Tümör Makrodiseksiyonu ile Tümör İçeriğinin Arttırılması

Normal klinik tanı sürecinin bir parçası olarak toplanan ve klinik doku depolarında tutulan formalin-sabit parafine gömülü (FFPE) dokular, kanser araştırması da dahil olmak üzere insan araştırmaları için geniş bir kaynağı temsil eder¹. İnsan hastalığı hakkındaki anlayışımız derinleştikçe, daha önce morfolojik ve immünofenotipik özelliklere dayanan tek varlıklar olduğu düşünülen hastalıkların, aslında moleküler altyazı testleri gerektiren farklı moleküler alt tiplerden oluştuğu giderek daha açık hale gelmektedir. Sonuç olarak, bu alt tipleri ayırt edebilen yüksek duyarlılıklı genomik testler giderek daha önemli hale gelmiştir². FFPE dokuları, fiksasyonla ilgili sorunlar nedeniyle genomik tekniklerle zayıf bir şekilde uyumlu olmalarıyla ünlü olsa da, teknoloji ve protokoller geliştikçe, bu teknikler klinik olarak her yerde bulunan bu doku formatı ^3,4,5 ile giderek daha uyumlu hale gelmektedir. Bununla birlikte, FFPE dokuları genellikle tümör ve tümör dışı doku materyallerinin katkılarıdır, burada tümör dışı materyalin varlığı sıklıkla istenmeyen ve yüksek oranda mevcutsa, genomik analizlerin sonuçlarını önemli ölçüde zayıflatabilir ve etkileyebilir⁶. Gerçekten de, bu tür analizler için minimum% 60'lık bir tümör içeriği sıklıkla kullanılır; burada bu eşiğin altında kalan dokular, çalışma kriterlerini^7'yi yerine getirmesine rağmen dışlanabilir. Bu, hasta dokularının değerli olduğu ve yüksek sayılarda toplanmasının zor olduğu nadir hastalık ortamlarında özellikle sorunlu olabilir.

Makrodiseksiyon, normal doku miktarını azaltarak düşük tümör içeriğinin etkilerini en aza indiren bir yöntemdir³. Nükleik asit ekstraksiyonundan önce bu tür kafa karıştırıcı tümör dışı materyalin uzaklaştırılması, tümör yüzdesi içeriğini ve dolayısıyla ekstrakte edilen nükleik asitlerin tümör saflığını önemli ölçüde artırabilir. Doku rezeksiyonu kritik olarak, tümör bölgesinin kurul sertifikalı bir patolog tarafından yeni üretilen hematoksilin ve eozin (H & E) boyalı doku kesiti üzerinde tanımlandığı ve daire içine alındığı uzman patolojik incelemesine dayanır⁸. Dairesel H&E daha sonra sırasıyla istenmeyen ve hedef dokuların çıkarılmasına ve toplanmasına rehberlik etmek için kullanılır. Bu protokol, Mayo Clinic'teki AIDS ve Kanser Örnek Kaynağı (ACSR) Teknik Çekirdek Laboratuvarı'nda gerçekleştirilen patolojik incelemeden doku hasadına kadar makrodiseksiyon adımlarını açıklamaktadır.

Tüm örnekler onaylanmış Mayo Clinic IRB protokollerine (PR16-000507 ve PR2207-02) uygun olarak toplandı ve kullanıldı.

