Yöntem makalesi

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

DOI:

10.3791/62949

⸱

5 Ağustos 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, Bucknell University, 2Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetik gen regülasyonunun bir formu olan DNA metilasyonu, normal hücresel fonksiyon için önemlidir. Hücrelerde, DNA metiltransferazlar (DNMT'ler) adı verilen proteinler, DNA metilasyon paternini oluşturur ve korur. Normal DNA metilasyon paternindeki değişiklikler, kanser gelişimi ve ilerlemesi ile bağlantılıdır ve DNMT'leri potansiyel kanser ilacı hedefleri haline getirir. Bu nedenle, bu enzimlerin yeni küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanması ve karakterize edilmesi büyük önem taşımaktadır. Bu yazıda DNA metiltransferaz inhibitörlerinin taranmasında kullanılabilecek bir protokol sunulmaktadır. Sürekli eşleşmiş kinetik tahlil, potansiyel küçük molekül inhibitörlerinin varlığında ve yokluğunda DNA metilasyonunun başlangıç hızlarının belirlenmesini sağlar. Tahlil, bir hemimetillenmiş DNA substratının metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için metile duyarlı endonükleaz Gla I'i kullanır.

Bu sürekli tahlil, enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Tahlilin mikrotitre plakalarında küçük hacimlerde yapılması, reaktiflerin maliyetini azaltır. Bu tahlil kullanılarak, insanlarda en bol DNMT izozimi olan DNMT1 inhibitörleri için küçük bir örnek tarama yapıldı. Yüksek oranda ikame edilmiş antrakinon doğal ürünü olan lakkaik asit A, DNMT1'in güçlü, DNA ile rekabet edebilecek bir inhibitörüdür. Burada, tahlil protokolünü tanımlamak için üç potansiyel küçük molekül inhibitörünü - antrakinonlar veya bir ila üç ikame maddeli antrakinon benzeri moleküller - iki konsantrasyonda inceliyoruz. Başlangıç hızları, her molekülün varlığında gözlenen yüzde aktivitesini hesaplamak için kullanılır. İncelenen üç bileşikten biri, DNMT1 aktivitesinin konsantrasyona bağlı inhibisyonunu sergiler ve bu da DNMT1'in potansiyel bir inhibitörü olduğunu gösterir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA metilasyonu, gen ekspresyonunu ve kromatin yapısını düzenleyen önemli bir epigenetik işarettir. Metilasyon ağırlıklı olarak CpG dinükleotidlerinde meydana gelir - sitozin ve ardından guanosin; metil grubu, sitozinin 5 pozisyonuna eklenir. Uygun hücresel gelişim ve fonksiyon için doğru DNA metilasyon paternleri ve dolayısıyla uygun gen ekspresyonu gereklidir. Birçok hastalık durumu, normal metilasyon paterni 1,2,3'teki değişikliklerle ilişkilendirilmiştir. Örneğin, kanser başlangıcı ile ilerlemesi ve DNA metilasyon paternindeki değişiklikler arasında bir bağlantı vardır. Tipik olarak, kanser hücreleri, genom instabilitesine katkıda bulunan daha düşük genel metilsitozin seviyeleri sergiler. Aynı zamanda, genomda bulunan metilsitozin, tümör baskılayıcı genlerin promotör bölgelerinde yoğunlaşır ve bu da bu önemli proteinlerin gen susturulmasına yol açar. Özellikle, epigenetik değişiklikler, tümörigenez ile ilişkili DNA mutasyonlarının aksine, dinamik ve geri dönüşümlüdür. Bu, epigenetik gen regülasyonunda yer alan proteinleri ilginç ilaç hedefleri 2,4 haline getirmiştir.

DNA metiltransferazlar (DNMT'ler), DNA metilasyon paternlerinin üretilmesinden ve korunmasından sorumlu proteinlerdir. Katalitik olarak aktif üç izozim, DNMT1, DNMT3a ve DNMT3b, insanlarda bulunur. Gelişim ve farklılaşma sırasında, de novo metiltransferazlar, DNMT3a ve DNMT3b, metilasyon paternleri oluşturur. Her iki enzim de katalitik olarak inaktif DNMT3L proteinini, artan aktivite 1,5 sergileyen kompleksler oluşturmak için bağlayabilir. Hücre bölünmesini takiben, yavru hücreler hemimetillenmiş DNA içerir - dubleksin sadece bir ipliğinde metilsitozin içeren DNA - çünkü yeni sentezlenen DNA metilasyon izlerinden yoksundur. DNMT1'in ana işlevi, bu hemimetillenmiş DNA'yı metillemek ve böylece tam metilasyon paterni 1,5'i yeniden oluşturmaktır.

