İnsan Pluripotent Kök Hücre Sferoidlerini Taşıyan Core-Shell Mikrokapsüllerinin Mikroakışkan İmalatı

Summary

Bu makalede, insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) koaksiyel akış odaklama cihazı kullanılarak kapsüllenmesi açıklanmaktadır. Bu mikroakışkan kapsülleme teknolojisinin hPSC sferoidlerinin verimli bir şekilde oluşturulmasını sağladığını gösteriyoruz.

Abstract

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) üç boyutlu (3D) veya sferoid kültürleri, gelişmiş farklılaşma sonuçlarının ve ölçeklenebilirliğin faydalarını sunar. Bu yazıda, hPSC'leri çekirdek kabuklu mikrokapsüllerin içine hapsetmek için bir ko-eksenel akış odaklama cihazının kullanıldığı hPSC sferoidlerinin sağlam ve tekrarlanabilir oluşumu için bir strateji açıklanmaktadır. Çekirdek çözelti, hPSC'lerin tek hücreli süspansiyonunu içeriyordu ve yüksek moleküler ağırlıklı poli (etilen glikol) (PEG) ve yoğunluk gradyan ortamının dahil edilmesiyle viskoz hale getirildi. Kabuk akışı, PEG-4 kol-maleimid veya PEG-4-Mal'dan oluşuyordu ve çekirdek akışı boyunca iki ardışık petrol kavşağına doğru akıyordu. Damlacık oluşumu, ilk yağ kavşağında, kabuk çözeltisinin çekirdeğin etrafına sarılmasıyla meydana geldi. Kabuğun kimyasal çapraz bağlanması, ikinci yağ kavşağında, bu damlacıklara bir di-tiyo çapraz bağlayıcı (1,4-ditiyotreitol veya DTT) eklenerek meydana geldi. Çapraz bağlayıcı, tıklama kimyası yoluyla maleimid fonksiyonel gruplarıyla reaksiyona girer ve mikrokapsüllerin etrafında bir hidrojel kabuğunun oluşmasına neden olur. Enkapsülasyon teknolojimiz, saniyede 10 kapsül hızında 400 μm çapında kapsüller üretti. Ortaya çıkan kapsüller, bir hidrojel kabuğa ve tek hücrelerin agregalara hızla toplanmasına ve sferoidler oluşturmasına izin veren sulu bir çekirdeğe sahipti. Kapsülleme işlemi, hPSC'lerin yaşayabilirliğini olumsuz yönde etkilemedi, kapsüllemeden 3 gün sonra% >95 canlılık gözlendi. Karşılaştırma için, katı jel mikropartiküllerinde (sulu bir çekirdek olmadan) kapsüllenmiş hPSC'ler sferoidler oluşturmadı ve kapsüllemeden 3 gün sonra% <50 canlılığa sahipti. Çekirdek-kabuk mikrokapsülleri içindeki hPSC'lerin küresel oluşumu, kapsüllemeden sonraki 48 saat içinde meydana geldi ve sferoid çap, hücre aşılama yoğunluğunun bir fonksiyonuydu. Genel olarak, bu protokolde açıklanan mikroakışkan kapsülleme teknolojisi, hPSC'lerin kapsüllenmesi ve sferoid oluşumu için çok uygundu.

Introduction

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) 3D kültürlerine, bu kültür formatı ^1,2,3'ün sağladığı gelişmiş pluripotens ve farklılaşma potansiyeli nedeniyle büyük ilgi vardır. hPSC'ler tipik olarak biyoreaktörler, mikrokuyular, hidrojeller ve polimerik iskeleler ^4,5,6 aracılığıyla sferoidler veya diğer 3D kültür formatları halinde oluşturulur. Kapsülleme, tek hPSC'leri sferoidler halinde düzenlemek için başka bir yol sunar. Kapsüllendikten sonra hPSC sferoidleri kolaylıkla ele alınabilir ve farklılaşma, hastalık modelleme veya ilaç testi deneyleri için mikrotitre plakalarına aktarılabilir. hPSC'lerin bir hidrojel tabakası içinde muhafaza edilmesi ayrıca hücreleri kesme hasarına karşı korur ve sferoidlerin bir biyoreaktörde yüksek karıştırma oranlarında^{kültürlenmesine} izin verir 7.