1. Numune hazırlama

1. Doku yüzdürme suyu banyosunu açın. Sıcaklığı 39 ° C'ye ayarlayın ve suyun sıcaklığa gelmesine izin verin. Ahşap toplama çubuklarını su banyosuna batırın.
2. Kesitlenecek FFPE doku bloklarını tanımlayın ve alın.
3. Ön etiketli mikroskop, solvent yıkamalarına dayanabilen histoloji sınıfı kalıcı bir işaretleyici kullanarak kayar.
4. FFPE bloklarını kesmek için bir mikrotom kullanın. Her blok için bölüm başına 4-5 μm kalınlığında en az 2 tam yüzlü kesit kesin (Şekil 1A).
5. Doku kesitlerinin yeni kesilmiş şeridini, slayt montajı için önceden ısıtılmış doku yüzdürme banyosuna aktarın (Şekil 1B, C).
   NOT: Ilık su, bölümlerdeki kırışıklıkların "ütülenmesine" yardımcı olur (Şekil 1C).
6. Her bölümü sırayla ele alarak, tek bir bölümü şeritten ayırmak için forseps kullanın (Şekil 1D).
7. Önceden etiketlenmiş bir mikroskop slaytındaki tek bölümü toplayın.
   1. Mikroskop slaytını bölümün altındaki bir açıyla daldırın ve slaytı, doku bölümünün kenarı slayta temas edecek şekilde konumlandırın (Şekil 1E).
   2. Doku bölümüyle temas ettikten sonra, doku bölümünün sudan çıkarken kaydırağa karşı aynı hizada düzleşmesini sağlamak için sürgüyü yavaşça yüzdürme banyosundan dışarı çekin (Şekil 1F).
8. Slayt başına 1 doku kesiti takın ve tüm bölümler toplanana kadar tekrarlayın.
9. Kızağa monte edilmiş doku kesitlerinin oda sıcaklığında (RT) iyice kurumasını bekleyin.

2. Patolojik inceleme

1. Her blok⁹ için bir temsili doku kesitinde H&E boyama işlemi gerçekleştirin.
2. Yeni boyanmış H&E'leri kurul onaylı bir patolog tarafından patolojik incelemeye gönderin.
   NOT: İnceleme sırasında, patolog her dokudaki tümör içeriğinin yüzdesini belirler ve kaydeder ve her H&E slaytındaki tümör alanını çevreler (bkz. Şekil 2 ve Şekil 3, Satır 1). Tablo 1, Şekil 3, Satır 1'de gösterilen A-E örnekleri için H&E'nin patolojik incelemesi sırasında belirlenen hücreselliğe göre tümör içeriğinin yüzdesini özetlemektedir. %<60 tümör içeriğine sahip kesitler makrodiseksiyon^{gerektirir 7}. Nükleik asit ekstraksiyonu için gereken bölüm sayısı, daire içine alınmış tümör alanının büyüklüğüne bağlıdır. Protokolün 1. bölümünde yetersiz bölümler kesilmişse ve daha fazla kesim mümkünse, ek bölümlerin kesilmesi gerekebilir.

3. Deparafinizasyon

1. Bir duman davlumbazında, iki cam vitray kabı seyreltilmemiş histoloji sınıfı d-Limonen veya d-Limonen bazlı bir çözücü ve seyreltilmemiş 200 geçirmez moleküler sınıf etanol ile 1 cam vitray kabı önceden doldurun.
   DİKKAT: D-Limonen'in cilt ve gözlerle temasından kaçının, buhar veya buğunun solunmasından kaçının ve tutuşma kaynaklarından uzak tutun. Etanol'ü ısıdan, kıvılcımlardan ve açık alevlerden uzak tutun, dökülmekten ve cilt veya gözlerle temasından kaçının, iyi havalandırın ve buharları solumaktan kaçının.
   NOT: Bulaşıkları rafa kaldırılmış slaytları suya batıracak kadar doldurun (Şekil 4A); Gösterilen 20 slaytlı boyama kaplarını doldurmak için 250 mL gereklidir. Her 40 slayttan sonra d-Limonen ve etanol yıkamalarını değiştirin. D-Limonen (C 10 H 16), histolojik metodolojilerde daha yaygın hale gelen ve ekstraksiyon sonrası iyi kalitede nükleik asit veren ksilene alternatif, benzer şekilde etkili ve daha az toksik bir mum giderme ajanıdır^{10,11,12,13,14}. Bu protokol daha biyo-dostu alternatifler kullanılarak yapılabilmesine rağmen¹⁵, eğer varsa, ekstrakte edilen nükleik asit kalitesi üzerindeki etkileri belirlenmeye devam etmektedir.
2. Lekesiz FFPE dokusuna monte edilmiş slaytları cam Coplin slayt raflarına yerleştirin (Şekil 4A, giriş).
3. raflı slaytları 2 dakika boyunca d-Limonene yıkama 1'e batırın; ilk 20 saniye boyunca hafifçe ajitasyon yapın.
   NOT: Yıkamalar arasında taşınmayı en aza indirmek için, kızakların rafını yıkamadan çıkarırken, fazla yıkamayı gidermek için rafın tabanını kağıt mendil üzerine hafifçe yapıştırmadan önce rafın kısa bir süre boşalmasına izin verin.
4. raflı slaytları seyreltilmemiş D-Limonene yıkama 2'ye 2 dakika batırın; ilk 20 saniye boyunca hafifçe ajitasyon yapın. Rafı çıkarın, boşaltın ve tekrar sokun.
5. raflı slaytları 2 dakika boyunca etanol yıkamaya batırın; ilk 20 saniye boyunca hafifçe ajitasyon yapın. Rafı çıkarın ve boşaltmak için emici bir doku üzerine yerleştirin. Slaytların en az 10 dakika, ancak en fazla 2 saat boyunca hava ile kurumasına izin verin.

