarak forseps ile 5 s boyunca kelepçelenebilir. Bu adım isteğe bağlıdır, ancak karaciğer boyunca basınçta ortaya çıkan artış, ayrışmasını ve dolayısıyla nihai hepatosit verimini artırabilir.
    14. Karaciğeri dikkatlice tüketin ve 1.1.4 adımında bir kenara bırakılan 20 mL buz gibi soğuk Tampon 2'yi içeren 100 mm'lik kültür kabına aktarın.
    15. Laminer akış başlığının altında, cerrahi makas ve cımbız kullanarak karaciğeri yavaşça ayırın.
    16. Hepatosit süspansiyonuna yaklaşık 20 mL buz gibi soğuk M199 ekleyin ve daha büyük karaciğer parçalarından ilave hepatositlerin salınmasını nazikçe teşvik etmek için bir şırınganın pistonunu kullanarak 100 μm hücre süzgecinden süzün.
    17. 100 mm'lik kültür kabını ve hücre süzgecini toplama tüpü dolana kadar ilave M199 ile yıkayın.
    18. Süspansiyonu 50 x g'de 4 ° C'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hepatosit peletini 30 mL soğuk M199'da döndürerek yavaşça yeniden askıya alın.
    19. Adım 1.2.18'de belirtildiği gibi hepatositleri toplayın. Yıkamayı bir kez daha tekrarlayın.
    20. Hepatositleri 10 mL ılık M199'da yeniden askıya alın ve tripan mavisi dışlama yöntemini ve bir hemositometre12'yi kullanarak canlılığı ve verimi belirleyin.
    21. M199'daki hücreleri 37 ºC'ye ısıtarak 1.0 x 106 canlı hücre / mL'lik son konsantrasyona kadar seyreltin ve hemen tahlil işlemine başlayın.

2. Yağ asidi β-oksidasyon testi

NOT: Tahlil üçlü olarak gerçekleştirilir ve her reaksiyon karışımı 750.000 hücre, 1.35 mg / mL sığır serum albümini (BSA), 100 μM palmitik asit ve 2 mL'lik son hacimde 0.4 μCi [1-14C] palmitik asit içerir.
DİKKAT: Radyoaktif bileşikler tehlikelidir. Radyoaktif malzemenin Kurumsal, Eyalet ve Federal düzenlemelere uygun olarak satın alınması, taşınması, depolanması ve bertaraf edilmesi.