Kök hücre kapsülleme metodolojimiz zamanla gelişti. İlk olarak, katı hidrojel mikropartiküllerine odaklandık ve fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC'ler) başarılı bir şekilde kapsüllendiğini ve yetiştirildiğini ^gösterdik8. Bununla birlikte, insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler), muhtemelen bu hücrelerin kapsüllemeden sonra hücre-hücre temaslarını yeniden kurmalarına duyulan ihtiyaç nedeniyle, bu tür hidrojel mikropartiküllerde kapsüllendiğinde düşük canlılığa sahip oldukları belirtildi. Sulu bir çekirdeğe sahip heterojen mikrokapsülün, hücre-hücre temaslarının hızlı bir şekilde yeniden kurulmasına dayanan hücrelerin kapsüllenmesi için daha uygun olabileceğini düşündük. Sulu çekirdek / hidrojel kabuk mikrokapsülleri yapmak için mikroakışkan cihaz odaklı koaksiyel akış kavramı He ve ^ark.9'dan uyarlanmıştır, ancak orijinal yaklaşımda kullanılan aljinat yerine, PEG bazlı bir hidrojel kabuğa dahil edilmiştir. İlk olarak çekirdek-kabuk mikrokapsüllerinde primer hepatositin başarılı kapsüllenmesi ve sferoid oluşumu¹⁰ gösterdik ve en son olarak hES ve iPS hücrelerinin kapsüllenmesini tanımladık⁷. Şekil 1A'da belirtildiği gibi, kapsüller, kabuk ve çekirdek akış akışlarının yağ fazına atılmadan önce bir yandan diğer yana koaksiyel akışa geçtiği bir akış odaklama cihazında üretilir. Çekirdek akışı, çözeltinin viskozitesini artıran hücreler ve katkı maddeleri içerir (reaktif olmayan PEG MW 35kD ve iyodiksanol - ticari adı OptiPrep), kabuk akışı ise reaktif moleküller (PEG-4-Mal) içerir. Sürekli koaksiyel akış akışı, çekirdek-kabuk mimarisini koruyan damlacıklar halinde ayrıklaştırılır. Çekirdek-kabuk yapısı, tıklama kimyası yoluyla PEG-4-Mal ile reaksiyona giren ve ince (~ 10 μm) bir hidrojel cilt veya kabuk oluşumuna neden olan di-tiol çapraz bağlayıcıya (DTT) maruz kalınarak kalıcı hale getirilir. Emülsiyon kırıldıktan ve kapsüller sulu bir faza aktarıldıktan sonra, PEG molekülleri çekirdekten yayılır ve su molekülleri ile değiştirilir. Bu, sulu çekirdek ve hidrojel kabuk mikrokapsülleri ile sonuçlanır.

Aşağıda, mikroakışkan cihazların nasıl yapılacağı, hücrelerin nasıl hazırlanacağı ve hPSC'lerin kapsüllenmesinin nasıl gerçekleştirileceği hakkında adım adım talimatlar verilmiştir.