3. Makrodiseksiyon

1. Tezgahta, bir Coplin cam kavanozu DNaz / RNase içermeyen suda 50 mL% 3 gliserol ile doldurun
   NOT: Her 40 slayttan sonra gliserol yıkamayı değiştirin.
2. 1,5 mL mikrotüpleri mikrotüp başına 160 μL doku sindirim tamponu ile önceden etiketleyin ve önceden doldurun.
   NOT: Makrodiseksiyondan sonra gerçekleştirilen nükleik asit ekstraksiyonlarında DNA/RNA FFPE ekstraksiyon kiti kullanılmıştır (Malzeme Tablosu). Böylece, bu protokolde kullanılan doku sindirim tamponu, 10 μL Proteinaz K ve 150 μL PKD tamponundan oluşuyordu.
3. H&E üzerindeki patolojik işaretleri deparafinize doku slaytlarının arkasına kadar izleyin.
   NOT: Deparafinize edilmemiş dokularla karşılaştırıldığında (Şekil 3, Satır 2 ve Şekil 4B), deparafinize dokular beyazdır ve oldukça görünürdür (Şekil 3, Satır 3 ve Şekil 4C). Makrodiseksiyona izin veren, deparafinize doku özelliklerinin bu yüksek görünürlüğü ve ayırt edilebilirliğidir. H&E'yi tezgahın üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve deparafinize slaytın ön tarafını eşleşen patologun H&E'nin gözden geçirdiği arkaya doğru yerleştirin (Şekil 4D). Deparafinize dokuyu H&E dokusu ile hizalayın (Şekil 4E). Patologun işaretlerini izlemek, makrodiseksiyon sürecinde kritik bir adımdır ve bu işaretlerin mümkün olduğunca doğru bir şekilde çoğaltılmasına özen gösterilmelidir. Bu, B, D ve E örnekleri gibi küçük ve/veya bağlantısı kesilmiş dokular için özellikle zor olabilir (Şekil 3, Şekil 4E ve Şekil 4E iç kısmı). İzlemeye yardımcı olmak için, patolog tarafından çizilen işaretleri izlemek için mürekkepli ince veya ultra ince uçlu bir işaretleyici (Şekil 4E, iç kısım ii) kullanılmalıdır. Etanol mendiller, hataları gidermek ve gerekirse geri izlemeye izin vermek için yararlı olabilir.
4. Şimdi işaretlenmiş deparafinize slayt dokusunu yüzü yukarı bakacak şekilde çevirin ve tümör bölgesinin kenarlarını önceden kesmek için işaretleyicinin çizgisini temiz bir tıraş bıçağının köşesiyle izleyin.
5. Her slaytı sırayla ele alarak, deparafinize slaytları% 3 gliserol çözeltisine batırın. Slaytı yavaşça çıkarmadan önce dokunun tamamen suya batırıldığından emin olun (Şekil 4F).
   NOT: Gliserol daldırmanın amacı, doku toplanmasına yardımcı olmak için dokuyu nemlendirmek, aynı zamanda doku ile toplanan dokunun yerleştirilmesi gereken plastik mikrotüp arasında itmeye neden olabilecek statik yük birikimini azaltmaktır.
6. Fazla gliserol çözeltisini çıkarmak için slaytın arkasını bir mendille yavaşça silin ve slaytı tezgahın üzerine koyun, yüzü aşağı bakacak şekilde silin. Dokuların 1-2 dakika boyunca kısa bir süre hava kurumasına izin verin.
   NOT: Fazla gliserolün ekstraksiyon işlemine taşınması, nükleik asit ekstraksiyonlarının verimini ve kalitesini olumsuz yönde etkileyebilir. Dokular hafif nemli olmalı, ancak toplandığında gözle görülür şekilde ıslak olmamalıdır.
7. İlgilenilen tümör alanının slaytta nerede bulunduğuna bağlı olarak, (a) tümör dokusunu doğrudan toplamak, tıraş bıçağını kullanarak ilgili dokuyu slayttan kazımak / toplamak için kullanmak veya (b) ilgilenilen tümör dokusunu toplamadan önce tümör olmayan dokuyu çıkarmak ve atmak için tıraş bıçağının düz kenarını kullanın (Şekil 3).
   NOT: Toplanan doku bıçağın dibinde toplanma veya yuvarlanma eğilimindedir (Şekil 4G)
8. Toplanan dokuyu bıçaktan çıkarmak için tahta bir çubuk kullanın (Şekil 4H ve iç kısım) ve uygun önceden etiketlenmiş ve önceden doldurulmuş mikrotüpe aktarın (Şekil 4I).
   NOT: Sindirim tamponu, dokuyu tahta toplayıcıdan sıvıya "çekmeye" yarar.
9. Nükleik asit ekstraksiyonuna devam edin.
   NOT: Nükleik asit ekstraksiyonları, üreticinin talimatlarına göre DNA/RNA FFPE ekstraksiyon kiti kullanılarak tamamlandı ve elde edilen nükleik asitler bir UV-vis spektrofotometre kullanılarak ölçüldü. Elde edilen RNA, dijital gen ekspresyon profillemesi tabanlı DLBCL90 testi¹⁶ üzerinde çalıştırıldı.