  1. Hazırlık
    1. Tahlilden önceki günlerde, palmitik asit ve BSA çözeltilerini hazırlayın (Tablo 1) ve -20 ° C'de saklayın.
    2. Tahlil gününde, karaciğer perfüzyonuna başlamadan önce 2.1.3-2.1.9 adımlarını tamamlayın.
    3. Palmitik asit ve BSA çözeltilerini çözün. Substrat karışımını çoklu reaksiyonlar artı -0 fazlalık için hazırlayın ve tipik bir tahlil kurulumu Tablo 2'de gösterilmiştir.
    4. Bir mikrosantrifüj tüpünde reaksiyon başına 13.5 μL BSA çözeltisi Aliquot ve 41 ° C'ye ısıtın, ardından reaksiyon başına 200 mM palmitik asit çözeltisinden (BSA: palmitik asit molar oranı = 1: 5) 1 μL ekleyin.
      NOT: Radyoaktif ve radyoaktif olmayan palmitik asit çözeltileri gibi organik çözücüler kullanılarak hazırlanan çözeltilerin, pozitif yer değiştirmeli pipet ve uygun uçlarla dağıtılması tercih edilir.
    5. Vorteks, çözünür palmitik asidin oluşumunu kolaylaştırmak için 41 ° C'de kuvvetli bir şekilde inkübe edilir ve inkübe edilir: BSA kompleksi. Kuluçka döneminde ara sıra vorteks.
    6. Karışım başlangıçta bulanık görünecek, ancak 41 ° C'de 20-30 dakikalık inkübasyondan sonra tamamen netleşecektir. Reaksiyonları başlatmaya hazır olana kadar 41 ° C'de tutun.
    7. Aliquot 133 μL 1 M perklorik asit 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde reaksiyonları durdurmak için.
      DİKKAT: Perklorik asit güçlü bir asit ve güçlü bir oksidandır. Bu bileşiği işlemek için uygun koruyucu ekipman gereklidir.
    8. Bir tüpe reaksiyon başına 485.5 μL M199 Aliquot ve radyoaktif BSA'yı seyreltmek için 37 ° C'de tutun: reaksiyonlara başlamadan önce 2.1.4-2.1.6 adımlarında hazırlanan palmitik asit kompleksi.
    9. 750 μL M199'u, numuneler kadar 14 mL yuvarlak tabanlı tüplere dağıtın. İstenirse, bir araç kontrolü de dahil olmak üzere etomoksir, rotenon ve antimisin gibi yağ asidi β-oksidasyon inhibitörleri ekleyin (Tablo 2).
    10. Hepatosit yıkama adımları sırasında, reaksiyonlara başlamadan 10-15 dakika önce, adım 2.1.9'da hazırlanan tüpleri 37 ° C'ye ayarlanmış ve 180-200 rpm'de çalkalanan bir sallanan su banyosuna aktarın.
  2. Yağ asidi β-oksidasyon reaksiyonlarını başlatmak, durdurmak ve analiz etmek
    1. Hepatositlerin yaşayabilirliği kabul edilebilirse (tipik olarak u'≥, Şekil 2), her reaksiyon için, berraklaştırılmış BSA: palmitik asit çözeltisini içeren mikrosantrifüj tüpüne 0.8 μL [1-14C] palmitik asit (0.5 mCi / mL) aktarın (adım 2.1.4-2.1.6). Vorteks yapın ve 41 °C'de su banyosuna geri dönün.
    2. Hepatositleri 37 ° C'ye dengelemek ve inhibitörlerle (varsa) önceden inkübe etmek için, son hepatosit yeniden süspansiyonundan hemen sonra (adım 1.2.21), hepatosit süspansiyonunun 750 μL'sini, sallanan su banyosundaki 14 mL yuvarlak tabanlı tüplerin her birine 1 mL'lik bir pipetle aktarın (adım 2.1.9-2.1.10) ve vorteksi karıştırmak için kısa bir süre düşük hızda.
    3. Her bir ilaveyi 30 s kademelendirin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın. Protein tayini için bir numune kaydetmek için, başka bir hepatosit alikotunu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 5 dakika boyunca 3.000 x g'de döndürün.
      NOT: Dağıtım sırasında, numuneler arasında çökelmeyi ve hücre sayısında büyük değişkenliği önlemek için hepatosit süspansiyonunun sürekli olarak döndürülmesi veya 1 mL pipetle birlikte hafifçe karıştırılması gerekir.
    4. Süpernatantı çıkarın ve sonuçları normalleştirmek için numunedeki toplam protein miktarını ölçmeye hazır olana kadar peleti -80 ° C'de saklayın (Şekil 3).