Protocol

1. Cihaz imalatı

1. CAD yazılımı^10,11'i kullanarak mikrokapsülleme cihazı ve ayrışma cihazı için tasarımlar yapın.
2. İstenilen yüksekliklere sahip yapılar elde etmek için SU-8 fotodirencinin üç katmanını silikon gofret üzerinde sırayla (Şekil 2A) spin-co'layın: 60, 100 ve 150 μm.
   NOT: Üst ve alt kalıplar için işlem aynıdır.
   1. İlk 60 μm katmanı oluşturmak için 1.100 rpm'de SU-8 2025 negatif fotorezistli temiz bir 10 cm'lik silikon gofret kaplayın. Sıcak plaka üzerinde 3 dakika boyunca 65 °C'de ve 10 dakika boyunca 95 °C'de yumuşak bir fırınlamadan sonra, çekirdek kanal deseninin tasarım dosyasını μPG 101 PC'ye yükleyerek maskesiz bir hizalayıcı kullanarak kalıbı ortaya çıkarın. Ardından, maruz kalma sonrası 3 dakika boyunca 65 ° C'de ve 10 dakika boyunca 95 ° C'de pişirmeye devam edin.
   2. İkinci SU-8 2025 katmanını (40 μm) 1.500 rpm'de döndürün ve kabuk kanalı deseni için uygun CAD dosyasını yükleyerek pozlayın.
      NOT: Yumuşak ve pozlama sonrası fırınlar önceki adıma benzerdi.
   3. 50 μm yüksekliğe ulaşmak için üçüncü SU-8 2025 katmanını 1.400 rpm'de döndürün ve yukarıdaki işlemi tekrarlayın, ancak yağ fazı için yapıları açığa çıkarın.
   4. Maruz kalmayan tüm fotodirenç çıkarılana kadar SU-8 geliştiricisine daldırarak kalıbı üç katmanla birlikte tek bir adımda geliştirin.
   5. Yapışmayı iyileştirmek ve geliştirmeden sonra ortaya çıkabilecek küçük çatlakları kapatmak için kalıbı 160 ° C'de sıcak bir plakada 10 dakika boyunca sert bir şekilde pişirin.
   6. Bir sonraki adımda elastomer yapışmasını önlemek için kalıbı klorotrimetilsilana maruz bırakın ve kullanıma kadar 15 cm Petri kaplarına yerleştirin.
3. Ayrışma cihazı kalıbını Şekil 1D ve Şekil 2B'de açıklandığı gibi hazırlayın. İstenilen yüksekliğe sahip yapılar elde etmek için 1.2.3 adımında daha önce açıklandığı gibi, bir silikon gofret üzerinde bir kat SU-8 fotodirenci döndürün: 50 μm. Yumuşak ve maruz kalma sonrası pişirme, geliştirme ve sert pişirmeyi önceki adıma benzer şekilde yapın.
   NOT: Bir dizi üçgen şekilli direk tüm odayı kapladı ve oda genişliği çıkışa doğru azaldıkça direkler arasındaki boşluk azaldı. Üçgen direkler, 400 μm (girişte) ila 30 μm (çıkışta) arasında değişen bir aralıkla yan başına 200 μm idi.
4. Kalıpları polidimetilsiloksan (PDMS) kullanarak yumuşak litografi ile hazırlayın.
   1. PDMS elastomer baz ve elastomer kürleme maddesini gezegensel bir santrifüjde 10:1 w/w oranında karıştırın. 3-4 mm'lik bir tabaka oluşturmak için karışımı hem mikrokapsülleme ana kalıplarına hem de ayrışma ana kalıbına dökün.
      NOT: 50 g elastomer baz ile 5 g kürleme maddesi karışımı, 3 mm kalınlığındaki bir ana kalıbı örtmek için yeterlidir.
   2. Kürlenmemiş PDMS'nin gazını gidermek için kalıpları içeren Petri kaplarını 15 dakika boyunca vakumlu bir kurutucuya yerleştirin.
   3. Petri tabaklarını bir fırına taşıyın ve en az 60 dakika boyunca 80 ° C'de pişirin.
   4. Ana kalıpları fırından çıkarın ve soğumalarını bekleyin. Hassas bir bıçak kullanarak, gofret şeklini takip ederek PDMS'yi dikkatlice kesin ve PDMS parçalarını ana kalıptan çıkarın.
   5. Her cihazın kenarlarını bir neşterle keserek PDMS plakalarını kesin, ardından ayrışma cihazındaki ve yalnızca üst mikroakışkan cihazdaki giriş/çıkış akışkan portlarını paslanmaz çelik iğneler kullanarak delin. Kirlenmeyi önlemek için cihazları sihirli bantla örtün.
      NOT: İğne ölçer, giriş ve çıkış portları için sırasıyla 14 G ve 15 G'dir.
   6. Yapıştırma için, üst ve alt PDMS parçalarının desenli taraflarını₂ dakika boyunca bir plazma kazıyıcı üzerinde O2 plazma ile tedavi edin.
   7. Doğrudan mikro kanallara (2 μL) ince bir ayırıcı damıtılmış su tabakası ekledikten sonra her iki PDMS parçasını da bir stereoskop altında hizalayın.
   8. Yapıştırmayı tamamlamak ve PDMS'yi orijinal hidrofobik durumuna geri yüklemek için hizalanmış PDMS cihazını gece boyunca 80 ° C'de fırına yerleştirin. Daha fazla kullanana kadar cihazları saklayın.
      NOT: Bu, çekirdek için 120 μm, kabuk için 200 μm ve yağ kanalları için 300 μm olmak üzere üç farklı yüksekliğe sahip koaksiyel akış odaklama cihazı ile sonuçlanır.
   9. Plazma bağlanmasından hemen sonra cihazı kullanmak için, hidrofobik kaplama elde etmek için sıvı kanallara dikkatli ama sıkı bir şekilde 30 μL hidrofobik kaplama çözeltisi enjekte edin. Daha sonra, cihazda hidrofobik kaplama çözeltisinin kalıntıları gözlenmeyene kadar havayı derhal kanallara boşaltın.
   10. Ayrışma cihazını, önce cihazın desenli tarafını ve temizlenmiş bir slayt camını_O2 plazma ile 2 dakika boyunca işlemden geçirerek bağlayın ve daha sonra gece boyunca 80 ° C'de fırında daha fazla kürlenme için birleştirin.
       NOT: Cihazlar daha fazla kullanıma kadar saklanabilir.