DNMT aktivitesi ve kanser arasındaki bağlantılar iyi kurulmuştur. DNMT1'in transkripsiyonel veya post-translasyonel mekanizmalarla aşırı ekspresyonu, birkaç yaygın onkojenik yolunbir sonucudur 6,7,8,9. Hipomorfik aleller kullanarak DNMT1 aktivitesini düşürmeye yönelik genetik yaklaşımlar, Apc (Min) farelerde tümör oluşumunun azalmasına neden olur10. DNMT1'i deviren antisens oligonükleotidler hücre kültüründe neoplaziyi inhibe eder ve fare tümörü modelleri11,12. Bu nedenle, DNMT1 aktivitesini inhibe etmek umut verici bir kanser tedavisi yaklaşımı gibi görünmektedir. Bununla birlikte, DNMT3 izozimlerinin oynadığı roller o kadar basit değildir. DNMT3a mutasyonları akut miyeloid lösemi13 ve miyelodisplastik sendrom14'te bulunur. Tanımlanan mutasyonlardan en az birinin,enzim 15'in DNA metilasyon aktivitesini azalttığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, DNMT3b meme kanseri16 ve kolorektal kanser17'de aşırı eksprese edilir. Çeşitli DNMT izozimleri karsinogenezde farklı roller oynarken, izozime özgü inhibitörlerin tanımlanması kritik öneme sahip olacaktır. Bu bileşikler sadece terapötiklerin gelişimi için yararlı olmakla kalmayacak, aynı zamanda izozime özgü inhibitörler de her DNMT izoziminin kanser etiyolojisindeki rolünü incelemek için paha biçilmez bir araç olacaktır.

Literatürde çeşitli DNMT inhibitörleri bildirilmiştir. Bilinen DNMT inhibitörleri iki sınıfa ayrılabilir: nükleozid ve nükleozid olmayan. Nükleozid inhibitörleri tipik olarak sitidin analoglarıdır. 5-azasitidin ve 5-aza-2'-deoksisitidin miyelodisplastik sendrom ve akut miyeloid lösemi 4,18'in tedavisi için onaylanmıştır. Bu bileşiklerin yüksek toksisitesi, düşük biyoyararlanımı ve kimyasal instabilitesi sorun yaratmaktadır. Devam eden çalışmalar, yeni nesil nükleozid inhibitörlerinin etkinliğini incelemektedir; 5-aza-2'-deoksisitidinden türetilen SGI-110, bir örnek 19,20'dir. Nükleozid inhibitörleri izozime özgü değildir ve karşılaşılan herhangi bir DNMT izozimini inaktive eder. Bu nedenle, bir nükleozid demetilasyon ajanı ile tedavi, tüm DNMT izozimlerinin 4,18 tükenmesine neden olur. Nükleozid olmayan inhibitörlerin, inhibitör etkilerini göstermek için DNA'ya dahil edilmeleri gerekmez. Bunun yerine, bu moleküller doğrudan DNMT'lere bağlanır ve izozime özgü inhibisyon olasılığını ortaya çıkarır. SGI-1027 21, hidralazin 22, prokainamid23, RG108 ve türevleri 24 ve doğal ürünler, (-)-epigallocatechin 3-gallate (EGCG)25 ve lakkaik asit A26,27 dahil olmak üzere bugüne kadar çeşitli nükleozid olmayan inhibitörler keşfedilmiştir. Bugüne kadar keşfedilen nükleozid olmayan inhibitörlerin çoğu izozim seçici değildir veya bir DNMT izozimi için zayıf tercihler göstermektedir. Ek olarak, bu moleküllerin gücünün, özellikle 4,18 hücrelerinde iyileştirilmesi gerekir. Bu nedenle, daha güçlü, izoenzim seçici DNMT inhibitörlerini keşfetmeye veya geliştirmeye ihtiyaç vardır.