Toplam 5 Diffüz Büyük B Hücreli Lenfoma (DLBCL) FFPE doku bloğu kesitlendi ve elde edilen kesitler nükleik asit ekstraksiyonundan önce makrodiseke edildi veya yapılmadı. Ekstrakte edilen RNA, DLBCL90 testi16 üzerinde çalıştırıldı. Makrodisseke edilmiş örnekler, bir kez 5 μL RNA stok konsantrasyonu kullanılarak, ancak toplam RNA girişinin 300 ng'den fazla olmaması ve bir kez de disseke edilmemiş muadillerinin RNA girdileriyle eşleşmesi için seyreltilmiş 5 μL RNA stoğu kullanılarak iki kez çalıştırıldı. DLBCL90 sonuçları Tablo 2'de özetlenmiştir.

DLBCL, GCB, ABC ve sınıflandırılmamış veya UNC17,18 olarak bilinen bir ara grup olmak üzere farklı terapötik yanıtlara sahip 3 ayrı orijin hücre (COO) alt tipinden oluşur. MYC, BCL2 ve veya BCL6'yı tek başına veya kombinasyon halinde (çift veya üçlü vuruş) içeren translokasyonlar da DLBCL'de, özellikle GCB alt tipi19'da sıklıkla gözlenir. DLBCL90 testi, selefi Lymph2Cx klinik testinin bir uzantısıdır ve bu nedenle DLBCL COO alt tip belirleme yeteneğine sahiptir, ancak esas olarak, floresan in-situ hibridizasyonuna (FISH) alternatif olarak dijital gen ekspresyonu kullanarak BCL2'yi içeren çift vuruşlu (DH) translokasyonları barındıran örnekleri tanımlamak için geliştirilmiştir 16,20. Tablo 2'deki sonuçlar, makrodiseksiyonun COO veya DHITsig durum çağrılarını değiştirdiğini, incelenen örneklerin% 60'ını (3/5) gerektirdiğini göstermektedir.