2. Çözeltilerin hazırlanması

1. Stok çözümleri. İlk olarak, gerçek kullanım için daha düşük konsantrasyonlara seyreltilecek stok çözeltileri (konsantre çözeltiler) hazırlayın.
   NOT: Stok çözümleri, hazırlık süresinden tasarruf etmek, malzemeleri korumak, depolama alanını azaltmak ve daha düşük konsantrasyonlarda bir çalışma çözeltisi hazırlarken doğruluğu artırmak için kullanılır.
   1. 30 mL 2x çekirdek çözeltisi (%16 PEG ve %34 yoğunluk gradyan ortamı) hazırlayın: 4,8 g 35 kDa PEG, 10,2 mL yoğunluk gradyan ortamı ve 19,8 mL DMEM/F12 ortam karıştırın. Bu çekirdek çözeltiyi 0,22 μm şırınga filtresi kullanarak filtreleyin.
   2. % 3 yüzey aktif madde ile 50 mL mineral yağ hazırlayın: 48.5 mL mineral yağ ve 1.5 mL yüzey aktif madde karıştırın. 0,22 μm şırınga filtresinden filtrasyondan sonra steril bir durumda tutun.
   3. % 0.5 yüzey aktif madde ile 50 mL mineral yağ hazırlayın: 49.75 mL mineral yağ ve 0.25 mL yüzey aktif madde karışımı. Steril bir durumda tutun.
   4. 1 M Ditiyoteritol (DTT) hazırlayın: 1.5425 g DTT'yi 10 mL damıtılmış suda çözün. Steril bir durumda tutun.
   5. 1 M Trietanolamin (TEA) hazırlayın: 433.6 μL damıtılmış suya 66.4 μL çay ekleyin. Steril bir durumda tutun.
   6. % 1 Pluronik F127 (PF127) hazırlayın: 10 mL damıtılmış suda 100 mg PF127 çözün. Steril bir durumda tutun.
2. Çalışma çözümleri
   1. 4,5 mL mineral yağı% 3 yüzey aktif madde ve 300 μL 1 M DTT (1:15 oranı) ile karıştırarak bir çapraz bağlayıcı emülsiyonu hazırlayın. 2 dakika boyunca çözeltiyi vorteks edin ve 20 ° C'de ultrasonik bir banyoda 45-60 dakika boyunca sonikat. Bu çözeltiyi 27 G iğneli 5 mL'lik bir şırıngaya yükleyin.
      NOT: Emülsiyon, sonikasyon yağı / su karışımı ile üretilir.
   2. Mineral yağı% 0,5 yüzey aktif madde ile 27 G iğneli 5 mL'lik bir şırıngaya yükleyerek koruyucu yağ çözeltisi hazırlayın.
   3. % 8 w / v çözeltisi oluşturmak için 400 μL 1x DPBS'ye 32 mg PEG-4-Mal ekleyerek kabuk (% 8 w / v PEG-4-Mal ve 15 mM TEA) çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi 2 dakika boyunca vorteksleyin. Daha sonra, 6 μL 1 M TEA ekleyin (son konsantrasyon 15 mM TEA). Son olarak, bir spin filtresinden 5 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüj yapın ve 30 dakika boyunca rocker üzerinde karanlıkta tutun. Ardından, bu çözeltiyi 27 G'lik bir iğne ile 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin.
      NOT: Kapağı açmadan önce PEG-4-Mal kabını oda sıcaklığında 10 dakika bekletin ve kapağı kapatmadan önce O_2'yi N2 ile değiştirmek için_N2 gazını üfleyin. Çözüme eklemeden önce Vortex TEA.
3. Çekirdek çözeltide hücre süspansiyonunu hazırlayın
   1. hPSC'lere 37 °C'de 5 ila 10 dakika boyunca tripsin uygulayın. Sonra onları plakalardan toplayın. Tripsini hücre ayrılmasından sonra ortamla söndürün ve ardından hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
   2. Toplu hücre süspansiyonunu santrifüj edin (400 x g, 5 dakika). Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve daha sonra minimum hacimli bir büyüme ortamı kullanarak hücre peletini yeniden askıya alın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
      NOT: Tipik hücre alikotları 12-20 x 10⁶ hücre içerir ve çekirdek çözeltinin 400 μL'sini yapmak için yeterlidir.
   3. Toplu hücre süspansiyonundan 12-20 x 10⁶ hücre alın ve hücre/ortam süspansiyonunu santrifüj edin (400 x g, 5 dakika).
   4. Hücre peletinden medyayı dikkatlice aspire edin. Ardından, 200 μL ortam ve 200 μL 2x PEG çözeltisi (son konsantrasyon 30-50 x 10⁶ hücre / mL) ekleyin ve yavaşça karıştırın.
      NOT: Düşük hücre konsantrasyonları (20 x 10⁶ hücre / mL'den az) birçok boş kapsülle sonuçlandı.
   5. Çözeltiye 30 μL% 1 PF127 ekleyin.
   6. 1 mL'lik bir şırıngaya bir mikro karıştırıcı çubuğu (2 mm x 7 mm) yerleştirin ve ardından çekirdek çözeltisi içeren hücreyi 27 G'lik bir iğne ile şırıngaya yükleyin. Tüm kapsülleme işlemi sırasında çözeltiyi buzla soğuk tutun.