DNMT'lerin yeni küçük molekül inhibitörlerini keşfetmenin önündeki bir engel, DNMT aktivitesini incelemek için geleneksel olarak kullanılan zahmetli tahlillerdir28. Tahliller genellikle birden fazla adımda süreksizdir. DNMT'lerin enzimatik aktivitesi hala radyoaktif S-adenosil metiyonin (SAM) 29,30,31,32,33,34 kullanılarak rutin olarak test edilmektedir. DNA metilasyonu için radyoaktif olmayan testler de geliştirilmiştir. Örneğin, sindirim ürünlerini ayırmak için metile duyarlı kısıtlama endonükleazları ve elektroforez kullanan tahliller35,36 tanımlanmıştır. Bu tür süreksiz, çok adımlı analizler ilaç keşfine kolayca uygun değildir. 2000'li yılların ortalarından bu yana, daha yüksek verime sahip birkaç DNA metilasyon testi geliştirilmiştir28. DNMT1 inhibitörlerini taramak için bir sintilasyon yakınlık testi kullanıldı37. DNMT3a inhibitörleri 25,38'i taramak için metile duyarlı bir kısıtlama endonükleazı kullanan başka bir tahlil kullanıldı. Her iki tahlil de geleneksel DNA metilasyon tahlillerinden daha yüksek verime izin verirken, tahliller birden fazla adım gerektirir ve metilasyon aktivitesinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine izin vermez. Daha yakın zamanlarda, metilasyon reaksiyonunun bir ürünü olan S-adenosilhomosistein (SAH) oluşumunu, NADPH oksidasyonu39 ile ilişkili 340 nm'deki spektroskopik değişimle eşleştiren sürekli bir kinetik tahlil tanımlanmıştır. Bu tahlil, spektroskopik bir sinyal üretmek için üç bağlantı enzimi kullanır.

Ticari olarak temin edilebilen tek bir kuplaj enzimi kullanan ve gerçek zamanlı olarak veri üretebilen floresan bazlı endonükleaz kuplajlı DNA metilasyon testi geliştirdik (Şekil 1). Substrat olarak üç metilsitozin içeren bir saç tokası oligonükleotid kullanılır. Substrat DNA'sı 5' ucunda bir florofor ve 3' ucunda bir söndürücü içerir. Hemimetile CpG bölgesinin metilasyonu, endonükleaz Gla I - tamamen metillenmiş GCGC için bölünme bölgesini oluşturur. Gla I ürün oligonükleotidinin bölünmesi, floroforu söndürücüden serbest bırakır ve gerçek zamanlı olarak floresan üretir. Tahlil, DNMT'nin herhangi bir izoformunun aktivitesini incelemek için kullanılabilir; Bununla birlikte, DNMT1 ile daha yüksek aktivite gözlenir, çünkü bu izoenzim tercihen hemimetillenmiş DNA 1,5'i metilleştirir. Otoinhibitör Replikasyon Odakları Hedefleme Dizisi (RFTS) etki alanı DNMT1'den kaldırılırsa daha da sağlam etkinlik gözlenir. N-terminal düzenleyici bölgede bulunan bu alan, katalitik bölgeye bağlanır ve DNA bağlanmasını önler. İlk ~ 600 amino asidin uzaklaştırılması, tam uzunluktaki enzimden önemli ölçüde daha aktif olan kesilmiş bir enzimle sonuçlanır (kcat / Km'de ~ 640 kat artış)40. RFTS'den yoksun DNMT1 (amino asitler 621-1616) olarak adlandırılan enzimin bu aktif formu, artan katalitik gücü nedeniyle inhibitörlerin daha kolay tanımlanmasını sağlar. Bu makale, potansiyel küçük molekül inhibitörlerini taramak için RFTS'den yoksun DNMT1'i testlerde kullanmak için bir protokol sunmaktadır. Endonükleaz ile eşleşmiş sürekli tahlil kullanılarak, başlangıç hızı birkaç küçük molekülün varlığında ve yokluğunda belirlenir. Her potansiyel inhibitör, konsantrasyona bağımlı DNMT1 inhibisyonunu aramak için iki konsantrasyonda incelenir. Küçük moleküllerin varlığında gözlenen yüzde aktivitesi her durumda hesaplandı.

figure-introduction-1
Şekil 1: DNA metilasyon testi. Substrat olarak 5' ucunda bir florofor ve 3' ucunda bir söndürücü bulunan hemimetillenmiş bir saç tokası DNA'sı kullanılır. DNMT1, metil grubunun S-adenosilmetioninden metillenmemiş CpG bölgesine transferini katalize ederek S-adenosilhomosistein ve tamamen metillenmiş DNA üretir. DNA ürünü, tamamen metillenmiş GCGC bölgelerini parçalayan endonükleaz Gla I için bölünme bölgesini içerir. Ürün DNA'sının bölünmesi, 3' söndürücüden 5' floroforu serbest bırakarak floresan üretir. Kısaltmalar: Fl = florofor; Q = quencher; DNMT1 = DNA metiltransferaz 1; SAM = S-adenosilmetiyonin; SAH = S-adenosilhomosistein. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekran için tahlil çözümleri hazırlayın