A örneğinin makrodiseksiyonunun COO çağrısı üzerinde hiçbir etkisi olmadı, ancak DHITsig çağrısını NEG'den UNCLASS'a değiştirdi ve bu değişiklik makrodiseke edilmiş örnek RNA girişinden bağımsız olarak ve benzer olasılık puanlarıyla gözlendi (0.224, 0.254). Buna karşılık, örnek C'nin makrodiseksiyonunun DHITsig çağrısı üzerinde hiçbir etkisi olmadı, ancak COO çağrısını GCB'den UNC'ye değiştirdi. Yine, bu değişiklik makrodisseke edilmiş örnek RNA girişinden bağımsız olarak gözlenmiştir. Bununla birlikte, 0.117'de, COO çağrı olasılığı, azaltılmış RNA girişi olan makrodisseke edilmiş örnek için 0.1'lik çağrı eşiğine daha yakındı. Örnek A'ya benzer şekilde, örnek E'nin makrodiseksiyonunun COO çağrısı üzerinde hiçbir etkisi olmadı, ancak DHITsig çağrısını değiştirdi. Bununla birlikte, E örneği için çağrı UNCLASS'tan NEG'ye değişti ve bunu makrodisseke edilmiş örnek RNA girişinden bağımsız olarak makul derecede benzer olasılık çağrılarıyla yaptı (0.849, 0.833). Özellikle, DHITsig NEG'deki bu çağrı değişikliği, E örneğinin ABC-DLBCL'ye bulunduğu ve BCL2'yi içeren çift vuruşlu translokasyonların yalnızca GCB-DLBCL19'da gözlemlendiği bildirildiği için biyolojik olarak mantıklıdır.