    5. Hepatositler 37 ° C'de ön inkübasyon altındayken, radyoaktif BSA: palmitik asit kompleksini 2.1.8'deki ılık ortama ekleyin ve reaksiyonları başlatmaya hazır olana kadar 37 ° C'de tutun. Bu son substrat karışımıdır.
    6. Reaksiyonları başlatmak için, hepatositleri su banyosundan çıkarın ve 500 μL substrat karışımı ekleyin.
    7. Vorteks, hücreleri tamamen askıya almak ve su banyosuna geri dönmek için 5 s düşük hızda vorteks. Tüm örneklerle tekrarlayın, 30 sn şaşırtın.
    8. 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Bir dizi reaksiyonu başlatın ve arka plan radyoaktivitesini belirlemek için hemen durdurun (bkz. adım 2.2.10-2.2.11) (Tablo 2).
    9. Artık substrat karışımının yinelenen alikotlarını (200-250 μL) 6 mL sintilasyon şişelerine aktarın ve sayılmak üzere bir kenara koyun. 500 μL substrat karışımında oksidasyon için mevcut olan toplam palmitik asit nmollerine karşılık gelen radyoaktiviteyi hesaplamak için bu sayıları kullanın.
    10. Reaksiyonları durdurmak için, hepatositleri su banyosundan çıkarın, hepatositleri orta hızda vorteks yaparak yeniden askıya alın ve ardından hepatosit süspansiyonunun 400 μL'sini perklorik asit içeren mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
    11. Hemen tüpleri kapatın. Bu sırayı tüm numuneler için 30 sn kademelendirerek tekrarlayın.
    12. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini kuvvetlice vorteksleyin ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini 10 dakika boyunca 13.000 x g'de döndürün.
    13. Süpernatantın 300 μL'sini 6 mL'lik bir sintilasyon şişesine aktarın, 4 mL sintilasyon sıvısı ekleyin ve numunelerdeki radyoaktiviteyi ve substrat karışımı alikotları (adım 2.2.9) bir sintilasyon sayacında sayın.
      DİKKAT: Santrifüjlemeden sonra, yağ asidi β-oksidasyonu tarafından üretilen ve asidik koşullar tarafından salınan 14C-asetil-CoA'nın tam oksidasyonu ile üretilen 14C-CO2'nin solunmasını önlemek için tüpleri bir duman başlığı altında açın.
Arabellekler/Medya BileşenleriMiktarSon KonsantrasyonTalimat -ları
Çözüm C
Kartal1.79 gr480 mM50 mL'ye su ekleyin.  4 °C'de depolayın
MgSOİ4 heptahidrat1.48 gr120 mM
KH2PO4 0.81 gr119 mM
Krebs-Henseleit Tamponu (KHB), kalsiyum içermez
Arjantin7.0 gr120 mM900 mL'ye su ekleyin, pH'ı 7,4'e ayarlayın ve son hacmi 1 L'ye getirin.
NaHCO3 2.0 gr24 mM
1 M HEPES pH 7.455 mL5 mM
Glikoz1 veya 2 g5,6 veya 11 mM
Çözüm C10 mL
Arabellek 1
cesaret500 mLBileşenleri karıştırın ve filtreleyin. 4 °C'de depolayın
50 mM EGTA1,0 mL0,1 mM
Arabellek 2
cesaret500 mLBileşenleri karıştırın ve filtreleyin. 4 °C'de depolayın
1 M CaCl2 dihidrat686 μL1,4 mM
Gentamisin çözeltisi
Gentamisin sülfat0.5 gr50 mg/mL10 mL'ye su ekleyin ve sterilize edin. Aliquot ve -20 °C'de saklayın
Kollajenaz çözeltisi
Kollajenaz I ve II karışımı10 mg7 mg/mLŞişenin tüm içeriğini 1.43 mL su içinde çözün.  Aliquot ve -20 °C'de saklayın
M199 Serisi
M199 Serisi1 kese900 mL'ye su ekleyin ve pH'ı 7.2-7.4'e ayarlayın. Son hacmi 1 L'ye getirin ve sterilize edin. 4 °C'de depolayın
NaHCO3 2.2 gr26 mM
1 M HEPES (hücre kültürü sınıfı)25 mL25 mM
Ekstra glikoz (sadece beslenen fareler için)1 gr11 mM
BSA çözümü
Yağ asidi içermeyen BSA400 mg (w/d)2 mL suda çözün.  Aliquot ve -20 °C'de saklayın
Radyoaktif olmayan palmitik asit çözeltisi
Palmitik asit103 mg200 mM2 mL etanol içinde çözün, -20 °C'de saklayın
1 M Perklorik asit
p Perklorik asit3,5 mL1 milyonSu ile 40 mL'ye kadar seyreltin. Oda sıcaklığında saklayın