NOT: Bu tahlilde kullanılan substratların konsantrasyonları uyarlanabilir. RFTS'siz DNMT1 için, saç tokası DNA substratı ve SAM için deneysel olarak belirlenen Km değerleri sırasıyla 1-2 nM ve 2 μM, 26,40'tır.

  1. Buz üzerindeki mikrosantrifüj tüplerinde test edilen her tahlil koşulunun 600 μL'sini hazırlayın.
    NOT: Gerekli tahlil çözümünün toplam hacmi, yürütülen çoğaltma sayısına bağlıdır. Her tahlil koşulu bu protokol için üçlü olarak çalıştırıldı.
    1. Son1xtampon konsantrasyonunu elde etmek için her tüpe ddH 2 O ve 5x metilasyon tamponu (250 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl 2, 500 mM potasyum glutamat, 5 mM ditiyotreitol (DTT),% 25 gliserol) ekleyin. 20 μM bileşiği içeren tahliller için, 472 μL ddH2O ve 120 μL 5x tampon ekleyin. 50 μM bileşik içeren tahliller için, 470 μL ddH2O ve 120 μL 5x tampon ekleyin.
    2. Her numuneye 3.15 μL 20 mg/mL sığır serum albümini (BSA) ekleyin.
    3. Her numuneye 2 μL 3.15 μM saç tokası DNA substratı ve 1.33 μL 4.75 mM SAM ekleyin.
      NOT: Tahlil çözeltisi karışımındaki substratların konsantrasyonu, istenen nihai konsantrasyonların 1.05 katıdır.
    4. Uygun numunelere 21 μM (10 mM'lik 1.26 μL) veya 52.5 μM (10 mM'lik 3.15 μL) nihai konsantrasyona inhibitör ekleyin. Bir kontrol numunesine eşdeğer miktarda dimetilsülfoksit (DMSO) ekleyin.
      NOT: Ekranda kullanılan inhibitör konsantrasyonu değişebilir. Maksimum nihai DMSO konsantrasyonu %≤5 (d/v) olmalıdır. %5'e (v/v) kadar DMSO konsantrasyonlarının tahlil26'da gözlenen aktivite üzerinde hiçbir etkisi yoktur.
  2. Çözeltileri vorteks (3.000 rpm) ile 3 s boyunca karıştırın. Çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneleri masa üstü mini santrifüjde (1.200 × g) birkaç saniye döndürün.
  3. Her tahlil çözeltisinin Aliquot 95 μL'si, siyah yarım alanlı 96 kuyucuklu bir plakada 6 ardışık kuyucuk içine (Şekil 2).
    NOT: Bu tarama testleri iki grup halinde gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, 20 μM inhibitör örneği (4 toplam koşul) incelendi, ardından 50 μM inhibitör örneği (4 toplam koşul) incelendi.

figure-protocol-1
Resim 2: Tahlil plakası kurulumu. Her tahlil çözeltisi, siyah 96 kuyucuklu plakada altı kuyucuk halinde alınır: DMSO kontrolü (mavi), bileşik 1 (yeşil), bileşik 2 (kırmızı) ve bileşik 3 (sarı). Hem RFTS'den yoksun DNMT1 hem de Gla I üç kuyuya eklenecek. Kontrol olarak, Gla I tek başına diğer üç kuyuya eklenecek. Kısaltmalar: RFTS = Replikasyon Odakları Hedefleme Dizisi; DNMT1 = DNA metiltransferaz 1; DMSO = dimetilsülfoksit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Elek için enzim çözeltileri hazırlayın

NOT: RFTS'den yoksun DNMT1, E. coli ile ifade edilebilir ve homojenliğe saflaştırılabilir. RFTS'den yoksun DNMT1 için ekspresyon ve saflaştırma prosedürleri daha önce41 olarak tanımlanmıştır. İhtiyaç duyulan enzimin hacmi, yapılan tahlillerin sayısına bağlıdır. Burada her sette dört farklı tahlil yapılmaktadır; her tahlil üçlü olarak tamamlanır.