Şekil 1: Bir mikrotom kullanılarak slayta monte edilmiş doku kesitlerinin oluşturulması . (A) FFPE doku bloğu mikrotom mandren tarafından yerinde tutulur ve sıralı FFPE doku kesitlerinden oluşan bir şerit üretmek için kesilir. (B) Önceden ıslatılmış tahta çubuklar kullanılarak, şerit mikrotomdan toplanır ve ılık su banyosuna aktarılır. (C) Suyun sıcaklığı, doku şeridindeki kırışıklıkların giderilmesine yardımcı olur. (D) Bireysel FFPE doku kesitleri, iki bölümün birleşme noktasına kapalı forseps yerleştirilerek ve bölümleri birbirinden ayıran forsepsleri nazikçe açarak doku şeridinden çıkarılır. (E) Kesitler, bir cam sürgüyü bir açıyla batırarak ve bölümün kenarı cam kızağa değene kadar yan tarafı doku bölümüne doğru yavaşça hareket ettirerek sudan toplanır. (F) Slayt ve bölüm dokunduğunda, slaytı yavaşça sudan çıkarın ve doku bölümünün slayda aynı hizada düşmesini sağlayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Hematoksilin ve eozin (H&E) boyalı kesitlerin patolojisi ve histolojik incelemesi. (A,B) H&E doku kesiti, kurul onaylı bir patolog tarafından mikroskobik incelemeye tabi tutulur. (C,D) Patolog tüm dokuyu inceledikten ve% 100 tümör dokusu olmadığını bulduktan sonra, patolog dokunun tümör alanını çevrelemek için bir belirteç kullanacaktır. (E,F) İşaretli H&E'yi orijinal FFPE doku bloğuna karşı tutmak, tüm dokunun tümör materyali olmadığını gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Doku örnekleri. Bu görüntüde patolojik olarak gözden geçirilmiş ve tümör işaretli H&Es (Sıra 1), işlenmemiş slayda monte FFPE doku kesitleri (Sıra 2), deparafinize slayda monte FFPE doku kesitleri (Sıra 3), slaytın arkasında izlenen patoloji işaretlerine sahip deparafinize slayda monte FFPE doku kesitleri (Sıra 4), bu protokolü göstermek için kullanılan 5 örnek (A-E) için deparafinize edilmiş ve makrodisseke edilmiş slayda monte FFPE doku kesitleri (Sıra 5) gösterilmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: FFPE doku kesitlerinin deparafinizasyonu ve makro-diseksiyonu: (A) Bir duman davlumbazında, bir sürgü rafına monte edilen FFPE dokuları iki d-limonen yıkamada ve bir etanol yıkamada yıkanır. (B,C) Yıkama sonrası, tüm parafin çıkarıldı ve sadece önceden yıkanmış muadillerine kıyasla şimdi beyaz ve oldukça görünür olan slaytta sadece doku kaldı. (D) Deparafinize slayda monte edilmiş doku bölümü, eşleşen işaretli H & E'nin arkasına yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirilir. (E) H & E'deki tümör alanı işaretleri daha sonra ince veya ultra ince uçlu kalıcı bir işaretleyici kullanılarak deparafinize slaytın arkasında izlenir (F) İşaretli deparafinize slayda monte edilmiş doku bölümü daha sonra toplanacak doku bölümünü nemlendirmek için bir gliserol yıkamaya batırılır. Slayt gliserolden yavaşça çıkarılır ve slayt dokusunu tezgahın üzerine yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirmeden önce slaytın arkası fazla gliserolü çıkarmak için bir doku ile silinir. (G) Temiz bir tıraş bıçağının düz tarafı kullanılarak, doku makrodiseke edilir ve patolog işaretlerinin dışındaki istenmeyen doku, bıçağın kenarı boyunca toplanan ilgili doku toplanmadan önce atılır. (H) Toplanan dokuyu bıçağın kenarından çıkarmak için tahta bir çubuk kullanılır. (I) Doku daha sonra önceden etiketlenmiş bir mikrotüp önceden doldurulmuş doku sindirim tamponuna aktarılır ve nükleik asit ekstraksiyonu için hazırdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Patoloji inceleme verileri. Tablo, (a) tüm doku kesitindeki canlı tümörün yüzölçümünü, (b) hücreselliğe göre inceleme sırasında patolog tarafından daire içine alınan/işaretlenen bölgedeki canlı tümör yüzdesini, (c) tüm dokunun tahmini genel tümör hücreselliğini (a x b), (d) makrodiseksiyon ile elde edilen tümör hücreselliğinde tahmini kıvrım artışını, (e ve f) ekstrakte edilen 5 μm lekesiz FFPE slayta monte edilmiş doku kesitlerinin sayısı ve eşleşen makrodisseke edilmemiş ve makrodisseke edilmiş numuneler için elde edilen RNA konsantrasyonları. % Diğer, tümör dokusu olmayan ve bağ dokusu, stromal fibroblastlar, kan damarları ve diğer doğal stromal elementleri içerebilen belirli bir numunede bulunan diğer tüm dokuları ifade eder. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: DLBCL90 dijital gen ekspresyon testi sonuçları. Nükleik asit ekstraksiyonları yapılmadan önce beş örnek (A-E) makrodiseke edilmedi veya makrodiseke edildi. Elde edilen RNA, maksimum RNA giriş hacminin 5 μL olduğu DLBCL90 testinde çalıştırıldı. makrodisseke edilmemiş örnekler 5 μL stok RNA kullanılarak çalıştırıldı. Her makrodisseke edilmiş numune, (a) 60 ng / μL'lik alikotlar mümkün olmadıkça 5 μL stok RNA kullanılarak iki kez çalıştırıldı ve (b) makrodisseke edilmemiş muadillerinin konsantrasyonlarına / girdilerine uyacak şekilde seyreltilmiş 5 μL stok RNA'sı kullanıldı. _M sonek, bu örneğin makrodisseke edildiğini gösterir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.