Tablo 1: Hepatosit izolasyonu ve yağ asidi β-oksidasyon testi için gerekli tamponlar, ortamlar ve diğer çözeltiler

Reaksiyon numarasıM199 ± İnhibitörleriHepatosit süspansiyonu (μL)Substrat karışımı (μL)
Ses seviyesi (μL)Etomoksir
1750-37 °C'de ön ısıtma75015 dakika boyunca 37 °C'de ön inkübasyon50015 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin
2
3
4+
5
6
7+Hemen durdurun
8
9

Tablo 2: Etomoksir varlığında ve yokluğunda üçlü olarak test edilen hepatosit süspansiyonu için deney düzeneği örneği.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada tarif edilen karaciğer perfüzyonu tipik olarak, tripan mavisi dışlaması ile tahmin edildiği gibi, ortalama% 80 canlılığa sahip 30-40 milyon hücre / karaciğer verir (Şekil 2). Perfüzyon Tamponları 1 ve 2'yi hazırlamak için kullanılan Krebs-Henseleit tamponundaki (KHB) tipik glikoz konsantrasyonu 11 mM'dir. Oruç tutan farelerden izole edilen hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunu ölçerken, KHB'deki glikoz konsantrasyonu, açlık durumunu daha iyi temsil etmek için düşürülebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Karaciğer perfüzyonu sırasında, karaciğerdeki mikrokılcal damarları bloke ettiklerinden, tampon dolaşımını önledikleri veya kısıtladıkları ve genel olarak hepatosit verimini ve canlılığını azalttıkları için hava kabarcıklarının girmesini önlemek çok önemlidir20,21. IVC'nin kanülasyonundan önce tampon dolu giriş hattının yakından incelenmesi ve burada açıklandığı gibi Tampon 2'ye geçmek için Tampon 1'i içeren tüpten giriş hattının kaldırılmasından kaçınılması gibi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından Roberta Leonardi'ye R35GM119528 hibesi ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(R) - (+) - Etomoksir sodyum tuzuTocris Bioscience4539/10
[1-14C] -Palmitik asit, 50– 60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mLAmerikan Radyoaktif İşaretli KimyasallarARC 0172A
1 M HEPES, sterilCorning25060CI
10 & mikro; L Pozitif deplasmanlı pipet için tek kullanımlık kılcal damarlar/pistonlarMettler Toledo17008604
1000 & L, 200 ve mikro; L ve 10 &mikro; L pipetler ve uçlar
5 mL, 10 mL ve 25 mL serolojik pipetler
50 mL steril santrifüj tüpleriCellTreat229421
%70 Perklorik asitFisher ScientificA2296-1LB
BSA, yağ asidi içermeyenFisher ScientificBP9704100
CaCl2 dihidratMilliporeSigma223506
D-(+)-GlikozMilliporeSigmaG7021
EGTAAltın BiyoteknolojiE-217
EtanolPharmco111000200CSPP
Filtre Sistemi, 0.22 & mu; m PES Filtre, 500 mL, SterilCellTreat229707
Gentamisin sülfatAltın BiyoteknolojiG-400-25
HDPE, 6,5 mL sintilasyon şişeleriFisher Scientific03-342-3
Hemositometre
Hipodermik iğneler 22 G, BD'de 1.5Biosciences305156
İzofluranVetOne
KClFisher ScientificBP366-1
KH2< / sub>PO4< / sub>MilliporeSigmaP5655
Liberase TM Araştırma SınıfıMilliporeSigma5401119001Orta konsantrasyonda termolizin M199 ortamı ile saflaştırılmış kollajenaz I ve II'nin tanımlanmış karışımı
MilliporeSigmaM5017
MgSO4 heptahidratMilliporeSigmaM1880
MikrosantrifüjFisher ScientificaccuSpin Micro 17
Mikrodiseksiyon MakasıRoboz Cerrahi Alet CoRS-5980
NaClChem-Impex International30070
NaHCO3Acros Organics
Palmitik asitMilliporeSigmaP0500
Penisilin / streptomisin (100x)Gibco15140122
Fosfat tamponlu salin (PBS)Cytiva Life SciencesSH30256.01
Pozitif yer değiştirmeli pipet MR-10, 10 ve mikro; LMettler Toledo17008575
50 mL konik borular için ek parçalı soğutmalı santrifüjEppendorf5810 R
Yuvarlak tabanlı, 14 mL, polipropilen kültür test tüpleriFisher Scientific14-956-9A
Sintilasyon sayacıPerkin ElmerTriCarb 4810 TR
ScintiVerse BD kokteyliFisher ScientificSX18-4
Çalkalamalı su banyosu, 30 L kapasiteliNew Brunswick Scientific  Model G76
Steril hücre süzgeçleri, 100 & mikro; mFisher Scientific22363549
Başparmak Pansuman ForsepsRoboz Cerrahi Alet CoRS-8120
Tripan BlueCorning25900CI
Değişken akışlı peristaltik pompaFisher Scientific138762
Su banyoları, 2– 2,5 L kapasite
502017424270010

Kaynaklar

  1. Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. Triglyceride Metabolism in the Liver. Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).
  2. Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).
  3. Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation. Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).
  4. Kerner, J., Hoppel, C. Fatty acid import into mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).
  5. Baker, A., et al. Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).
  6. Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PloS One. 5 (6), 11107(2010).
  7. Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).
  8. Richert, L., et al. Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).
  9. Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture. Clinical Chemistry. 30 (12), Pt 1 2053-2058 (1984).
  10. Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures. Biochemical Journal. 323, Pt 1 119-122 (1997).
  11. Consitt, L. A., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals. Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).
  12. Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615(2013).
  13. Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases. Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).
  14. Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs. Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).
  15. Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets. Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).
  16. Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).
  17. Hakvoort, T. B., et al. Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).
  18. Sokolovic, M., et al. The transcriptomic signature of fasting murine liver. BMC Genomics. 9, 528(2008).
  19. Kersten, S., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting. Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).
  20. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  21. Ng, I. C., et al. Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289(2021).
  22. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917(2012).
  23. Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).
  24. Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).
  25. Bougarne, N., et al. PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).
  26. Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Beta OksidasyonHepatosit SüspansiyonuMitokondriyal OksidasyonPeroksizomal OksidasyonPalmitik Asit AnaliziKaraciğer PerfüzyonuRadyoaktif SubstratMetabolik Yollar
Yeni İzole Edilmiş Fare Hepatositlerinin Süspansiyonunda Yağ Asidi β-Oksidasyonunun Ölçülmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.