  1. Her enzim çözeltisinin 75 μL'sini buz üzerindeki mikrosantrifüj tüplerinde hazırlayın.
    NOT: İki enzim çözeltisine ihtiyaç duyulacaktır. Bir çözüm DNMT1 ve Gla I içerecektir; diğeri sadece Gla I'i içerecektir.
    1. Son1xtampon konsantrasyonunu elde etmek için her tüpe ddH 2 O ve 5x metilasyon tamponu (250 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl 2, 500 mM potasyum glutamat, 5 mM DTT,% 25 gliserol) ekleyin. Gla I enzim çözeltisi için, 15 μL 5x tampon ve 58.8 μL ddH2O ekleyin. DNMT1 + Gla I enzim çözeltisi için, 15 μL 5x tampon ve 58.2 μL ddH2O ekleyin.
    2. 0.16 U/μL'lik son konsantrasyon için her çözeltiye 1.2 μL 10 U/μL Gla I ekleyin.
    3. DNMT1+Gla I çözeltisine 40 nM'lik son konsantrasyon için 0,6 μL 5 μM RFTS eksikliği olan DNMT1 ekleyin.
  2. Çözeltileri karıştırmak için hafifçe dokunun. Çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneleri masa üstü mini santrifüjde (1.200 × g) birkaç saniye döndürün.
  3. Her enzim çözeltisinin 12 μL'sini konik tabanlı 96 delikli bir plakada 6 kuyucuk halinde Aliquot (Şekil 3).

figure-protocol-2
Resim 3: Enzim plakası kurulumu. Gla I (gri) ve DNMT1 + Gla I (mavi) çözümlerinin her biri 96 delikli plakada altı kuyuya ayrılır. Çok kanallı bir pipet kullanarak, enzim aynı anda bir dizi tahlil çözeltisine eklenebilir. Her tahlil koşulu için (altı kuyu), üç kuyu DNMT1 + Gla I alacak ve üç kuyu sadece Gla I'i alacaktır. Kısaltma: DNMT1 = DNA metiltransferaz 1. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Tahlili çalıştırın ve verileri analiz edin.

  1. Plaka okuyucuyu önceden 37 °C'ye ısıtın. Tahlil çözeltilerini içeren siyah plakayı yerleştirin. Plakayı sallayın (5 s için 425 cpm'de çift yörünge) ve floresanı 485 nm uyarma dalga boyu ve 528 nm emisyon dalga boyu ile okuyun. Plakayı 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Alternatif olarak, floresan okumaları için uygun dalga boyu kesiklerine sahip filtreler kullanılabilir.
  2. Tahlil plakasını çıkarın. Her bir oyuğa 5 μL enzim çözeltisi ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
    NOT: Bir dizi numunenin aynı anda başlatılabilmesi için çok kanallı pipetler kullanın.
  3. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin. 30 dakika boyunca her 53 saniyede bir floresan kaydedin. Her okumadan önce plakayı sallayın (4 s için 425 cpm'de çift yörüngeli).
  4. Ortalama üçlü Gla I her durum için kontrol tahlilleri. RFTS eksikliği olan DNMT1 varlığında elde edilen üçlü izlerden ortalama Gla I içeren kontrol reaksiyonu izini çıkarın. Düzeltilen çoğaltmalar için ortalamanın ortalama ve standart hatasını belirleyin.
  5. Ortalama düzeltilmiş reaksiyon izini çizin ve başlangıç hızını belirlemek için ilk doğrusal kısmı bir çizgiye sığdırın.
  6. Bir bileşiğin varlığında gözlenen hızı, DMSO içeren kontrol reaksiyonunda gözlenen hıza bölerek ve 100 ile çarparak yüzde aktivitesini belirleyin.