3. Deney düzeni

1. Yapıştırılmış PDMS damlacık cihazını, dört adet 20 cm uzunluğunda ve bir parça 5 cm uzunluğunda giriş mikro tüpleri (0,38 mm ID. x 1,1 mm O.D.), bir parça 10 cm çıkış tüpü (0,5 mm ID x 1,5 mm O.D.) ve altı adet 0,5 cm bağlantı tüpünü (1 mm ID. x 1,8 mm O.D.) mikrop öldürücü bir ışık kaynağının (tipik olarak biyolojik güvenlik dolaplarına yerleştirilmiş) altına yerleştirin ve 30 adet sterilize edin min.
2. Boruyu akışkan giriş portlarına ve ayrışma portlarına sığdırmak için forseps kullanın.
3. Kabuk, yağ, çapraz bağlayıcı emülsiyon girişleri için üç adet 20 cm uzunluğunda giriş mikrotüpü ve ayrışma cihazının girişi için bir parça kullanın. Ardından, tüplerin karşı ucunu ilgili çözelti ile şırınganın iğnesine yerleştirin. Bu arada, mikroakışkan cihazın çekirdek girişini ve ayrışma cihazının çıkışını 5 cm'lik bir mikrotüp ile bağlayın (Şekil 1C).
   NOT: Giriş mikrotüpleri, son adımda yerleştirilen bağlantı tüplerinin içine sıkıca sabitlenmelidir.
4. Akışkan çıkış portuna bir çıkış tüpü yerleştirin ve karşı ucu bir toplama haznesine yerleştirin.
5. Cihazı mikroskop aşamasına yerleştirin ve hareket etmesini önlemek için boruyu takın. Akış denetimi için mikroskobu cihaz nozuluna hizalayın ve odaklayın.
6. Her şırıngayı farklı şırınga pompalarına yerleştirin ve düzgün bir şekilde sabitleyin (Şekil 1B). Her pompayı üreticinin protokollerine göre aşağıdaki akış hızlarına göre programlayın: çekirdek (3-5 μL/dak), kabuk (3-5 μL/dak), koruyucu yağ (20-80 μL/dak) ve çapraz bağlama yağı (40-60 μL/dak). Tüm pompalarda akışı başlatın.
7. Her sıvının cihaza girmesini bekleyin ve kalan havayı dışarı iterken kanalları doldurun.
   NOT: Giriş borusunda çok miktarda hava varsa, hava tamamen çıkarılana kadar her akış hızını geçici olarak artırın. Aşırı akış hızının PDMS'den PDMS'ye bağ hatasına yol açabileceğini unutmayın.
8. Kapsül oluşumu stabilize edildiğinde (Şekil 3), toplama tüpünün karşı ucunu 5 mL mTeSR ortamına sahip yeni bir konik tüpe yerleştirin.
   NOT: Ortam 10 μM ROCK inhibitörü, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin içerir.
9. Yeterli sayıda kapsül toplandıktan sonra, 10 dakika boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C'de inkübe edin. Yağ fazında bulunan kapsüller tüpün tepesinde olacaktır (bkz. Şekil 4A). Tüpe hafifçe dokunmak, kapsüllerin dibe çökelmesine neden olur. Bundan sonra, yağ ve ortamın çoğu aspire edilebilir.
10. Kapsülleri konik tüpün dibinden toplayın, bir hücre süzgecine (100 μm gözenek boyutu) yerleştirin ve bol miktarda ortamla yıkayın. Daha sonra, 6 delikli bir kültür plakasında 2 mL medya kullanarak mikrokapsülleri toplayın ve medyayı kuyu plakasının üzerine ters çevrildiği için filtreden geçirin (bkz. Şekil 4A).