4. Ek tahlil kontrolü - enzimlerin sıralı olarak eklenmesi

  1. Buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpünde 550 μL tahlil çözeltisi hazırlayın. 110 μL 5x metilasyon tamponu, 3.88 μL 3.15 μM saç tokası DNA substratı, 6.43 μL 47.5 mM SAM, 3.06 μL 20 mg/mL BSA ve 426.6 μL ddH2O ekleyin.
  2. Çözeltiyi 3 s boyunca vorteks (3.000 rpm) ile karıştırın. Çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneleri masa üstü mini santrifüjde (1.200 × g) birkaç saniye döndürün.
  3. Aliquot 90 μL tahlil çözeltisi siyah yarım alanlı 96 kuyucuklu bir plakada 6 ardışık kuyucuk içine alınır.
  4. DNMT1 enzim çözeltilerini buz üzerinde hazırlayın. Bir tüpe 4 μL 5x metilasyon tamponu, 0.76 μL 5 μM RFTS eksikliği DNMT1 ve 15.24 μL ddH2O ekleyin. Başka bir tüpe 4 μL 5x metilasyon tamponu ve 16 μL ddH2O ekleyin.
  5. Çözeltileri karıştırmak için hafifçe dokunun. Çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneleri masa üstü mini santrifüjde (1.200 × g) birkaç saniye döndürün.
  6. DNMT1 içeren çözeltinin 5 μL'sini, siyah yarım alanlı 96 delikli plakadaki üç kuyucuğa ekleyin. Diğer üç kuyucuğa tampon kontrol çözeltisinden 5 μL ekleyin.
  7. Mikrotitre plakasını 37 °C'ye ısıtılmış plaka okuyucuya yerleştirin. Plakayı sallayın (3 s için 425 cpm'de çift yörünge) ve floresanı 485 nm uyarma dalga boyu ve 528 nm emisyon dalga boyu ile okuyun. Sallamayı tekrarlayın ve 30 dakika boyunca her 60 saniyede bir okuyun.
  8. Tahlil plakası plaka okuyucusundayken, Gla I çözeltisini buz üzerinde hazırlayın. Bir mikrosantrifüj tüpüne 8 μL 5x metilasyon tamponu, 0.64 μL 10 U/μL Gla I ve 31.4 μL ddH2O ekleyin. Çözeltiyi karıştırmak için hafifçe dokunun. Çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneyi masa üstü mini santrifüjde (1.200 × g) birkaç saniye döndürün.
  9. Gla I çözeltisinin Aliquot 6 μL'si, konik tabanlı 96 kuyucuklu bir plakada 6 kuyucuk halindedir.
  10. İlk 30 dakikalık okumayı takiben, siyah plakayı plaka okuyucusundan çıkarın. 6 kuyucuğun hepsine 5 μL Gla I çözeltisi ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek, karıştırın.
    NOT: Tüm kuyuların aynı anda başlatılabilmesi için çok kanallı bir pipet kullanın.
  11. Siyah plakayı tekrar plaka okuyucuya yerleştirin. 35 dakika boyunca her 35 saniyede bir floresan kaydedin. Her okumadan önce plakayı sallayın (3 s için 425 cpm'de çift yörüngeli).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etkin DNMT1 bu analiz için bir önkoşuldur. RFTS'den yoksun DNMT1, E.coli'de eksprese edildi ve daha önce yayınlanmış prosedürleri takiben homojenliğe saflaştırıldı41. Saflaştırılmış enzimin aktif olduğundan emin olmak için, DNA metilasyon aktivitesini incelemek için süreksiz bir endonükleaz kuplajlı tahlil kullanıldı36. Bu tahlil, bir Sau3A1 bölünme bölgesine yerleştirilmiş tek bir hemimetillenmiş CpG ile 32 baz çifti dubleks DNA kullanır. Sau3A1, hemimetillenmiş s...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA metiltransferazların inhibitörlerini tanımlamak ve karakterize etmek için, enzimin aktivitesi ölçülmelidir. DNA metiltransferaz aktivitesini incelemek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Aktivite genellikle radyoaktivite kullanılarak izlenir; SAM'ın etiketli metil grubunun transferi 29,30,31,32,33,34 olarak ölçülebilir. Met...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmaya verdikleri destek için Bucknell Üniversitesi ve Kimya Bölümü'ne teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 Kuyulu Yarım Alan Siyah Düz Tabanlı Polistiren İşlem Görmemiş MikroplakaCorning3694
96 Kuyulu Polistiren Konik Alt PlakalarThermoFisher249570
Sığır Serum AlbüminiNEBB9000S
bileşik 1ChemBridge5812086tarama bileşiği; DMSO'da 10 mM bileşik 2'ye
yeniden süspanse edildiChemBridge6722175tarama bileşiği; DMSO'da 10 mM bileşik 3'e yeniden süspanse edildi
ChemBridge5249376tarama bileşiği; DMSO'da 10 mM'ye yeniden süspanse
DitiyotreitolSigmaD0632
Gla ISibEnzymeE494metile duyarlı endonükleaz
GliserolRPIG22025
Magnezyum KlorürSigmaM0250
Oligonükleotid (5'-FAM-CCTATGCGmCATCAGTTTTCTGATGmCGmCATAGG-3'-Iowa Siyah Söndürücü)IDTözel sentezlenmişdahili olarak söndürülmüş firkete DNA'sı (substrat)
Potasyum GlutamatSigmaG1501
S-adenosilmetiyoninSigmaA4377metil bağışlayan kofaktör (substrat)
Tris BaseRPIT60040
edildi Serisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 12 (2), 206-222 (2011).
  2. Hamidi, T., Singh, A. K., Chen, T. Genetic alterations of DNA methylation machinery in human diseases. Epigenomics. 7 (2), 247-265 (2015).
  3. Norvil, A. B., Saha, D., Dar, M. S., Gowher, H. Effect of disease-associated germline mutations on structure function relationship of DNA methyltransferases. Genes. 10 (5), 369(2019).
  4. Foulks, J. M., et al. Epigenetic drug discovery: targeting DNA methyltransferases. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 2-17 (2012).
  5. Goll, M. G., Bestor, T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 74, 481-514 (2005).
  6. Bigey, P., Ramchandani, S., Theberge, J., Araujo, F. D., Szyf, M. Transcriptional regulation of the human DNA Methyltransferase (dnmt1) gene. Gene. 242 (1-2), 407-418 (2000).
  7. Detich, N., Ramchandani, S., Szyf, M. A conserved 3'-untranslated element mediates growth regulation of DNA methyltransferase 1 and inhibits its transforming activity. Journal of Biological Chemistry. 276 (27), 24881-24890 (2001).
  8. MacLeod, A. R., Rouleau, J., Szyf, M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. Journal of Biological Chemistry. 270 (19), 11327-11337 (1995).
  9. Slack, A., Cervoni, N., Pinard, M., Szyf, M. DNA methyltransferase is a downstream effector of cellular transformation triggered by simian virus 40 large T antigen. Journal of Biological Chemistry. 274 (15), 10105-10112 (1999).
  10. Eads, C. A., Nickel, A. E., Laird, P. W. Complete genetic suppression of polyp formation and reduction of CpG-island hypermethylation in Apc(Min/+) Dnmt1-hypomorphic mice. Cancer Research. 62, 1296-1299 (2002).
  11. MacLeod, A. R., Szyf, M. Expression of antisense to DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 8037-8043 (1995).
  12. Ramchandani, S., MacLeod, A. R., Pinard, M., von Hofe, E., Szyf, M. Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA, methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 94 (2), 684-689 (1997).
  13. Ley, T. J., et al. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 363, 2424-2433 (2010).
  14. Walter, M. J., et al. Recurrent DNMT3A mutations in patients with myelodysplastic syndromes. Leukemia. 25 (7), 1153-1158 (2011).
  15. Russler-Germain, D. A., et al. The R882H DNMT3A mutation associated with AML dominantly inhibits wild-type DNMT3A by blocking its ability to form active tetramers. Cancer Cell. 25 (4), 442-454 (2014).
  16. Roll, J. D., Rivenbark, A. G., Jones, W. D., Coleman, W. B. DNMT3b overexpression contributes to a hypermethylator phenotype in human breast cancer cell lines. Molecular Cancer. 7, 15(2008).
  17. Nosho, K., et al. DNMT3B expression might contribute to CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 15 (11), 3663-3671 (2009).
  18. Erdmann, A., Halby, L., Fahy, J., Arimondo, P. B. Targeting DNA methylation with small molecules: what's next. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (6), 2569-2583 (2015).
  19. Chuang, J. C., et al. S110, a 5-Aza-2'-deoxycytidine-containing dinucleotide, is an effective DNA methylation inhibitor in vivo and can reduce tumor growth. Molecular Cancer Therapeutics. 9 (5), 1443-1450 (2010).
  20. Issa, J. J., et al. Safety and tolerability of guadecitabine (SGI-110) in patients with myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukaemia: a multicentre, randomised, dose-escalation phase 1 study. Lancet Oncology. 16 (9), 1099-1110 (2015).
  21. Datta, J., et al. A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation. Cancer Research. 69 (10), 4277-4285 (2009).
  22. Zambrano, P., et al. A phase I study of hydralazine to demethylate and reactivate the expression of tumor suppressor genes. BMC Cancer. 5, 44(2005).