4. Mikrokapsüllerde hPSC kültürü ve analizi

1. Temel kültür
   1. Kök hücre kapsüllerini, 37 ° C'de% 5 CO 2 ile 6 delikli bir tabak kültür kabında_{inkübe edin}.
   2. Kapsülleri bir hücre süzgeci filtresinde toplayarak, fazla medya ile yıkayarak ve adım 3.10'da yapıldığı gibi 2 mL ortama sahip 6 delikli plakalarda yeni bir kuyuya geri döndürerek medyayı her gün değiştirin.
   3. Kapsülleri en az 10 gün boyunca kültürleyin.
2. Kapsüllenmiş kök hücrelerin yaşayabilirliğini belirlemek için canlı / ölü tahlilini yapın.
   1. Canlı / ölü tahlil çözeltilerini (ethidium homodimer-1 ve calcein AM) çözün.
   2. 2 mL steril DPBS'ye 2 μM ethidyum homodimer-1'in 4 μL'sini ve 4 μM kalsein çözeltilerinin 1 μL'sini ekleyin. Tam karıştırma sağlamak için vorteks.
   3. Bir hücre süzgeci üzerinde yaklaşık 100 mikrokapsül toplayın ve ortamın kapsüllerden dışarı difüzyonuna izin vermek için steril DPBS ile durulayın.
   4. Adım 4.2.2'de hazırlanan çözeltinin 1 mL'sini kullanarak bunları tekrar 12 kuyucuklu bir kültür plakasına toplayın. 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   5. Hücreleri floresan mikroskobu altında görselleştirin.
      NOT: Hücre canlılığı, yeşil olarak görselleştirilen canlı hücrelerin toplam hücre sayısı içindeki yüzdesinin hesaplanmasıyla ölçülür.
3. Küresel boyut karakterizasyonu.
   1. İstenildiğinde, kuyu plakasını mikrokapsüllerle mikroskop altına yerleştirin ve ilgili yazılımda gösterilen sferoidlerin çapını uygun ölçek çubuklarıyla ölçün.
   2. Küresel boyutu ölçün ve analiz edin.

Results

Yukarıda belirtilen protokolü izleyerek, okuyucu mikroakışkan cihazlar üretebilecek ve hücre taşıyan mikrokapsüller üretebilecektir. Şekil 3A , mikroakışkan damlacık üretimi kullanılarak üretilen optimal ve yetersiz mikrokapsüllerin örneklerini göstermektedir. PEG-4-Mal'ın farklı formülasyonları, farklı morfolojilere sahip kapsüllerle sonuçlandı - buruşuk kapsüller zayıf jelasyon, düşük mekanik bütünlük ile ilişkiliydi ve karıştırılmış bir biyoreaktörde ekime dayanamadı. PEG içeriğinde gözle...

Discussion

Burada açıklanan kapsülleme işlemi, hPSC sferoidlerinin tekrarlanabilir oluşumu ile sonuçlanır. Mikrokapsül formatı, farklılaşma protokollerini iyileştirmeyi / optimize etmeyi veya tedavileri test etmeyi amaçlayan deneyler için sferoidlerin bir mikrotitre plakasının kuyucuklarına dağıtılmasını kolaylaştırır. Kapsüllenmiş kök hücre sferoidleri, hidrojel kabuğun hücreleri kesme kaynaklı hasara karşı koruduğu süspansiyon kültürlerinde de kullanılabilir⁷.