  23. Lee, B. H., Yegnasubramanian, S., Lin, X., Nelson, W. G. Procainamide is a specific inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 280 (49), 40749-40756 (2005).
  24. Asgatay, S., et al. Synthesis and evaluation of analogues of N-phthaloyl-l-tryptophan (RG108) as inhibitors of DNA methyltransferase 1. Journal of Medicinal Chemstry. 57 (2), 421-434 (2014).
  25. Ceccaldi, A., et al. C5-DNA methyltransferase inhibitors: from screening to effects on zebrafish embryo development. Chembiochem. 12 (9), 1337-1345 (2011).
  26. Fagan, R. L., Wu, M., Chédin, F., Brenner, C. An ultrasensitive high throughput screen for DNA methyltransferase 1-targeted molecular probes. PLoS One. 8 (11), 78752(2013).
  27. Fagan, R. L., Cryderman, D. E., Kopelovich, L., Wallrath, L. L., Brenner, C. Laccaic acid A is a direct, DNA-competitive inhibitor of DNA methyltransferase 1. Journal of Biological Chemistry. 288 (33), 23858-23867 (2013).
  28. Eglen, R. M., Reisine, T. Screening for compounds that modulate epigenetic regulation of the transcriptome: an overview. Journal of Biomolecular Screening. 16 (10), 1137-1152 (2011).
  29. Holz-Schietinger, C., Matje, D. M., Reich, N. O. Mutations in DNA methyltransferase (DNMT3A) observed in acute myeloid leukemia patients disrupt processive methylation. Journal of Biological Chemistry. 287 (37), 30941-30951 (2012).
  30. Norvil, A. B., et al. Dnmt3b methylates DNA by a noncooperative mechanism, and its activity is unaffected by manipulations at the predicted dimer interface. Biochemistry. 57 (29), 4312-4324 (2018).
  31. Bashtrykov, P., Ragozin, S., Jeltsch, A. Mechanistic details of the DNA recognition by the Dnmt1 DNA methyltransferase. FEBS Letters. 586 (13), 1821-1823 (2012).
  32. Bashtrykov, P., et al. Targeted mutagenesis results in an activation of DNA methyltransferase 1 and confirms an autoinhibitory role of its RFTS domain. Chembiochem. 15 (5), 743-748 (2014).
  33. Berkyurek, A. C., et al. The DNA methyltransferase Dnmt1 directly interacts with the SET and RING finger-associated (SRA) domain of the multifunctional protein Uhrf1 to facilitate accession of the catalytic center to hemi-methylated DNA. Journal of Biological Chemistry. 289 (1), 379-386 (2014).
  34. Kanada, K., Takeshita, K., Suetake, I., Tajima, S., Nakagawa, A. Conserved threonine 1505 in the catalytic domain stabilizes mouse DNA methyltransferase 1. Journal of Biochemistry. 162 (4), 271-278 (2017).
  35. Bashtrykov, P., et al. Specificity of Dnmt1 for methylation of hemimethylated CpG sites resides in its catalytic domain. Chemistry & Biology. 19 (5), 572-578 (2012).
  36. Dolen, E. K., McGinnis, J. H., Tavory, R. N., Weiss, J. A., Switzer, R. L. Disease-associated mutations G589A and V590F relieve replication focus targeting sequence-mediated autoinhibition of DNA methyltransferase 1. Biochemistry. 58 (51), 5151-5159 (2019).
  37. Kilgore, J. A., et al. Identification of DNMT1 selective antagonists using a novel scintillation proximity assay. Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 19673-19684 (2013).
  38. Ceccaldi, A., et al. Identification of novel inhibitors of DNA methylation by screening of a chemical library. ACS Chemical Biology. 8 (3), 543-548 (2013).
  39. Duchin, S., Vershinin, Z., Levy, D., Aharoni, A. A continuous kinetic assay for protein and DNA methyltransferase enzymatic activities. Epigenetics & Chromatin. 8, 56(2015).
  40. Syeda, F., et al. The replication focus targeting sequence (RFTS) domain is a DNA-competitive inhibitor of Dnmt1. Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 15344-15351 (2011).
  41. Switzer, R. L., Medrano, J., Reedel, D. A., Weiss, J. Substituted anthraquinones represent a potential scaffold for DNA methyltransferase 1-specific inhibitors. PLoS One. 14 (7), 0219830(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

DNA MethylationDNA MethyltransferaseMethylation AssayFluorescence AssayEndonuclease Coupled AssayDNMT1 InhibitorsPlate ReaderGla I EnzymeSmall Molecule InhibitorsEpigenetic Regulation

İlgili makaleler