Protokol içinde bi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 ve mikro; m Şırınga Filtreleri	Genesee Scientific	25-244
1 ml şırınga luer-kilit ucu	BD	309628
1x DPBS	Corning	23220003
4 kollu PEG maleimid, 10kDa	Laysan Inc.	164-68
5 ml şırınga luer-kilit ucu	BD	309646
6 KUYULU İŞLEM GÖRMEMIŞ PLAKA	ABD Scientific	CC7672-7506
Aquapel Aplikatör Paketi	Aquapel Cam Tedavisi	47100
CAD yazılımı	Autodesk	AutoCAD v2020
HÜCRE SÜZGECİ 100 & m gözenek boyutu	kardinal	335583
Klorotrimetilsilan	Aldrich	386529-100mL
Kontes II FL Otomatik Hücre Sayacı Yaşam	teknolojisi	A27974
Dijital sıcak plaka	Dataplate
Dijital girdap karıştırıcı	Fisher Scientific	215370
Damıtılmış su	Gibco	15230-162
Ditiotheritol (DTT)	Sigma	D0632-10G
DMEM / F12 medya	gibco	11320-033
Falcon 15 mL Konik Santrifüj Tüpleri	Fisher scientific	14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Mikrosantrifüj	canlı	13-100-675
HERACELL VIOS 160i CO2 İnkübatör	Thermo Scientific	50144906
Ters Floresan Motorlu Mikroskop	Olympus	Olympus IX83
Laurell Spin Kaplayıcılar	Laurell Technologies	WS-650MZ-23NPPB
Canlı/Ölü memeli boyama kiti	Fisher	L3224
Sihirli bant	Zımba	483535
Mikro Tıbbi Boru (0.015 "ID x 0.043" OD)	Scientific Commodities, Inc	BB31695-PE / 2
Mikro karıştırma çubuğu	Daigger Scientific	EF3288E
MilliporeSigma Filtre Forseps	Fisher bilimsel	XX6200006P
Mineral yağ	Sigma	M8410-1L
mTeSR 1 Bazal Orta	KÖK HÜCRE TEKNOLOJİSİ	85850
İğneler-Paslanmaz Çelik  14 Gauge	CML kaynağı	901-14-025
İğneler-Paslanmaz Çelik  15 Gauge	CML kaynağı	901-15-050
OptiPrep	STEMCELL TEKNOLOJİSİ	7820
Fırın	Thermo Scientific	HERA THERM Fırın Penisilin
:Streptomisin (10.000 U/mL Penisilin G, 10mg/mL Streptomisin)	İkizler	400-109
Petri Çanak 150X20 Steril Havalandırma	Sarstedt, Inc.	82.1184.500
Plazma Temizleme Sistemi	Verim Mühendislik Sistemi, Inc.	EVET-G500
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
Poli (etilen glikol) 35kDa	Sigma	94646-250G-F
PrecisionGlide İğne 27G	BD	305109
Kaya inhibitörü Y-27632 dihidroklorit	SELLECK CHEM	S1049-10mg
Silikon gofret 100mm	Üniversite Gofret	452
Sürgülü cam (75 mm ve akut; 25 mm)	CardinalHealth	M6146
Açıklık 80	Sigma	S6760-250ML
SpeedMixer	Thinky	ARE-310
Spin-X Santrifüj Tüp Filtresi (0.22 ve mikro; m)	Costar	8160
SU-8 2025	Kayaku İleri Malzemeler	Y111069 0500L1GL
SU-8 geliştirici	Kayaku İleri Malzemeler	Y020100 4000L1PE
Cerrahi Tasarım Royaltek Paslanmaz Çelik Cerrahi Neşter Bıçakları	fisher scientific	22-079-684
SYLGARD TM 184 Silikon Elastomer Kiti (PDMS)	Dow Corning	2065622
Şırınga pompası	New Era Pump System, Inc	NE-4000
Trietanolamin	Sigma-aldrich	T58300-25G
TrypLE Express	Gibco	12604-013
Tygon Boru (0.02 "ID x 0.06" OD)	Cole-Parmer	06419-01
Tygon Boru (0.04" ID x 0.07" OD)	Cole-Parmer	06419-04
Ultrasonik temizleyici FS20D	Fisher Scientific	CPN-962-152R
Vakumlu kurutucu	Bel-Art	F42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Stereo Mikroskop 8x-32x	ZEISS	435421-0000-000
μ PG 101 lazer yazıcı	Heidelberg Instruments	HI 1128